Name: ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: חקור את מנגנוני התנועה של קונוסי צמיחה נוירוניים באמצעות הדמיית נקודות בודדות ומיקרוסקופיית כוח מתיחה. שיטות אלו מאפשרות ניתוח דינמיקת אקטין וכוחות מכניים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי AMED תחת מענק מספר 21gm0810011h0005 (N.I. ו- Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) ו- JSPS מענקים בסיוע למדענים בתחילת הקריירה (JP19K16258, T.M.), קרן המחקר הרפואי של אוסקה למחלות חשוכות מרפא (T.M.), ופרויקט המחקר הבין-תחומי של הדור הבא של NAIST (י.ש).

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקולים המתוארים במחקר זה משתמשים בחומרים זמינים מסחרית ובציוד מיקרוסקופי שנמצאים באופן שגרתי בכל המעבדות, המכונים והאוניברסיטאות. לכן, חוקרים יכולים לאמץ בקלות את הדמיית כתמים יחיד הנוכחי מיקרוסקופיה כוח המתיחה במחקרים שלהם.
הדמיית כתמים יכולה לנתח פילמור אקטין צימוד מצמד. בנוסף, הדמיית כתמים יכולה לפקח על הזרימה המדרדרת של מולקולות מצמד כגון shootin1 וקורטקטין, אשר אינטראקציה עם זרימת F-actin מדרדרת. באמצעות מיקרוסקופ TIRF, הזרימה המדרדרת של מולקולת הידבקות התא L1-CAM ניתן גם לפקח23,41; L1-CAM עובר התנהגויות אחיזה והחלקת המשקפות את יעילות צימוד המצמד23,41. למרות שהמחקר הנוכחי משתמש במערכת TMR-HaloTag להדמיית כתמים, חלבונים פלואורסצנטיים אחרים, כגון EGFP וחלבון פלואורסצנטי אדום מונומרי, זמינים גם בניתוח16,18,20,23,24,27,39. היסודות להדמיית כתמי אקטין הם רמת ביטוי נמוכה של אקטין פלואורסצנטי והארה של אזור מינימלי (איור 2). בפרוטוקול זה, אותות Lifeact ו- HaloTag-actin נרכשים ברצף. מכיוון שזרימת הנסיגה של actin איטית יחסית (4.5 ± 0.1 מיקרומטר/דקה)24, ניתוח זרימת F-actin מדרדרת ופימור אקטין אינם מושפעים מרכישת תמונה רציפה של ערוצי פלואורסצנטיים שונים (~ מרווח זמן של ~ 1). Lifeact הוא סמן F-actin בשימוש נרחב, אבל יכול להתחרות עם חלבונים מחייבים actin47. בעל חשיבות נוספת, Lifeact יכול לשנות את הדינמיקה actin, ובכך להשפיע על מבני F-actin ואת מורפולוגיה התא47,48,49.
מיקרוסקופיה כוח המתיחה יכול לזהות כוחות כדי להניע התקדמות חרוט צמיחה. על ידי הרכבת הנוירונים בתוך מטריצה חוץ-תאית, החוקרים יכולים גם לנתח כוחות שנוצרו בסביבה תלת-ממדית למחצה11. הדמיה בהגדלה גבוהה חשובה לכימות מדויק של כוח המתיחה מכיוון שקונוסים צמיחה יוצרים כוחות אחיזה חלשים7. למרות שיטות אחרות עם nanopillars או biosensors רגישים ללחץ משמשים גם כדי למדוד כוח המתיחה50,51, שיטה מבוססת ג'ל PAA הוא מותאם מאוד ומאפשר התאמה של קשיחות מצע על ידי שינוי הריכוזים של אקרילאמיד וביס-acrylamide41,44,52. בפרוטוקול זה, ג'ל PAA מוכן בריכוז סופי של 3.75% אקרילאמיד ו 0.03% ביס-אקרילאמיד; מודולוס של יאנג הוא ~ 270 Pa22 ונוקשות זו נמצאת בטווח של רקמת המוח (100-10,000 Pa)53,54,55. בשל עובי ג'ל PAA (~ 100 מיקרומטר), שיטה זו מגבילה את השימוש בעדשות הגדלה גבוהה במהלך מיקרוסקופיה. כדי להשיג תמונות בהגדלה גבוהה, החוקרים צריכים להשתמש בפונקציית הזום במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.
לסיכום, הדמיית כתמים הנוכחית ומיקרוסקופיית כוח המתיחה מאפשרת ניתוחים כמותיים של האירועים המרכזיים בדורות הכוח. מידע זה יהיה יקר ערך לשיפור ההבנה של המנגנונים העומדים בבסיס התקדמות וניווט קונוס הצמיחה.

במוח החולייתי המתפתח, נוירונים עוברים נדידות מאורגנות בקפידה ומקרין אקסונים לעבר שותפים סינפטיים מתאימים כדי להקים רשתות עצביות פונקציונליות1,2,3. קונוסים צמיחה, שהם מבנים חושיים ורגשיים הממוקמים בקצה הנוריטים, קובעים את המהירות והכיוון של הגירה עצבית וצמיחת האקסון 3,4,5. מאחר שתנורות עצב מוקפים בסביבות צפופות, קונוסים לצמיחה חייבים להפעיל כוחות נגד סביבתם כדי להתקדם 6,7. כדי להבין את המנגנונים שבבית הגירה עצבית והדרכה אקסונית, ניתוחים של המכניקה המולקולרית לקידום חרוט צמיחה הם חיוניים.
עשרות שנים של ניתוח גילו כי כוח המתיחה כדי להניע התקדמות חרוט צמיחה נוצר על ידי מנגנון "מצמד"; מנגנון זה נחשב לתפקד לא רק חרוט הצמיחה האקסוני אלא גם קונוס הצמיחה המוביל של נוירונים נודדים8,9,10,11,12. כלומר, חוטי actin (F-actins) בקונוסים צמיחה פילמור בקצה המוביל depolymerize בקרבת מקום, דוחף את הממברנה המובילה13,14,15. הכוח שנוצר, בשילוב עם התכווצות actomyosin, גורמת לתנועה אחורית של F-actins הנקרא זרימה מדרדרת7,11,16,17,18,19,20,21. מולקולות הדבקת מצמד ותאים מתייכות צימוד מכני בין זרימת F-actin מדרדרת לבין המצע הדביק ומעבירות את כוח זרימת F-actin אל המצע, ובכך יוצרות כוח משיכה לקידום חרוט הצמיחה7,8,9,11,12,22 . במקביל, צימוד המצע המעשי מפחית את מהירות זרימת ה-F-actin וממיר פילמור אקטין לכוח כדי לבלוט את הממברנה המובילה9,10.
קונוסים לצמיחה אקסונית חשים רמזים כימיים מקומיים ומעבירים אותם לכוח מניע כיווני לניווט חרוט צמיחה3,23,24,25. לדוגמה, מולקולת הנחיית אקסון netrin-1 מגרה את הקולטן שלה נמחק בסרטן המעי הגס (DCC), ומפעילה את טריפוספט הרו גואנוסין טריפוספט (GTP) מחייב חלבונים חלוקת תאים לשלוט חלבון 42 (Cdc42) וראס הקשורים C3 botulinum רעלן מצע 1 (Rac1), ואת קינאז p21-מופעל במורד הזרם שלהם 1 (Pak1)26. CDC42 ו Rac1 לקדם 1) פילמור אקטין, ו Pak1 זרחן יורה מולקולת מצמד shootin122,26. Shootin1 אינטראקציה עם זרימת מדרדר F-actin באמצעות קורטקטין חלבון מחייב אקטין27. Shootin1 גם אינטראקציה עם מולקולת הידבקות תא L1 (L1-CAM)20,24. זרחן Shootin1 מגביר את הזיקה המחייבת לקורטקטין ו- L1-CAM, ומשפר צימוד מצמד 24,27 בתיווך shootin124,27. בתוך חרוט הצמיחה, הפעלות אסימטריות של פילמור אקטין וצימוד מצמד מגדילות 3) כוח משיכה בצד המקור של netrin-1, ובכך יוצרות כוח מניע כיווני עבור סיבוב חרוט צמיחה (איור 1)24. מחקר אינטנסיבי בעשורים האחרונים בכל הנוגע להנחיית הגירה עצבית ואקסון שיפר את ההבנה של מולקולות הנחיה, הקולטנים שלהן, ומפל איתות במורד הזרם2,10,28,29,30. עם זאת, המכונות המולקולריות כדי ליצור כוחות להתקדמות חרוט צמיחה רק מתחילים להיות מנוכרים; ניתן לייחס זאת לשימוש המוגבל בפרוטוקולים עבור ניתוחים מכנוביולוגיים.
המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול מפורט לניטור זרימת F-actin מדרדרת על ידי הדמיית כתמים יחיד16,18. ניטור זרימת F-actin מדרדרת בוצע בהרחבה באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של הפרעות סה"כ (TIRF)25,31,32,33,34,35,36,37,38 . הפרוטוקול במחקר הנוכחי, לעומת זאת, משתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי סטנדרטי ולכן ניתן לאימוץ בקלות11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. בשילוב עם תיוג F-actin על ידי Lifeact43, הדמיית כתמים יחיד מאפשר כימות של קצב פילמור actin ואת יעילות צימוד מצמד בין זרימת F-actin מדרדר ואת מצע דבק39,42. המחקר הנוכחי מתאר עוד פרוטוקול מפורט של מיקרוסקופיה כוח המתיחה באמצעות ג'ל פוליאקרילמיד מוטבע חרוזים פלואורסצנטי (PAA)11,22,23,24,27,39,41,42,44. שיטה זו מזהה וממתמת כוח משיכה מתחת לקונוס הצמיחה על ידי ניטור תנועות חרוזים הנגרמות בכוח44,45. קוד ניתוח כוח המתיחה בקוד פתוח מסופק, והשיטה לכימות כוח המתיחה במהלך נדידת חרוט הצמיחה מוסברת בפירוט. בעזרת הדמיית כתמים יחיד ומיקרוסקופיית כוח המתיחה, הבנת המכניקה המולקולרית שבבית נדידת חרוט הצמיחה וניווט תקל. טכניקות אלה ישימות גם לניתוח המכניקה המולקולרית שבבקע הגדלת עמוד השדרה הדנדריטי, הידועה כחשובה בלמידה ובזיכרון42.

<table><tbody><tr><td>0.5% תמיסת כתמים כחולים טריפן</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td><td>Sigma</td><td>281778-100ML</td><td></td></tr><tr><td>מונומר אקרילאמיד</td><td>Nacalai</td><td>00809-85</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>Cytiva</td><td>17-1311-1</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי ( הדמיית כתמים בודדים)</td></tr><tr><td>תוסף B-27 (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>אלבמין סרום בקר</td><td>סיגמא</td><td>A7906-10G</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 63x/1.2 W Corr</td><td>Zeiss</td><td>421787-9970-799</td><td>עדשה אובייקטיבית (מיקרוסקופ כוח משיכה)</td></tr><tr><td>Coverslip (קוטר 18 מ"מ)</td><td>Matsunami</td><td></td> C018001-D-glucose <td></td></tr><tr><td></td><td>Nacalai</td><td>16806-25</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>פיג'י</td><td>חבילת תוכנה בקוד פתוח</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>FluoSpheres קרבוקסילט שונה 0.2 מ"מ, אדום (580/605), 2% מוצק</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8810</td><td>קרבוקסילט שונה צלחת</td></tr><tr><td>תחתית זכוכית microspheres (קוטר 14 מ"מ)</td><td>Matsunami</td><td>D1130H</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תחתונה מזכוכית (קוטר 27 מ"מ)</td><td>Matsunami</td><td>D1140H</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת גלוטראלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>G5882-10X10ML</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag TMR ligand</td><td>Promega</td><td>G8251</td><td></td></tr><tr><td>HBO103 W/2</td><td>Osram</td><td>4050300382128</td><td>מנורת כספית (כתם יחיד הדמיה)</td></tr>ארגז <tr><td>כלים לעיבוד תמונה</td><td>MathWork</td><td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת למינין מגידול EHS בעכבר</td><td>Wako</td><td>120-05751</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 בינוני</td><td>תרמו פישר 11415064</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>נקלאי</td><td>16919-42</td><td></td></tr><tr><td>LSM710</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>מיקרוסקופ לייזר קונפורקל (מיקרוסקופ כוח משיכה)</td></tr><tr><td>MATLAB2018a</td><td>MathWork</td><td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td><td></td></tr><tr><td>עכבר C57BL/6</td><td>יפן SLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ערכת נוקלאופקטור נוירונים של עכבר</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Nacalai</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-methylenebisacrylamide</td><td>Nacalai</td><td>22402-02</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נוירו-בזאלי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector I</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001</td><td>מכשיר אלקטרופורציה</td></tr><tr><td>ORCA פלאש 4.0 V2</td><td></td><td>מצלמת CMOS (הדמיית כתמים בודדים)</td><td></td></tr> <tr><td>Papain</td><td>Nacalai</td><td>26036-34</td><td></td></tr><tr><td>ארגז כלים למחשוב מקביל</td><td>MathWork</td><td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>1528177</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (100x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>pFN21A-HaloTag-actin</td><td>(Minegishi et al., 2018)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) pH 7.4 (פי 10)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil</td><td>Zeiss</td><td>420790-9901-000</td><td>עדשת אובייקטיבית (הדמיית כתמים בודדים)</td></tr><tr><td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td><td>(Kastian et al., 2021)</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין הידרוברומיד</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Slulfo-SAMPHA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>Nacalai</td><td>08933-05</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרט (NaOH)</td> <td>Nacalai</td><td>31511-05</td><td></td></tr><tr><td>כדור פלדה</td><td>Sako tekkou</td><td>N/A</td><td>Microshpere לקביעת קשיחות ג'ל PAA. קוטר 0.6 מ"מ, 7.87 גרם/ס"מ3.</td></tr><tr><td>ZEN2009</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td><td>תוכנת רכישת תמונות (מיקרוסקופ כוח משיכה)</td></tr><tr><td>ZEN2012</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td><td>תוכנת רכישת תמונות (הדמיית כתם בודד)</td></tr></tbody></table>

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

כדי ליצור רשתות פונקציונליות, נוירונים חייבים לעבור ליעדים המתאימים שלהם ולאחר מכן להרחיב אקסונים לכיוון תאי היעד שלהם. תהליכים אלה תלויים בהתקדמות של קונוסים צמיחה הממוקמים בקצות הנוריטים. קונוסים לצמיחה אקסונית מייצרים כוחות מניעים על ידי חישת המיקרו-סביבה המקומית שלהם ואפנת הדינמיקה של הציטוסד וצימוך הידבקות אקטין (צימוד מצמד). עשרות שנים של מחקר הובילו לזיהוי מולקולות הדרכה, הקולטנים שלהן, ומפלי איתות במורד הזרם לוויסות הגירה עצבית והדרכה אקסונית; עם זאת, המכונות המולקולריות הנדרשות ליצירת כוחות כדי להניע התקדמות חרוט צמיחה וניווט רק מתחילים להיות מנוכרים. בקצה המוביל של קונוסים צמיחה עצביים, חוטי actin לעבור זרימה מדרדרת, אשר מופעל על ידי אקטין פילמור והתכווצות actomyosin. צימוד מצמד בין זרימת F-actin מדרדרת ומצע דבק מייצר כוחות אחיזה להתקדמות חרוט צמיחה. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול מפורט לניטור זרימת F-actin מדרדרת על ידי הדמיית כתמים יחיד. חשוב לציין, בשילוב עם סמן F-actin Lifeact, טכניקה זו יכולה לכמת 1) את קצב פילמור F-actin ו 2) את יעילות צימוד המצמד בין זרימת F-actin מדרדרת ואת המצע דבק. שניהם משתנים קריטיים ליצירת כוחות להתקדמות ולניווט חרוט הצמיחה. בנוסף, המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול מפורט של מיקרוסקופיית כוח המתיחה, אשר יכול לכמת 3) כוח המתיחה שנוצר על ידי קונוסים צמיחה. לכן, על ידי צימוד הניתוחים של הדמיה כתמים יחיד מיקרוסקופיה כוח המתיחה, החוקרים יכולים לפקח על המכניקה המולקולרית שבביס קונוס הצמיחה מראש וניווט.

הדמיית כתמים יחיד לכימות קצב פילמור אקטין ויעילות צימוד מצמד ביטוי Lifeact גבוה מאפשר הדמיה F-actin בתוך חרוט הצמיחה; ביטוי HaloTag-actin נמוך מאפשר ניטור של זרימת F-actin מדרדרת (איור 3, קובץ משלים 2). מעקב אחר כתמי האקטין מאפשר מדידה של מהירות זרימת F-actin (איור 3C,D). מכיוון שהצימוד המכני של זרימת F-actin מדרדרת והמצע הדבק מפחית את מהירות זרימת F-actin, ניתן להעריך את יעילות צימוד המצמד מהמהירות. יתר על כן, תיוג F-actin עם Lifeact מסייע להדמיה של הרחבת F-actin והוא שימושי לכימות קצב פילמור אקטין (איור 3E,F).
ניתוח כמותי של כוח המתיחה הקפדה על המתודולוגיה המוצגת כאן תחשוף את תנועותיהם של חרוזי פלואורסצנטיות מתחת לקונוס הצמיחה (איור 6C, קובץ משלים 4). זרימת מדרדר F-actin על המצע מייצר כוח משיכה גורם חרוזים פלואורסצנטי לנוע לאחור תחת חרוט הצמיחה. קוד ניתוח כוח המתיחה מעריך כוח משיכה מפני תזוזת חרוזים פלואורסצנטית, ומבטא את כוח המתיחה המחושב כווקטור כוח. הכיוון והגודל של כוח המתיחה נקבעים מרכיבי x ו- y של וקטור הכוח (איור 8C, D). התיבה האדומה באיור 8D מייצגת את רכיבי ה- x וה- y של וקטור כוח; איור 8C מתאר את חרוט הצמיחה המתאים. במונחים של קואורדינטות x-y, הווקטור מצביע על -93.8° מול ציר ה- x; אוריינטציה זו מכוונת לחלקו האחורי של חרוט הצמיחה (איור 8C). גודל כוח המתיחה F חושב באופן הבא:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63227/63227eq02.jpg">
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig01.jpg"> איור 1: מכונות קונוס צמיחה ליצירת כוח וניווט חרוט צמיחה. שיפוע כימותרפי netrin-1 מעורר גירוי אסימטרי של הקולטן שלו DCC על חרוט גדילה אקסוני. זה מפעיל Rac1 ו- CDC42, ואת קינאז Pak1 במורד הזרם שלהם. Rac1 ו- Cdc42 מקדמים (1) פילמור אקטין, בעוד Pak1 זרחן shootin1, שיפור צימוד מצמד 1-בתיווך shootin1(2). ההפעלה האסימטרית של דינמיקת actin ואת צימוד המצמד בתוך חרוט הצמיחה מגביר (3) כוח המתיחה בצד של המקור netrin-1, ובכך יוצר כוח מניע כיווני למשיכה קונוס צמיחה. הפרוטוקולים המוצגים כאן מאפשרים כימות של משתני המפתח (1)-(3) לניווט חרוט צמיחה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig02.jpg"> איור 2: תמונות פלואורסצנטיות של חרוט גדילה עצבי תחת דיאפרגמה פתוחה וצרה לחלוטין. קונוס הצמיחה מבטא את Lifeact ו- HaloTag-actin. (א) ביטוי Lifeact גבוה מאפשר הדמיה של מורפולוגיה קונוס צמיחה. מצד שני, רמות הביטוי HaloTag-actin נמוכות מאוד, עם אותות עמומים כאשר הסרעפת נפתחת במלואה. (B) כאשר הסרעפת מצטמצמת כראוי, אותות הרקע פוחתים, ונוהמי אקטין בודדים מופיעים בקונוס הצמיחה. סרגלי קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2.jpg"> איור 3: שלבים לכימות מהירות זרימת F-actin וקצב פילמור אקטין באמצעות תוכנת עיבוד וניתוח תמונה פיג'י. (A) התאם את זווית התמונה לניתוח. (1) חפש ובחר כתם אקטן (ראש חץ) הזורם בחבילת F-actin. (2) בחר תמונה &gt; שינוי צורה &gt; סיבוב. (3) הגדר את הזווית כך שחבילה F-actin תכוון כלפי מעלה. (4) זווית התמונה תשתנה. (ב) לתאר את האזור, כולל כתם אקטין ואת חבילת F-actin. (1) לחץ על מלבן בסרגל הכלים. (2) תיווג אזור בתמונה. הבהירות והחדות של התמונה גדלות כדי לאפשר הדמיה ברורה של כתמי actin ואת קצה חבילת F-actin. (3) בחר תמונה &gt; כפול. (4) הזן את חמש מסגרות הזמן המציגות זרימת כתמי אקטין בחבילת F-actin. (5) תמונת המחסנית שנבחרה תופיע על המסך. (ג) עיגולי כיסוי על כתם המעשה. (1) לחץ על אליפסה בסרגל הכלים. (2) צייר עיגול על כתם אקטין. (3) בחר שכבת-על &gt; תמונה &gt; הוסף בחירה. (4) העיגול מכוסה. 5) חזור על הנחת העיגולים על כתמי המעשה הנותרים. (ד) למדוד את מרחק ההקצאה של כתמי אקטין במהלך חמש מסגרות הזמן. (1) לחץ על ישר בסרגל הכלים. (2) צייר קו המקשר בין מרכזי העיגולים. (3) בחר ניתוח &gt; מידה. התוצאה, המצוינת על-ידי הפרמטר Height (תיבה אדומה), מעבירה את מרחק ההקצאה של כתמי actin. (ה) למדוד את השינוי באורך בליטת F-actin במהלך חמש מסגרות הזמן. (1) צייר קו המקשר בין קצות בליטות F-actin. (2) בחר ניתוח &gt; מידה. התוצאה (תיבה אדומה), גובה, מציינת את אורך ההרחבה של חבילת F-actin. (ו) קצב פילמור actin מחושב מסכום מהירות זרימת F-actin וקצב ההרחבה. ראה גם קובץ משלים 2. קובץ משלים 3 מסייע לחוקרים לתרגל את המתודולוגיה המתוארת לעיל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig04.jpg"> איור 4: צעדים להכנת ג'ל PAA. אנא עיון בשלב 7.1 לקבלת תיאור מפורט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig05.jpg"> איור 5: קביעת קשיחות ג'ל PAA. (A) שיטת כניסה מיקרוספירית. כאשר מיקרוספירה ממוקמת על ג'ל PAA מוטבע חרוזים פלואורסצנטי, המשקל של המיקרוספירה גורם כניסה בג'ל. עומק הכניסה מחושב על ידי חיסור מיקומי z של משטח ג'ל PAA מתחתית תמונות הפלואורסצנטיות של מיקרוספירה (B,C) פלואורסצנטיות של ג'ל PAA המוכנס פנימה על ידי מיקרוספירה ומכיל חרוזים פלואורסצנטיים. מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר שימש ללכידת תמונות של משטח הג'ל (B) ותחתון המיקרוספירה (C). אותות מהחרוזים הפלואורסצנטיים אינם נראים במשטח הג'ל באזור הכניסה (B, circle). הם יכולים, עם זאת, להיות נצפו בתחתית המיקרוספירה. סרגלי קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig06.jpg"> איור 6: מיפוי כוח של חרוט גדילה עצבי. (א-ג) תמונות פלואורסצנטיות של חרוזים המוטמעים בג'ל PAA וקונוס צמיחה עצבי המודגם עם EGFP. לאחר רכישת תמונות זמן לשגות (A), הנוירון שוחרר ממצע הג'ל על ידי החלת פתרון SDS, ותמונה של החרוזים במצע לא מאומן נלכדה (B). (ג) תמונת החרוזים במצע הלא מאומן מראה את החרוזים בתנוחותיהם המקוריות (הירוקות) והעקורות (האדומות). אות EGFP של חרוט הצמיחה מוצג בכחול. קימאוגרפיות (מימין) מציגות את תנועות החרוזים במרווחי זמן של 3 שניות למשך 147 שניות, המצוינות על ידי החצים באזורים בקופסה 1 ו- 2. החרוז באזור 2 הוא חרוז התייחסות. סרגלי קנה מידה: 2 מיקרומטר עבור (A), (B) ו-(C, משמאל) ו- 1 מיקרומטר עבור (C, אמצע). ראה גם קובץ משלים 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig07.jpg"> איור 7: שלבים לתיקון מיקום x-y של תמונת החרוזים במצע לא מאומן באמצעות פיג'י. (A) משרשרים את תמונת החרוזים במצע לא מאומן עם תמונת הערימה של חרוזי הפלורסצנט. (1) בחר &gt; תמונות ערימות &gt; כלים &gt; מכנסים. (2) בחר את תמונת החרוזים במצע לא מאומן ואת תמונת הערימה של חרוזים פלואורסצנטיים ב- Image1 ו- Image2, בהתאמה. לחץ על אישור. (3) תמונת החרוזים במצע הלא מאומן מתווספת לתמונת הערימה של זמן-זמן. (B) תקן את מיקום ה- x-y של תמונת החרוזים הפלואורסצנטית. (1) השתמש בפס הגלילה (מסגרת אדומה) כדי לבחור את המסגרת השניה (חץ אדום) בערימת התמונות. (2) בחר תוספים &gt; StackReg. (3) בחר גוף קשיח מהרשימה הנפתחת (מסגרת אדומה) ולחץ על אישור. התיקון של מיקום x-y יתחיל. (ג) שמור את תמונת החרוזים המתוקנת במיקום x-y. לאחר בחירת המסגרת הראשונה של תמונת המחסנית המתוקנת במיקום x-y, (1) בחר תמונה &gt; שכפל. (2) הזן 1 לטווח וביטול הבחירה בערימה כפולה. לאחר מכן לחץ על אישור. (3) תמונת החרוזים המתוקנת במיקום x-y במצע הלא מאומן תופיע על המסך. שמור תמונה זו כקובץ tiff. קובץ משלים 6 מסייע לחוקרים לתרגל את המתודולוגיה המתוארת לעיל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig08.jpg"> איור 8: ניתוח כוח המתיחה מתחת לקונוס גדילה עצבי באמצעות קוד ניתוח כוח המתיחה בקוד פתוח. (A) GUI לניתוח כוח המתיחה. ניתן לאשר תמונות של זמן לשגות ב- GUI מהרשימה הנפתחת ועם המחוון המצוין (תיבה אדומה). (B) בחר אזור הכולל את חרוט הצמיחה. (1) לחץ על ROI על GUI. באמצעות סמן העכבר, ציין שתי נקודות (ראשי חץ) בתמונת התא. (2) תיבה אדומה תופיע בתמונת התא. שתי לחיצות קובעות את מיקומן של שתי פינות. (ג) בחר את החרוזים שזוהו (נקודות לבנות) מתחת לקונוס הצמיחה. (1) ב- GUI, לחץ על בחר חרוזים ותיחום אזור מצולע הכולל את חרוט הצמיחה על-ידי לחיצה. הקש על מקש Enter . (2) הנקודות הלבנות בתוך אזור המצולעים ישתנו לצבע אדום. (ד) תוצאות מחושבות של הכיוון והגודל של כוח המתיחה. התיבה האדומה בגיליון האלקטרוני מייצגת את רכיבי ה- x וה- y של וקטור הכוח, המוערך על-ידי ניתוח כוח המתיחה. בקואורדינטת x-y בחלונית הימנית, וקטור הכוח שנוצר על-ידי חרוט הצמיחה מצביע על -93.8° מול ציר ה-x; אוריינטציה זו מכוונת לחלקו האחורי של חרוט הצמיחה (C). קובץ משלים 6 מסייע לחוקרים לתרגל את המתודולוגיה המתוארת לעיל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1: מתכונים של פתרונות ומדיה המשמשים במחקר זה. עיין בטקסט לשימוש מפורט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%201-63227R1.xlsx" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: הדמיית פלואורסצנטיות של Lifeact והדמיה כתמים פלואורסצנטיים של HaloTag-actin בקונוס צמיחה עצבי. Lifeact (ירוק) ו HaloTag-actin (מגנטה). התמונות נרכשו כל 3 שניות למשך כולל של 147 שניות. סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר. ראה גם איור 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%202.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 3: נתוני תרגול לכימות מהירות זרימת F-actin וקצב פילמור actin. תמונת ערימה רב-ערוצית של Lifeact (ירוק) ו-HaloTag-actin (מגנטה). ראו גם איור 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/Supplemental%20file%203.zip" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 4: וידאו מיפוי כוח זיהוי כוח המתיחה בקונוס גדילה עצבי. העמדות המקוריות (הירוקות) והעקורות (האדומות) של החרוזים. אות EGFP בקונוס הצמיחה מוצג בכחול. התמונות נרכשו כל 3 s עבור 147 s. סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר. ראו גם איור 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%204.mp4" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 5: קוד ניתוח כוח המתיחה. אנא עיון בשלב 8.12 לשימוש מפורט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%205.zip" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 6: תרגול נתונים לכימות כוח המתיחה. תמונת RGB חד-ערוצית של החרוזים במצע לא מאומן ותמונות RGB של חרוזים פלואורסצנטיים בעלי ערוץ יחיד תחת חרוט גדילה, EGFP ושדה בהיר. ראו גם איורים 7 ו-8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%206.zip" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

כדי להתקדם, קונוסים צמיחה חייבים להפעיל כוחות משיכה נגד הסביבה החיצונית. דור כוחות המתיחה תלוי בדינמיקת אקטין ובצימוד מצמד. המחקר הנוכחי מתאר שיטות לניתוח דינמיקת אקטין, צימוד מצמד וכוחות משיכה להתקדמות חרוט הצמיחה.

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

ניתוח צימוד של הדמיית כתמים יחיד כוח המתיחה מיקרוסקופי יכול לנתח מכונות מולקולריות עבור התקדמות חרוט צמיחה וניווט. כמו הטכניקות להשתמש בחומרים זמינים מסחרית מיקרוסקופים סטנדרטיים. חוקרים יכולים פשוטו כמשמעו להסתגל לטכניקות במחקריהם.התחל על ידי טיפול הנוירונים עם tetramethyl-רודמין או ליגנד TMR בדילול של אחד עד 2000 במדיום תרבות ביום במבחנה 3. ואז לשמור על הנוירונים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, לשטוף את ליגנד TMR שלוש פעמים עם PBS מחומם מראש.הסר PBS לפני הוספת 0.5 מיליליטר של בינוני L-15 של ליבוביץ מחומם לתוך הנוירונים. לשמור על הנוירונים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, הפעל מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי והגדר את החממה העליונה של המדינה ל -37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן מניחים את הנוירונים שטופלו בליגנד TMR בצלחת התחתונה של הזכוכית על החממה העליונה של הבמה החמה. הגדר את הפרמטרים של רכישת תמונה כגון זמן חשיפה ב- 500 אלפיות השניה עבור ערוצי פלואורסצנטיות Lifeact ו- HaloTag-actin ו- binning כ- 0.065 מיקרון על 0.065 מיקרון לפיקסל במרווח זמן של שלוש שניות עבור 50 פריימים. לאחר בחירת קונוס צמיחה המבטאת בחוזקה את Lifeact ומבטאת מדי שבוע את HaloTag-actin.סגור את השדה על הסרעפת כדי להאיר אזור מינימלי הכולל את חרוט הצמיחה ולרכוש תמונות לשגות זמן. ביום במבחנה 3, להחליף את המדיום התרבותי עם 0.5 מיליליטר של בינוני L-15 של ליבוביץ ולשמור על הנוירונים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. למיקרוסקופיה של כוח המתיחה, הפעל מיקרוסקופ קונפוקל סורק לייזר והגדר את החממה העליונה של הבמה ל-37 מעלות צלזיוס.מניחים את הנוירונים על צלחת התחתונה של הזכוכית על האינקובטור העליון של הבמה הזהיר מראש. הגדר את הפרמטרים של רכישת התמונה כמתואר בכתב התפריט ובחר חרוט צמיחה המבטא בחום חלבון פלואורסצנטיות ירוק משופר או EGFP. התמקדו במשטח הג'ל ורכשו תמונות של זמן לשגות.בסיום השימוש בתוכנת עיבוד תמונה להפקת ערימות תמונת RGB של ערוץ יחיד. לאחר מכן שמור את התמונות כקבצי tiff. לאחר מכן, להחיל 100 microliters של 10% משקל על ידי נפח נתרן דודציל סולפט או SDS מומס במים מזוקקים לצלחת התחתונה זכוכית כדי להירגע מצע הג'ל על ידי שחרור נוירונים מן המצע.לאחר מכן לדגור על המנה באינקובטור העליון שלב במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לייצב את הטמפרטורה. במיקרוסקופ הקונפוקלי של סריקת הלייזר, התמקדו במשטח הג'ל כדי להשיג תמונה של החרוזים במצע הלא מאומן. הפק תמונת RGB של ערוץ יחיד של החרוזים במצע הלא מאומן ושמור תמונה זו כקובץ tiff.הורד את קוד ניתוח כוח המתיחה TFM2021 ופתח את TFM2021 ב- MATLAB. פתח ראשי. m ב TFM2021 ולהפעיל אותו.כאשר ממשק משתמש גרפי מופיע על המסך. לחצו על טען תמונת מצע לא מאומנת ובחרו בתמונת החרוזים המתוקנת של מיקום X-Y במצע הלא מאומן. עבור לטעינת תמונות חרוזים פלואורסצנטיות ובחר את ערימת חרוזי התמונה.לאחר מכן לחץ על טען תמונות של שדות בהירים כדי לבחור את תמונת הערימה של שדה בהיר בזמן ולהשתמש בטעינת תמונות GFP כדי לבחור את תמונת הערימה של EGFP. מהרשימה הנפתחת בממשק המשתמש הגרפי, בחר GFP לפני לחיצה על החזר על החזר על תנאי כדי לציין את אזור המלבן של עניין, כולל חרוט הצמיחה, על ידי לחיצה על שתי נקודות בתמונת התא המוצגת. לאחר סיום לחץ על כפתור השמירה בממשק המשתמש הגרפי כדי לשמור את תמונות המחסנית שנבחרו יחד עם ה- ROI בקובץ מחצלת.לאחר מכן, לחץ על זיהוי נקודתי והזן ערך רצוי בתיבת הדו-שיח כדי לקבוע סף לזיהוי חרוזים. הכה בסדר כדי להתחיל את החישוב. לאחר סיום החישוב, לחץ על רצועת התוויה כדי להגדיל את האזור שנבחר קודם לכן ולהציג את החרוזים שזוהו כנקודות לבנות.השתמש בחרוזים נבחרים כדי לתעד אזור מצולע הכולל את הנקודות הנכונות מתחת לקונוס הצמיחה. לאחר מכן על-ידי לחיצה על Enter בלוח המקשים, הנקודות הלבנות בתוך האזור המצולע ישתנו לאדום. לחץ על כוח הערכה בממשק המשתמש הגרפי.לאחר מכן ערכי קלט עבור גודל הפיקסלים ומודולוס של יאנג כפי שמוסבר בכתב היד. שים את הערך עבור היחס של פואסון כ- 0.3 ובצע כוח הערכה כדי ליזום את החישוב. התוכנה תשמור את תוצאות החישוב בקובץ תבנית גיליון אלקטרוני.תמונות הפלואורסצנטיות של חרוט גדילה עצבי הראו ביטוי Lifeact גבוה המאפשר הדמיה של מורפולוגיה חרוט צמיחה תחת דיאפרגמה פתוחה וצרה לחלוטין. רמות הביטוי HaloTag-actin היו נמוכות מאוד עם אותות עמומים. כאשר הסרעפת מצטמצמת כראוי, אותות הרקע פוחתים ופעולה אחת בכתמים מופיעה בקונוס הצמיחה.חוקרים אשר כראוי להשיג את כל השלבים יצפה F-actin זרימה מדרדרת בקונוס הצמיחה. הנוקשות של ג'ל polyacrylamide נקבעה על ידי חישוב עומק הכניסה שנגרמה בשל המשקל של המיקרוספירה. מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר שימש ללכידת תמונות של משטח הג'ל ותחתית המיקרוספירה.האותות של החרוזים הפלואורסצנטיים לא נראו על משטח הג'ל באזור הכניסה. תמונות פלואורסצנטיות של החרוזים המוטמעים בג'ל הפוליאקרילמיד וחרוט הצמיחה העצבי, הראו את החרוזים במקורם ואת עמדותיהם שנעקרו. אות EGFP של חרוט הצמיחה נצפה גם.הקימאוגרפים הציגו את תנועות החרוז בהשוואה לחרוז התייחסות. בעת ביצוע הדמיית כתמים אחת, דברים חשובים לבחירת נוירון כי שבועי מבטא כיצד לפעול תחת שני אזור מינימלי. בעת ביצוע מיקרוסקופיה כוח המתיחה, הדמיית הגדלה גבוהה חשובה לריכוז מדויק של כוח המתיחה.

analyses-actin-dynamics-clutch-coupling-traction-force-for-growth

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה לחזות ולכמת F-אקטין מסתיים דוקרני קונוסים הצמיחה העצבית מתוארת. לאחר נוירונים culturing על coverslips זכוכית, תאים permeabilized עם פתרון saponin המכילים. ואז, דגירה קצר עם למאגר saponin המכיל rhodamine-אקטין משלבת אקטין פלואורסצנטי על קצות אקטין חינם תיל.

סימון ה-F-אקטין מסתיים דוקרני עם אקטין Rhodamine ב Permeabilized קונוסים הצמיחה העצבית

קשיחות מכאנית במייקרו-הסביבה של הגידול ממלא תפקיד מכריע בהתנהגות נהיגה ממארת על ידי הגדלת פעילות invadopodia וactomyosin התכווצות. ג'לים באמצעות polyacrylamide (PaaS), יכולים להיות מנוצלים מבחני invadopodia וכוח המתיחה ללמוד את המאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן בתגובה למטריצת קשיחות.

ג&#39;לים polyacrylamide לInvadopodia וגרירת חיל מבחני בתאי הסרטן

אנו מציגים פתרון תוכנה למעקב חצי אוטומטי של ריכוז חלבון יחסי לאורך של בליטות תאיות דינמיות.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים הניסיוניים של בדיקה מתפשטת של תא המבוססת על מיקרוסקופיה של תאים חיים. אנו מספקים כלי חישובי קוד פתוח עבור פילוח משוחד של תאים בעלי תווית פלואורסצנטית וניתוח כמותי של דינמיקת lamellipodia במהלך התפשטות התא.

ניתוח כמותי של דינמיקת קצה התא במהלך הפצת תאים

מוצג כאן פרוטוקול מקיף לביצוע ניסויים מהירים במיוחד במהדק כוח על מנועי מיוזין-5 תהליכיים, שניתן להרחיב בקלות לחקר סוגים אחרים של מנועים תהליכיים. הפרוטוקול מפרט את כל השלבים הדרושים, החל מהקמת מנגנון הניסוי ועד להכנת הדגימה, רכישת הנתונים וניתוחם.

ניתוח תכונות מכנואנזימטיות של מיוסינים תהליכיים באמצעות ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהירה במיוחד

ערכת הכלים האינטגרטיבית לניתוח אותות סלולריים (iTACS) הופכת את התהליך של מדידה בו זמנית של מגוון רחב של אותות כימיים ומכאניים בתאים דבקים. iTACS נועדה להקל על פיתוח מונחה קהילה ולאפשר לחוקרים להשתמש בכל תכונות הפלטפורמה ללא קשר לרקע החינוכי שלהם.

ערכת כלים אינטגרטיבית לניתוח אותות תאיים: כוחות, תנועה, מורפולוגיה ופלואורסצנטיות

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשחזור צרורות מיקרוטובולים במבחנה וכימות ישיר של הכוחות המופעלים בתוכם באמצעות השמנה אופטית סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. בדיקה זו מאפשרת מדידה ברמה ננומטרית של הכוחות והתזוזות הנוצרים על ידי הרכבי חלבונים בתוך רשתות מיקרוטובולים פעילות.

מדידה ישירה של כוחות בתוך צרורות מיקרוטובולים פעילים משוחזרים

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

מאמר זה מציג פרוטוקולים להנדסה ולאפיון רשתות תלת-ממדיות מרוכבות הניתנות לכוונון של חוטי אקטין ומיקרו-טובולים המסתבכים. חומרים מרוכבים עוברים ארגון מחדש אקטיבי ותנועה בליסטית, מונעים על ידי מנועי מיוזין II וקינסין, ומכוונים על ידי הריכוזים היחסיים של אקטין, מיקרוטובולים, חלבונים מוטוריים וקרוסלינקרים פסיביים.

שחזור ואפיון מרוכבים של אקטין-מיקרוטובול עם דינמיקה ומכניקה מונעות מנוע ניתנות לכוונון

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר כוכבי שביט אקטין על פני השטח של חרוזים תוך שימוש ברכיבי חלבון זמינים מסחרית. מערכות כאלה מחקות את המבנים הבולטים הנמצאים בתאים, וניתן להשתמש בהן כדי לבחון מנגנונים פיזיולוגיים של ייצור כוח בצורה פשוטה.

שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

חקור את מנגנוני התנועה של קונוסי צמיחה נוירוניים באמצעות הדמיית נקודות בודדות ומיקרוסקופיית כוח מתיחה. שיטות אלו מאפשרות ניתוח דינמיקת אקטין וכוחות מכניים בזמן אמת.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

גלה סרטונים נוספים