הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור Transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות MexB Multidrug

על מנת לטהר את חלבון הממברנה Mex B, מקס B מתבטא לראשונה באי קולי בשיטות DNA רקומביננטיות. לאחר מכן מבודדים את הממברנות וחלבוני הממברנה מסיסים בעזרת חומר ניקוי עדין. חלבון הממברנה המסיס מטוהר באמצעות iMac והחלבון מטוהר עוד יותר באמצעות כרומטוגרפיה של סינון ג'ל.

רמת הטיהור של החלבון נקבעת באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל SDS poly ACRYLAMIDE. למרות שהליך זה יכול לספק תובנה לגבי טרנסממברנים טרנסממברניים עמידים לתרופות מרובות, ניתן ליישם אותו גם על חלבוני ממברנה אחרים המדגימים את ההליכים היום ייווצרו על ידי סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי להליך זה, מקס B מ-pseudomonas Aosa ישובט לתוך וקטור הביטוי PET 30 B בתוספת כך שמקס B יבוא לידי ביטוי עם תג היסטמין HEXA מסוף C. התחילו בערב בחיסון ארבע תרביות מיצין במשקל שלושה מיליליטר עם טרנספורמטורים טריים או השתמשו בציר קפוא, גדלו את התרביות על רולר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בלילה בבוקר.

השתמש בתרביות הלילה כדי לחסן 150 מיליליטר של LB המכילים 30 מיקרוגרם למיליליטר. האם מיצין יכול לגדל את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר אחר הצהריים? השתמש בתרבית הקטנה כדי לחסן שש פעמים ליטר אחד, שתי מדיות XYT המכילות 30 מיקרוגרם למיליליטר.

האם מיצין בשרך יכול להחזיר צלוחיות אחוריות? השתמש ב -25 מיליליטר לתרבית לדילול של אחד עד 40. גדל את התרביות ב-37 מעלות צלזיוס עד שהן מגיעות לצפיפות אופטית.

600 של 0.4 עד 0.6, כ -1.5 שעות. כאשר התרביות מגיעות לצפיפות המתאימה, יש לגרום לביטוי חלבון על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של טוחנת אחת. IPTG. החזירו את כל הצלוחיות לשייקר והמשיכו לגדל אותן בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה עד לקטיף החיידקים למחרת בבוקר.

הוציאו את התרבויות מהשייקר וצננו אותן. לאחר מכן כדי לקצור את התאים, העבירו את התרביות לצינורות צנטריפוגות וצנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב-5,000 סיבובים לדקה בצנטריפוגה בקנה מידה גדול בזמן שהתאים צנטריפוגה. השלם 100 מיליליטר של מאגר השעיה מחדש של תאים עם DNAs, מעכבי פרוטאז וליזוזים.

כמו כן, השלם שתי אליקוטים של מאגר תרחיף ממברנה Resus עם מעכבי פרוטאז כפי שמוצג בטבלה זו. שמור את כל שלושת הפתרונות על הקרח לאחר השלמת הצנטריפוגה. Resus מוציאים את כדורי התא ב -100 מיליליטר של מאגר השעיית תאים.

לאחר מכן, חלץ את התאים. תרחיף התא נטען בתא הלחץ הצרפתי והתא מונח על המכבש הצרפתי. הלחץ מופעל עד שהוא מגיע ל-12,000 פאונד לאינץ' מרובע.

המסתם נפתח בכמות קטנה מאוד כך שהתאים השבורים מטפטפים החוצה. חשוב לא לפתוח את המסתם יותר מדי ולתת לתאים לזנק החוצה מכיוון שהם ישתחררו בלחץ קטן מדי ולא יישברו ביעילות. אוספים את ליזאט התא בבקבוק, נשמר קר על קרח.

העבירו את תמיסת התא דרך תא לחץ צרפתי שוב ב-12,000 פאונד לאינץ' מרובע. העבירו את ליזט התא לצינורות צנטריפוגה SS 34 ולצנטריפוגה כדי להסיר פסולת תאים במהירות של 10,000 סיבובים לדקה למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס ברוטור SS 34. הליזאט המובהר הוא הבא בתור.

משמש להכנת שבר הממברנה. העבירו בזהירות את ה-supinate ל-ti. 6 4, 7 0.5 צינורות אולטרה צנטריפוגה, צנטריפוגה ברוטור TI 6 4 7 0.5 ב-40,000 סיבובים לדקה למשך 50 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

השליכו את הספינאט. השתמש בפיפטה כדי להשעות בעדינות את הגלולה, המכילה את קרומי התאים בכ-25 מיליליטר של ממברנה מאגר מתלה Resus מעביר את מתלה הממברנה לצינור צנטריפוגה נקי ורווח צנטריפוגה ברוטור TI I 6 4 7 0.5 של 40,000 סיבובים לדקה למשך 50 דקות של ארבע מעלות צלזיוס ולהשעות מחדש את פלטת הממברנה השטופה ב-25 מיליליטר של מאגר מתלה Resus ממברנה. לאחר מכן, יש להמיס את חלבוני הממברנה לממברנות התלויות בכ-25 מיליליטר.

הוסף שישה מיליליטר של 10% DDM כך שריכוז חומר הניקוי הסופי יהיה 2% DDM נדנד את התערובת בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים לאחר הדגירה של שעתיים בנוכחות צנטריפוגת DDM, התערובת ב 40, 000 סיבובים לדקה למשך 40 דקות בארבע מעלות צלזיוס ברוטור TI I 6 4 7 0.5. על מנת להפריד את קומפלקסי חומרי הניקוי החלבונים המסיסים מהחלבונים הבלתי מסיסים. שמור את הנטנט השכיבה המכיל את קומפלקסי חומרי הניקוי של חלבון Mex B לשימוש בטיהור תערובת ה-natant השכיבה המכילה את קומפלקסי חומרי הניקוי של חלבון Mex B עם שני מיליליטר של חרוזי זיקה מתכתיים מאוזנים ב-Resus suspension Buffer דגירה למשך שעה על רולר בארבע מעלות צלזיוס לאחר קשירת החלבונים לשרף.

יוצקים את התרחיץ לגוף עמוד זרימת הכבידה וזורקים את הזרימה דרכו. שטוף את העמודה עם 20 מיליליטר או 10 נפחי עמודות של כריכת iMac ומאגר כביסה בסיום שטיפת העמודה. יש לסלק את החלבונים הקשורים עם 10 מיליליטר של מאגר פליטה iMac.

קח 10 דגימות מיקרוליטר מכל שבר פליטה. מערבבים עם 10 מיקרוליטר של דגימת SDS פעמיים, חוצצים ומנתחים על 10% פולי אקרילאמיד. ג'ל SDS.

העריכו את הכמות והטוהר של מקס B בכל שבר. משוך את השברים המכילים את קומפלקסי חומרי הניקוי של חלבון Mex B ורכז אותם ברכז ספין בארבע מעלות צלזיוס. היזהר שהחלבון לא ישקע החוצה בשלב זה.

השתמש במספר ספינים קצרים וצפה למשקעים. לאחר כל סיבוב, המשך לטהר את השברים שנאספו באמצעות עמוד סינון ג'ל. אזנו מראש סופר ורד 12 HL 30 על 10 עמודות עם 24 מיליליטר של מאגר רץ והמתינו לקו בסיס שטוח.

לאחר מכן, שטפו את לולאת הטעינה של מערכת השחקן עם מאגר פועל. לפני שמורחים את החלבון על העמודה, יש לסנן את תמיסת החלבון באמצעות פילטר מזרק. לאחר מכן טען עד 240 מיקרוליטר מתמיסת החלבון על העמוד עם חלבון של עד חמישה מיליגרם למיליליטר.

הפעל נפחי מאגר של 1.5 עמודות ואסוף שברים של 0.25 מיליליטר. קומפלקסי חומרי הניקוי של חלבון XB מתפוגגים כשיא בסביבות 10 עד 15 מיליליטר של נפח פליטה. קח חמש דגימות מיקרוליטר של שברי השיא.

מערבבים כל דגימה אחת לאחת עם מאגר דגימת SDS פעמיים. נתח את הדגימות על ג'ל פולי אקרילאמיד 10% כדי להעריך את הכמות והטוהר של me Mex B בכל שבר, משוך את השברים המכילים ME B טהור.ג'ל פולי אקרילאמיד זה היה טעון בשברים שנמשכו מעמודת ה-iMac ושברים בודדים מעמודת סינון הג'ל. לאחר עמודת סינון הג'ל, החלבון נראה טהור על ג'ל הפולי אקרילאמיד המוכתם בקומאסי.

עקבות מעמודת סינון הג'ל מציגות את השיא העיקרי של קומפלקס חומרי הניקוי החלבונים היוצא מהעמודה. התפוקה הממוצעת של חלבון mxb היא כשני מיליגרם לשישה ליטר של שתי תרביות XYT לאחר שליטה, ניתן לבצע הליך זה תוך שמונה שעות אם הוא מבוצע כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבטא, להמיס ולטהר חלבון ממברנה.