פלטפורמה הגבוהה הקרנת מודולרי האוטומטי תפוקת Exopolysaccharide בשילוב עם ניתוח רגיש מאוד טביעות אצבע פחמימות

המטרה הכוללת של גישה זו היא סינון מהיר ואמין ליצרני אקסופוליסכריד מיקרוביאלי וזיהוי טביעת האצבע הפחמימות שלהם. זהו צעד חיוני על מנת לנצל את המגוון הלא נחקר של אקסופוליסכרידים. השיטה שלנו יכולה לעזור להאיץ את מחקר הפולימרים בתחום האקסופוליסכרידים המיקרוביאליים.

זה מאפשר זיהוי מהיר של גרסאות פוליסכרידים חדשות עם תכונות שונות עבור יישומים ספציפיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השילוב של מערכות זיהוי אקסופוליסכריד שונות בתפיסת סינון מודולרית ואוטומטית לחלוטין. זה הופך אותו למהיר ואמין במיוחד.

טכניקה זו יכולה להתבצע גם באופן ידני במעבדות בהן אין פלטפורמת אוטומציה זמינה, ולכן השימוש בה גמיש מאוד, וניתן להתאים אותו לצרכי סינון שונים. לפלטפורמת סינון אקסופוליסכריד, או EPS, יש הגדרה מודולרית, המאפשרת הפרדת הפרוטוקול לשני חלקים עיקריים, סינון אוטומטי וטביעת אצבע של פחמימות. המשימה הראשונה היא לטפח את הזנים לסינון ולהסיר את התאים באמצעות צנטריפוגה.

הזנים מתורבתים על גלוקוז כמקור פחמן בצלחות של 96 בארות מכוסות בסרט איטום נושם על שייקר צלחת מיקרו טיטר ב-30 מעלות צלזיוס ו-1,000 סל"ד. ביום המסך, הכן את שולחן העבודה הרובוט וקרוסלת האחסון כמתואר בטקסט הפרוטוקול. הסר את סרט האיטום הנושם מהצלחות והקצה את התרבויות העיקריות במצבי קרוסלה 1-1 עד 1-4.

התחל את התוכנית הרובוטית האוטומטית. להסרת תאים לאחר הטיפוח, העבירו את התרבות הראשית צלחות באר עמוקות מהקרוסלה לצנטריפוגה, וצנטריפוגה בטמפרטורה של 4, 300 x גרם ו -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עבור המשקעים לפני הסינון, העבר את לוחות המיקרו טיטר, כמו גם את לוחות המיקרו טיטר של מחוון ה- pH, מהקרוסלה לשולחן העבודה.

כמו כן, העבירו את לוחות הסינון, המבטיחים הסרה מלאה של כל תאי החיידקים, יחד עם לוחות האספן למיקומי שולחן העבודה שלהם. לאחר הצנטריפוגה, העבירו 180 מיקרוליטר של חומר העל של התרבות הראשית לצלחת הסינון. שאפו 150 מיקרוליטר מהסופרנטנט של התרבות הראשית והוציאו 50 מיקרוליטר לתוך צלחת המיקרו טיטר למשקעים לפני הסינון, ו-100 מיקרוליטר ללוחית מחוון ה-pH.

משקעים של הסופרנטנט עם 2-פרופנול מבוצעים כדי להעריך את ייצור ה-EPS. השתמש בפיפטה רב-שלבית של 12.5 מיליליטר כדי להוסיף ידנית 150 מיקרוליטר של 2-פרופנול לכל באר. לאחר ניעור לוחות המיקרו טיטר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב-900 סל"ד, התבונן חזותית בתצורות סיבים או פתיתים המצביעות על ייצור EPS.

לאחר אחסון לוחות התרבות העיקריים בחזרה לקרוסלה, בדוק את מרקי התסיסה, שאמורים להראות ירידה בשקיעה לאחר הצנטריפוגה. העלייה בצמיגות היא אינדיקציה נוספת לייצור EPS. המשימה השנייה היא להבטיח הסרה מלאה של תאים ממרק התסיסה הצמיג באמצעות סינון של 96 בארות.

צנטריפוגה את לוחות הסינון בחום של 3, 000 x g ו- 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן החזר את הלוחות למצב הבית של הקרוסלה ובצע שיווי משקל של סינון הג'ל כמתואר בטקסט הפרוטוקול. לאחר מכן, פיפטה 35 מיקרוליטר של סינון למרכז צלחת סינון הג'ל המאוזנת, ו-50 מיקרוליטר לצלחת המיקרו טיטר המשמשת למשקעים.

העבר את לוחות סינון הג'ל לצנטריפוגה, והעבר את כל שאר הצלחות משולחן העבודה בחזרה לעמדות הבית בקרוסלה. לאחר אחסון כל הלוחות בחזרה בקרוסלה, שימו לב לסופרנטנטים הצמיגים ביותר כפי שמצוין על ידי שאריות בלוחית המסנן. מחסור בסינון יכול להוביל לתוצאות שליליות כוזבות במודולים האנליטיים הבאים.

המשימה השלישית בסינון אוטומטי היא הסרת הסוכרים המונומרים הנותרים ממצע הגידול באמצעות סינון ג'ל של 96 בארות. צנטריפוגה את צלחות סינון הג'ל בחום של 1, 000 x גרם ו -20 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. הכן את שולחן העבודה באמצעות המניפולטור הרובוטי לעיבוד תסנני הג'ל.

כדי לזהות את שאריות הגלוקוז לאחר סינון ג'ל, אנו טיפים של 50 מיקרוליטר להעברת 25 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים לצלחת מיקרו טיטר טרייה. שאפו 20 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים, חמישה מיקרוליטר אוויר ו -5 מיקרוליטר ג'ל מסונן, והוציאו לאותה צלחת. קח קצות של 200 מיקרוליטר ושאף 50 מיקרוליטר של תערובת ריאגנטים לבדיקת גלוקוז ממצב שולחן העבודה 1-2 כדי להתחיל את הבדיקה הראשונה.

העבר את צלחות המיקרו טיטר לתוך החממה. לאחר 30 דקות של דגירה, העבירו את הצלחות מהחממה לקורא המיקרו טיטר, ורשמו את הספיגה ב-418 ו-480 ננומטר. כדי לקבוע את תכולת הפחמימות הכוללת בשיטת פנול-חומצה גופרתית, פיפטה 20 מיקרוליטר של ג'ל-סינון לצלחות המיקרו-טיטר.

הסר ידנית את הצלחות מהקרוסלה והנח אותן בתחנת הטיפול בנוזלים. כלול את לוחית הכיול עם 20 מיקרוליטר של ריכוזי גלוקוז שונים בשלוש עותקים. הנח מיכל פסולת במצב 1, קופסת טיפים של 300 מיקרוליטר במצב 2, ושוקת של 250 מיליליטר עם 110 מיליליטר של חומצה פנול-גופרתית טרייה שהוכנה במצב 3.

השתמש בפיפטה בעלת 8 ערוצים עם קצות של 300 מיקרוליטר כדי להעביר 180 מיקרוליטר של חומצה פנול-גופרתית לכל שורה של כל הצלחות. מכסים את כל צלחות המיקרו טיטר במכסים ומערבבים על ידי ניעור במשך חמש דקות ב-900 סל"ד בטמפרטורת החדר. דוגרים במשך 35 דקות בחום של 80 מעלות צלזיוס בתנור לתגובת הצבע.

לאחר קירור הלוחות מתחת למכסה אדים, מדוד את ההכחדה ב-480 ננומטר. זנים מהבדיקה האוטומטית מוגדרים כחיוביים ל-EPS אם הם עומדים לפחות בשניים משלושת הקריטריונים הבאים. בקרת צמיגות, זיהוי פולימר ושווה ערך לגלוקוז מחושב.

שווה הערך לגלוקוז מחושב באמצעות משוואה זו. טביעת האצבע של הפחמימות של פלטפורמת הסינון מכילה את שלוש המשימות האחרונות המבוצעות באופן ידני. הסינון הנותר של הלהיטים החיוביים ממשימה שתיים מספק את הבסיס לסינון הג'ל במשימה החמישית.

משימה שישית היא מיקרו הידוליזה של 96 בארות של תסנין הג'ל. כדי להשיג זאת, השתמש תחילה בפיפטה 12 ערוצים של 50 מיקרוליטר כדי להעביר 20 מיקרוליטר של ג'ל מסנן לצלחת PCR חדשה. לאחר מכן השתמש בפיפטה רב-שלבית של 1.25 מיליליטר כדי להוסיף 20 מיקרוליטר של ארבע חומצה טריפלואורואצטית טוחנת לכל באר.

מכסים את לוחית ה-PCR במחצלת כובע אלסטומר תרמופלסטית, ומניחים את לוחית ה-PCR בהתקן הידוק מיוחד. מערבבים את התמיסות באמצעות היפוך מכשיר ההידוק 10 פעמים. לאחר צנטריפוגה של לוחית ה-PCR, ואבטחתה במכשיר ההידוק, הניחו את מכשיר ההידוק המאובטח באמבט חול שחומם מראש ודגרו בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.

בעזרת פיפטה 12 ערוצים של 200 מיקרוליטר, הוסף תמיסת אמוניה של 3.2% כדי להתאים את ה-pH לכ-8. כסו את לוחית ה-PCR במחצלת מכסה אלסטומר תרמופלסטית, ונערו אותה ידנית באמצעות מכשיר ההידוק. המשימה הסופית היא לנתח את טביעת האצבע של הפחמימות באמצעות שיטת תפוקה גבוהה-1-פניל-3-מתיל-5-פיראזולון, או HTPMP.

כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בפיפטה בעלת 12 ערוצים של 50 מיקרוליטר כדי להעביר 25 מיקרוליטר של ההידרוליזט המנוטרל לצלחת PCR טרייה. מוסיפים 75 מיקרוליטר של תערובת ריאגנטים נגזרת ומכסים את הצלחת במחצלת כובע אלסטומר תרמופלסטית. הנח את לוחית ה-PCR ב-PCR ב-70 מעלות צלזיוס למשך 100 דקות, ולאחר מכן קירור ל-20 מעלות צלזיוס.

העבירו אליקוט של 20 מיקרוליטר לתוך לוחית מיקרו טיטר חדשה, ולאחר מכן השתמשו בפיפטה של 12 ערוצים של 200 מיקרוליטר כדי להוסיף 130 מיקרוליטר של חומצה אצטית של 19.23 מילי-מולרית לכל קו. מערבבים ישירות באמצעות שאיבה וחלוקה לפחות שש פעמים, ומעבירים את כל הנוזל לצלחת סינון של 0.2 מיקרומטר עם לוחית אספן מיקרו טיטר. צנטריפוגה את הצלחת ב-1, 000 x גרם למשך חמש דקות, הסר את לוחית המסנן ואטום את לוחית אספן המיקרו טיטר עם מחצלת כובע סיליקון.

הנח את לוחית המיקרו טיטר לתוך UHPLC-UV-ESI-MS לקביעת טביעת האצבע של הפחמימות. טבלה זו מציגה את התוצאות של שלושה זנים חדשים לדוגמה כפי שזוהו בהצלחה עם פלטפורמת סינון זו. החלק השמאלי של הטבלה מציג את התוצאות של מודולי הסינון האוטומטיים הנוגעים להיווצרות צמיגות, ייצור פולימרים ושווה ערך לגלוקוז מההידרוליזה הכוללת, ששימשו כפרמטרי הערכה לניתוח טביעות אצבע מפורט של פחמימות.

טביעת האצבע של הפחמימות המבוססת על סוכרים מכוילים כמו גם סוכרים, דימרים ותחליפים לא ידועים ניתנת בחלק הימני של הטבלה. באמצעות מידע זה ניתן לחשב את ההרכב המונומרי ולהשוות אותו למבני פולימר ידועים כבר. יתר על כן, ניתן לבצע סינון ממוקד של הרכבים מונומרים מעניינים ופחמימות נדירות.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו עבור 386 זנים תוך חמש שעות בלבד. בעקבות הליך זה, ניתן לכלול בדיקות נוספות כמו פירובט שכבר קיים או בדיקות נוספות לאצטטים, או פוספט על מנת לענות על שאלה נוספת של הצהרת אקסופוליסכריד. לאחר פיתוחה, טכניקה זו, ברגישותה הגבוהה, סללה את הדרך למחקר שלנו בתחום יצרני אקסופוליסכריד מהונדסים גנטית, מיקרוביאליים, כדי לחקור את ההשפעה של מסלולים ביוסינתטיים אקסופוליסכרידים משתנים על המבנה הכימי השוכן.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות יצרני אקזופוליסכריד חדשים בצורה מהירה ואמינה מאוד.