ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

ניתוח צימוד של הדמיית כתמים יחיד כוח המתיחה מיקרוסקופי יכול לנתח מכונות מולקולריות עבור התקדמות חרוט צמיחה וניווט. כמו הטכניקות להשתמש בחומרים זמינים מסחרית מיקרוסקופים סטנדרטיים. חוקרים יכולים פשוטו כמשמעו להסתגל לטכניקות במחקריהם.

התחל על ידי טיפול הנוירונים עם tetramethyl-רודמין או ליגנד TMR בדילול של אחד עד 2000 במדיום תרבות ביום במבחנה 3. ואז לשמור על הנוירונים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, לשטוף את ליגנד TMR שלוש פעמים עם PBS מחומם מראש.

הסר PBS לפני הוספת 0.5 מיליליטר של בינוני L-15 של ליבוביץ מחומם לתוך הנוירונים. לשמור על הנוירונים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, הפעל מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי והגדר את החממה העליונה של המדינה ל -37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן מניחים את הנוירונים שטופלו בליגנד TMR בצלחת התחתונה של הזכוכית על החממה העליונה של הבמה החמה. הגדר את הפרמטרים של רכישת תמונה כגון זמן חשיפה ב- 500 אלפיות השניה עבור ערוצי פלואורסצנטיות Lifeact ו- HaloTag-actin ו- binning כ- 0.065 מיקרון על 0.065 מיקרון לפיקסל במרווח זמן של שלוש שניות עבור 50 פריימים. לאחר בחירת קונוס צמיחה המבטאת בחוזקה את Lifeact ומבטאת מדי שבוע את HaloTag-actin.

סגור את השדה על הסרעפת כדי להאיר אזור מינימלי הכולל את חרוט הצמיחה ולרכוש תמונות לשגות זמן. ביום במבחנה 3, להחליף את המדיום התרבותי עם 0.5 מיליליטר של בינוני L-15 של ליבוביץ ולשמור על הנוירונים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. למיקרוסקופיה של כוח המתיחה, הפעל מיקרוסקופ קונפוקל סורק לייזר והגדר את החממה העליונה של הבמה ל-37 מעלות צלזיוס.

מניחים את הנוירונים על צלחת התחתונה של הזכוכית על האינקובטור העליון של הבמה הזהיר מראש. הגדר את הפרמטרים של רכישת התמונה כמתואר בכתב התפריט ובחר חרוט צמיחה המבטא בחום חלבון פלואורסצנטיות ירוק משופר או EGFP. התמקדו במשטח הג'ל ורכשו תמונות של זמן לשגות.

בסיום השימוש בתוכנת עיבוד תמונה להפקת ערימות תמונת RGB של ערוץ יחיד. לאחר מכן שמור את התמונות כקבצי tiff. לאחר מכן, להחיל 100 microliters של 10% משקל על ידי נפח נתרן דודציל סולפט או SDS מומס במים מזוקקים לצלחת התחתונה זכוכית כדי להירגע מצע הג'ל על ידי שחרור נוירונים מן המצע.

לאחר מכן לדגור על המנה באינקובטור העליון שלב במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לייצב את הטמפרטורה. במיקרוסקופ הקונפוקלי של סריקת הלייזר, התמקדו במשטח הג'ל כדי להשיג תמונה של החרוזים במצע הלא מאומן. הפק תמונת RGB של ערוץ יחיד של החרוזים במצע הלא מאומן ושמור תמונה זו כקובץ tiff.

הורד את קוד ניתוח כוח המתיחה TFM2021 ופתח את TFM2021 ב- MATLAB. פתח ראשי. m ב TFM2021 ולהפעיל אותו.

כאשר ממשק משתמש גרפי מופיע על המסך. לחצו על טען תמונת מצע לא מאומנת ובחרו בתמונת החרוזים המתוקנת של מיקום X-Y במצע הלא מאומן. עבור לטעינת תמונות חרוזים פלואורסצנטיות ובחר את ערימת חרוזי התמונה.

לאחר מכן לחץ על טען תמונות של שדות בהירים כדי לבחור את תמונת הערימה של שדה בהיר בזמן ולהשתמש בטעינת תמונות GFP כדי לבחור את תמונת הערימה של EGFP. מהרשימה הנפתחת בממשק המשתמש הגרפי, בחר GFP לפני לחיצה על החזר על החזר על תנאי כדי לציין את אזור המלבן של עניין, כולל חרוט הצמיחה, על ידי לחיצה על שתי נקודות בתמונת התא המוצגת. לאחר סיום לחץ על כפתור השמירה בממשק המשתמש הגרפי כדי לשמור את תמונות המחסנית שנבחרו יחד עם ה- ROI בקובץ מחצלת.

לאחר מכן, לחץ על זיהוי נקודתי והזן ערך רצוי בתיבת הדו-שיח כדי לקבוע סף לזיהוי חרוזים. הכה בסדר כדי להתחיל את החישוב. לאחר סיום החישוב, לחץ על רצועת התוויה כדי להגדיל את האזור שנבחר קודם לכן ולהציג את החרוזים שזוהו כנקודות לבנות.

השתמש בחרוזים נבחרים כדי לתעד אזור מצולע הכולל את הנקודות הנכונות מתחת לקונוס הצמיחה. לאחר מכן על-ידי לחיצה על Enter בלוח המקשים, הנקודות הלבנות בתוך האזור המצולע ישתנו לאדום. לחץ על כוח הערכה בממשק המשתמש הגרפי.

לאחר מכן ערכי קלט עבור גודל הפיקסלים ומודולוס של יאנג כפי שמוסבר בכתב היד. שים את הערך עבור היחס של פואסון כ- 0.3 ובצע כוח הערכה כדי ליזום את החישוב. התוכנה תשמור את תוצאות החישוב בקובץ תבנית גיליון אלקטרוני.

תמונות הפלואורסצנטיות של חרוט גדילה עצבי הראו ביטוי Lifeact גבוה המאפשר הדמיה של מורפולוגיה חרוט צמיחה תחת דיאפרגמה פתוחה וצרה לחלוטין. רמות הביטוי HaloTag-actin היו נמוכות מאוד עם אותות עמומים. כאשר הסרעפת מצטמצמת כראוי, אותות הרקע פוחתים ופעולה אחת בכתמים מופיעה בקונוס הצמיחה.

חוקרים אשר כראוי להשיג את כל השלבים יצפה F-actin זרימה מדרדרת בקונוס הצמיחה. הנוקשות של ג'ל polyacrylamide נקבעה על ידי חישוב עומק הכניסה שנגרמה בשל המשקל של המיקרוספירה. מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר שימש ללכידת תמונות של משטח הג'ל ותחתית המיקרוספירה.

האותות של החרוזים הפלואורסצנטיים לא נראו על משטח הג'ל באזור הכניסה. תמונות פלואורסצנטיות של החרוזים המוטמעים בג'ל הפוליאקרילמיד וחרוט הצמיחה העצבי, הראו את החרוזים במקורם ואת עמדותיהם שנעקרו. אות EGFP של חרוט הצמיחה נצפה גם.

הקימאוגרפים הציגו את תנועות החרוז בהשוואה לחרוז התייחסות. בעת ביצוע הדמיית כתמים אחת, דברים חשובים לבחירת נוירון כי שבועי מבטא כיצד לפעול תחת שני אזור מינימלי. בעת ביצוע מיקרוסקופיה כוח המתיחה, הדמיית הגדלה גבוהה חשובה לריכוז מדויק של כוח המתיחה.