Name: הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור Transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות MexB Multidrug (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: למדו לבטא, למסות ולטהר את חלבון הממברנה MexB מ-Pseudomonas aeruginosa באמצעות שיטות DNA רקומביננטי וכרומטוגרפיית iMac. פרוטוקול זה מספק מודל לחקר חלבוני ממברנה ומנגנוני עמידות לאנטיביוטיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך על ידי מענקים CJJ מן הקרן הלאומית למדע והחברה למדעים Biomolecular.

1. יום 1: MexB מ Pseudomonas aeruginosa מקודד על ידי pFB101. הגן MexB הוגדל מ - פ aeruginosa DNA הגנומי ונוסף על NdeI ואתרי XhoI הגבלה של + pET30b וקטור. לבנות מכיל תג בטרמינל C-hexahistidine. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד משמש כדי להפוך את ה coli זן C43 (DE3) 12, ואת transformants הם מצופה על אגר LB המכיל 30 UG / mL kanamycin. </li></ol> 2. יום 2: תרבויות לינה: <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בערב, 4 X 3 LB המכיל 30 מ"ל תרבויות UG / mL kanamycin הם מחוסן מן המושבות transformant טריים. לחלופין, תרבויות יכול להיות מחוסן מפני סלסול קפוא. תרבויות אלו קטנים הם גדלו על מכבש על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 3. יום 3: גידול 6 ליטר תרבויות: <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר, השתמש תרבויות לילה לחסן LB 150 מ"ל המכיל 30 UG / mL kanamycin. לגדול התרבות ב 37 ° C על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעות אחר הצהריים, להשתמש תרבות קטן לחסן 6 x 1 ליטר 2XYT מדיה המכילה 30 UG / kanamycin מ"ל צלוחיות Fernbach. (השתמש 25 מ"ל לכל תרבות לדילול 01:40). לגדול התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים OD של 600 0.4-0.6, כ -1.5 שעות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התרבויות להגיע צפיפות נכונה, להשרות ביטוי החלבון על ידי הוספת 0.5 מ"ל 1M IPTG. מכניסים את כל צלוחיות בשנות ה שייקר ולהמשיך לגדל אותם ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 4. יום 4: קצירת התאים וטיהור חלבון: <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מעכבי פרוטאז, DNAse ו ליזוזים לפתרונות חיץ כדלקמן: עד 50 מ"ל של חיץ resuspension התא, להוסיף 10 מ"ג DNaseI (0.1 מ"ג / מ"ל ​​בריכוז הסופי), 1 מעכב השלם EDTA ללא פרוטאז הלוח, וקורט ליזוזים . עד 60 מ"ל של חיץ resuspension קרום, להוסיף 1 מעכבי פרוטאז הלוח. כדי 50 מ"ל נוסף של המאגר resuspension קרום, להוסיף 1 מעכבי פרוטאז הלוח. שמור את כל שלושה פתרונות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התרבויות 30 דקות 5,000 סל"ד בצנטריפוגה בקנה מידה גדול כדי לקצור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים חיץ תא resuspension 100 מ"ל (50 NAP מ"מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, 2 מ"מ MgCl 2, 1 מעכב השלם EDTA ללא לוח פרוטאז, 0.1 מ"ג / מ"ל DNAse אני, קמצוץ של ליזוזים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את פתרון התא פעמיים באמצעות תא הלחץ הצרפתי 12,000 psi (762 מד הלחץ). אסוף את lysate תא בקבוק קר כל הזמן על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את lysate התא SS34 צינורות צנטריפוגה ו צנטריפוגות כדי להסיר שאריות תאים למשך 30 דקות בסל"ד 10,000 ב 4 מעלות צלזיוס הרוטור SS-34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את supernatant לתוך צינורות Ti647.5 ultracentrifuge. צנטריפוגה 50 דקות בסל"ד 40,000 ב 4C. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה, אשר מכיל את קרום התא, על כ. 25 מ"ל של חיץ resuspension קרום (50 NAP מ"מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, 1 מעכב השלם EDTA ללא לוח פרוטאז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה קרום לצינור צנטריפוגה צנטריפוגה נקי ב 40,000 סל"ד ב הרוטור Ti647.5 עבור 50 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend הממברנה גלולה לרחוץ 25 חוצץ קרום מ"ל resuspension (50 NAP מ"מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, 1 מעכב השלם EDTA ללא לוח פרוטאז). </li></ol> 5. TM Solublization חלבון: <ol start="15" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי הממברנות resuspended (כ 25 מ"ל), מוסיפים 6 DDM מ"ל 10% (ריכוז חומר הניקוי הסופי = DDM 2%) רוק את התערובת על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת בסל"ד 40,000 עבור 40 דקות על 4 מעלות צלזיוס הרוטור Ti647.5 כדי להפריד אבקת חלבון מסיס קומפלקסים של חלבונים מסיסים. שמור את supernatant, המכיל אבקת חלבון מתחמי MexB. </li></ol> 6. IMac: <ol start="17" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את supernatant המתקבל ספין במהירות גבוהה עם זיקה חרוזי מתכת טופר equilibrated במאגר resuspension. דגירה של 1 שעות על רולר בבית 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת לתוך גוף זרימת הכבידה טור וזורקים את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הטור עם 20 מ"ל (10 כרכים עמודה) של הצפת מחייב לשטוף iMac (50 NAP מ"מ, ה-pH 7, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, DDM 0.2%) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute את החלבון עם חיץ elution iMac (50 NAP מ"מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, 250 מ"מ imidazole, DDM 0.2%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 15 דגימות μL של שברים elution, לערבב עם כל 15 חיץ μL SDS 2X מדגם לניתוח על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide. ספין 30sec ב microcentrifuge. ניתוח דגימות על polyacrylamide של 10% SDS ג'ל לאמוד את הסכום ואת טוהר MexB בשבריר אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים המכיל את אבקת חלבון מתחמי MexB ולרכז אותם concentrator ספין ב 4 ° C. היזהר כי החלבון אינו המשקע החוצה זה sטפ. </li></ol> 7. סינון ג'ל עמודה: <ol start="23" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לאזן 12 Superose HL 30/10 טור עם חיץ 24 מ"ל ריצה (50 NAP מ"מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, 0.2% בטא octylglucoside), ולחכות הבסיס שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את טעינת מערכת אקטע לולאה עם חיץ פועל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן הפתרון חלבון באמצעות מסנן מזרק לפני החלת אותו הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען עד 240 μL של הפתרון חלבון על הטור, עם ריכוז חלבון של עד 5 מג / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה 1.5 כרכים עמודה (36 מ"ל) של חיץ, לאסוף את השברים 0.25 מ"ל. אבקת חלבון מתחמי MexB צריך elute כמו לשיא בסביבות 10-15 מ"ל של נפח elution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו 5 דגימות μL של שברים שיא. מערבבים את כל מדגם 01:01 עם חיץ מדגם SDS 2X. ניתוח דוגמאות על ג'ל polyacrylamide 10% כדי לאמוד את הסכום ואת טוהר MexB בשבריר כל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים המכיל MexB טהור. </li></ol> 8. נציג תוצאות: איור 1 כוללת ג'ל polyacrylamide עם שברים טור נקווה מהעמודה iMac ו שברים בודדים מעמודה הסינון ג'ל. אחרי הטור סינון ג'ל חלבון מופיע טהור על ידי ג'ל polyacrylamide Coomassie מוכתם. איור 2 כולל עקבות מהעמודה ג'ל סינון מראה את השיא העיקרי של משחררי אבקת חלבון מורכב מהעמודה. התשואה הממוצעת של חלבון MexB הוא כ 2 מ"ג 6 ליטרים של תרבות 2XYT. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. SDS-PAGE ג'ל של טיהור PDCs MexB. Lane 1, משקל סמנים מולקולריים. 2, משולב שברים iMac. 3-7, טור ג'ל סינון שברים. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. דוגמה סינון תוצאות ג'ל ניקוי MexB קומפלקסים חלבונים (PDC).

<ol><li>Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elegant+means+of+self-protection+in+gram-negative+bacteria+by+recognizing+and+extruding+xenobiotics+from+the+periplasmic+space%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space.</a> J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).</li>
<li>Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+efflux+pump%28s%29+in+intrinsic+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+active+efflux+as+a+contributing+factor+to+beta-lactam+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).</li>
<li>Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MexA-MexB-OprM+in+antibiotic+efflux+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).</li>
<li>Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificities+of+MexAB-OprM%2C+MexCD-OprJ%2C+and+MexXY-oprM+efflux+pumps+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).</li>
<li>Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AcrAB+efflux+pump+plays+a+major+role+in+the+antibiotic+resistance+phenotype+of+Escherichia+coli+multiple-antibiotic-resistance+%28Mar%29+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants.</a> J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).</li>
<li>Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug+efflux+pumps+MexA-MexB-OprM+and+MexC-MexD-OprJ+in+a+multidrug-sensitive+Escherichia+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).</li>
<li>Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AcrA%2C+AcrB%2C+and+TolC+of+Escherichia+coli+Form+a+Stable+Intermembrane+Multidrug+Efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Complex.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux.</a> Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).</li>
<li>Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mex-gene+products+in+antibiotic+extrusion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).</li>
<li>Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+and+surfactant+interactions+in+membrane-protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).</li>
<li>Jones, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+membrane+solubilisation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Surfactants in membrane solubilisation.</a> Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).</li>
<li>Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בנוסף multidrug, התנגדות פעילויות רבות הסלולר חיוניים, כולל תחבורה ותקשורת יון תאים תאים, תחבורה, שלפוחית, תחזוקה של המבנה התאי, והוא מארח הפתוגן אינטראקציות, לערב חלבונים אשר מוטבעות בתוך קרום התא. חלבונים הטרנסממברני לפצות מעל 30% של חלבונים ידועים הם מטרות עבור רוב התרופות בשימוש כיום. קיפול לא נכון או פעילות של חלבונים הטרנסממברני להוביל מחלות גנטיות חשובות, כולל סיסטיק פיברוזיס סוכרת ו. למרות החשיבות העצומה של חלבונים הטרנסממברני, יש הרבה פחות ידוע על המבנים שלהם ואת המנגנוני...

<table><tbody><tr><td>באפר לדגימות SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>זן *E. coli* C43(DE3)</td><td>Lucigen</td><td>60345-1</td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין סולפט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4378</td><td></td></tr><tr><td>מצע 2XYT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2466-2</td><td></td></tr><tr><td>מצע LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61189-5000</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3226-1</td><td></td></tr><tr><td>ליזוזים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>טבליות מעכבי פרוטאזה שלמות ללא EDTA</td><td>קבוצת Roche</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>NaP חד-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6566</td><td></td></tr><tr><td>NaP דו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>גליצרין</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM)&gt;נ&lt;/em&gt;-דודציל-&amp;#946;D-מלטופירנוזיד-</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות 15 מ"ל</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>רוקר מסוג נדנדה (See-Saw Rocker)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SSL 4</td><td></td></tr><tr><td>שרף זיקה למתכת Talon</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>אימידזול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>ג'לי SDS-PAGE פוליאקרילאמיד 10%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-1454</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ריצה ל-PAGE מסוג Tris/glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0732</td><td></td></tr><tr><td>סמני משקל מולקולרי צבועים מראש מסדרת Kaleidascope</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0324</td><td></td></tr><tr><td>עמודת Superose 12 30/10</td><td>GE Healthcare</td><td>12 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>מרכז צנטריפוגלי Amicon</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLFG R04 NL</td><td></td></tr><tr><td>בקבועי פרנבך (Fernbach flasks)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-552-39</td><td></td></tr><tr><td>מנער להחזקת בקבוקי Fernbach</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת Akta</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה גדולה מדגם J6 עם רוטור JLA-8.1000</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי צנטריפוגה של 1 ליטר</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>969329</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה RC-5</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רוטור בזווית קבועה SS34 ומבחנות</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אולטראצנטריפוגה דגם רצפה של Sorvall</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רוטור T647.5 ומבחנות עם פקקים</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>08322</td><td></td></tr><tr><td>תא לחץ צרפתי (French Pressure Cell)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr></tbody></table>

הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות mexb multidrug

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

התנגדות Multidrug (MDR), היכולת של תא סרטני או פתוגן להיות עמידים בפני מגוון רחב של תרופות נוגדות סרטן מבנית או תפקודית ואינו קשור אנטיביוטיקה, היא בעיה רצינית הנוכחי בריאות הציבור. זו התנגדות multidrug נובע במידה רבה אנרגיה תלויי משאבות בזרימת סמים. המשאבות לגרש תרופות נוגדות סרטן או אנטיביוטיקה לתוך המדיום חיצוניים, הורדת ריכוז תאיים שלהם מתחת לסף רעילים. אנחנו לומדים התנגדות multidrug ב Pseudomonas aeruginosa, פתוגן חיידקי אופורטוניסטית שגורם לזיהומים בחולים עם סוגים רבים של פציעה או מחלה, למשל, כוויות או סיסטיק פיברוזיס, וגם חיסונית נפגעת דיאליזה סרטן, חולים להשתלה. בזרימת הגדולות MDR משאבות פ aeruginosa הם קומפלקסים משולשת המורכבת antiporter הפנימית הממברנה פרוטונים סמים (RND), ערוץ הממברנה החיצונית (OMF), לבין חלבון מקשר periplasmic (MFP) 1-8. החלבונים RND ו OMF הם חלבונים הטרנסממברני. חלבונים הטרנסממברני לפצות יותר מאשר 30% של כל החלבונים הם 65% מטרות תרופה הנוכחי. תחומים הטרנסממברני הידרופובי לייצר חלבונים מסיסים חיץ מימית. לפני חלבון הטרנסממברני יכול להיות מטוהרים, יש צורך למצוא את התנאים חוצץ המכיל חומר ניקוי עדין המאפשרים את החלבון להיות solubilized כמתחם אבקת חלבון (PDC) 11/09. בדוגמה זו, אנו משתמשים חלבון RND, פ MexB aeruginosa טרנספורטר הטרנסממברני, כדי להדגים איך לבטא צורה רקומביננטי של חלבון הטרנסממברני, solubilize אותו באמצעות דטרגנטים, ולאחר מכן לטהר את אבקת קומפלקסים חלבונים. שיטה זו בכלל ניתן ליישם את הביטוי, טיהור, ו solubilization של חלבונים רבים אחרים קרום הביע recombinantly. ניקוי קומפלקסים חלבונים יכול מאוחר יותר לשמש אפיון ביוכימי או biophysical לרבות קביעת רנטגן קריסטל מבנה או מחקרים crosslinking.

בפרוטוקול הזה אנחנו מדגימים את הביטוי, solubilization, וטיהור של חלבון קרום הביע recombinantly, MexB, כפי מורכב חלבון מסיס חומר ניקוי. MexB היא התנגדות הממברנה multidrug טרנספורטר מן החיידק Pseudomonas aeruginosa אופורטוניסטית הפתוגן.

הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור Transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות MexB Multidrug

עמידות למספר תרופות (Multidrug resistance - MDR), היכולת של תא סרטני או פתוגן להיות עמידים למגוון רחב של תרופות שאינן קשורות מבנית או תפקודית...

על מנת לטהר את חלבון הממברנה Mex B, ראשית מבטאים את Mex B ב-e coli באמצעות שיטות של DNA רקומביננטי. לאחר מכן, מבודדים את הממברנות וממיסים את חלבוני הממברנה בעזרת דטרגנט עדין. חלבון הממברנה המומס מטהר באמצעות iMac, והחלבון מטהר בהמשך באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל.רמת טיהור החלבון נקבעת באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל SDS poly ACRYLAMIDE. למרות שנוהל זה יכול לספק תובנות לגבי נשאי קרום חוצצים בעמידות לרב-תרופות, ניתן להחילו אותו גם על חלבוני קרום אחרים. את הפרוצדורות כיום יבצע סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לצורך נוהל זה, Mex B מ-pseudomonas Aosa ישכפל לתוך וקטור הביטוי PET 30 B plus, כך ש-Mex B יתבטא עם תג HEXA histamine בקצה ה-C. התחילו בערב על ידי הזרקה של ארבעה תרבימי lb can mycin בנפח 3 mL עם טרנספורמנטים טריים או השתמשו במאגר קפוא, וגדלו את התרבימים על גלגלת בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה.השתמשו בתרביות הלילה כדי להחדיר ל-150 מיליליטר של LB המכיל 30 מיקרוגרם למילליטר קאנמיצין (Kanamycin). גדלו את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס על ניער אחר הצהריים. השתמשו בתרבית הקטנה כדי להחדיר לשש בקבוקים של ליטר אחד של מצע XYT המכיל 30 מיקרוגרם למילליטר.האם ניתן להוסיף מייסין לבקבוקי ערבול של שרך? השתמש ב-25 milliliters לכל תרבית עבור דילול של 1 ל-40. גדל את התרביות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד שיגיעו לצפיפות אופטית.600 של 0.4 עד 0.6, כ-1.5 שעות. כאשר התרביות מגיעות לצפיפות המתאימה, השרו ביטוי של החלבון על ידי הוספה של 0.5 מיליליטר של IPTG בריכוז one molar. החזירו את כל הבקבוקים למכשיר הניעור והמשיכו לגדל אותם ב-30 degrees Celsius למשך הלילה עד לקצירת החיידקים למחרת בבוקר.הוציאו את התרביות מהמנער וקררו אותן. לאחר מכן, כדי לקצור את התאים, העבירו את התרביות למבחנות צנטריפוגה ובצעו סבב צנטריפוגה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות במהירות של 5,000 סל"ד בצנטריפוגה רחבה. בזמן שהתאים נמצאים בצנטריפוגה, הוסיפו למספר 100 milliliters של בופר לריסספנסיה של תאים מעכבי פרוטאז של DNAs וליזוצים.בנוסף, יש להוסיף מעכבי פרוטאז לשתי מנות של תמיסת membrane Resus suspension Buffer כפי שמוצג בטבלה זו. יש לשמור את שלושת התמיסות על קרח עם סיום הסבוב במערכת הצנטריפוגה. יש לבצע רספנסיה (Resus) של משקעי התאים ב-100 milliliters של תמיסת cell resus suspension Buffer.בשלב הבא, בצעו את מיצוי התאים. תרחיף התאים נטען לתא הלחץ של ה-French pressure cell, והתא מונח על ה-French press. הלחץ מופעל עד להגעה ל-12,000 pounds per square inch.פותחים את השסתום באופן חלקי מאוד כך שהתאים השבורים יזלגו החוצה. חשוב לא לפתוח את השסתום יותר מדי ולא לאפשר לתאים להישפך בעוצמה, כיוון שבמקרה כזה הם ישתחררו בלחץ נמוך מדי ולא יישברו ביעילות. אוספים את הליזט התאי לבקבוק שנשמר קר על קרח.העבירו את תמיסת התאים שוב דרך תא לחץ של French בלחץ של 12,000 pounds per square inch. העבירו את הליזאט התאי למבחנות צנטריפוגה מסוג SS 34 ובצעו צנטריפוגה להסרת שיירי תאים ב-10,000 rotations per minute למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius ברוטור SS 34. השלב הבא הוא הליזאט המזוקק.משמש להכנת פראקציית הממברנה. העבר בזהירות את העלייה (supernatant) למבחנות אולטראסנטריפוגה מסוג ti. 6 4, 7 0.5, וסבב ברוטור TI 6 4 7 0.5 במהירות של 40,000 סיבובים לדקה למשך 50 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.שפוך את הנוזל העליון. השתמש בפיפטה כדי להשעות בעדינות את המשקע, המכיל את ממברנות התאים, בכ-25 milliliters של תמיסת סספנסיה membrane Resus. העבר את תספנסיאת הממברנה למבחנת צנטריפוגה נקייה וסובב שוב ברוטור TI I 6 4 7 0.5 במהירות של 40,000 סיבובים לדקה למשך 50 דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס, והשעה את משקע הממברנות השטוף ב-25 milliliters של תמיסת סספנסיה membrane Resus. לאחר מכן, המס את חלבוני הממברנה בממברנות שהושעו בכ-25 milliliters.הוסיפו שישה מיליליטרים של 10% DDM כך שריכוז הדטרגנט הסופי יהיה 2% DDM. נערנו את התערובת בתנועות נדנוד (rock) בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר דגירה של שעתיים בנוכחות DDM, סבבנו את התערובת בצנטריפוגה ב-40,000 סל"ד למשך 40 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ברוטור TI I 6 4 7 0.5, וזאת על מנת להפריד את קומפלקסי הדטרגנט-חלבון המסיסים מהחלבונים הבלתי מסיסים. שמרו את הסופרנאט המכיל את קומפלקסי הדטרגנט-חלבון Mex B לצורך שימוש בתהליך הטיהור. ערבבו את הסופרנאט המכיל את קומפלקסי הדטרגנט-חלבון Mex B עם שני מיליליטרים של חרוזי זיקה למתכת (IMAC beads) שהושרתה ב-Resus suspension Buffer. דגרו למשך שעה אחת על גלגלת (roller) בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לאחר קישור החלבונים לשרף.שפכו את התרחיף לתוך גוף של עמודה לזרימה בכבידה והשליכו את הנוזל שעבר דרכה. שטפו את העמודה עם 20 milliliters או 10 נפחי עמודה של תמיסת קישור ושטיפה עבור iMac, עד להשלמת שטיפת העמודה. אלוטו את החלבונים הקשורים באמצעות 10 milliliters של תמיסת אלוציה עבור iMac.קח דגימות של 10 µL מכל פרקציית אלואציה. ערבב עם 10 µL של באפר דגימה SDS בריכוז פי 2, ובצע אנליזה על ג'ל SDS פולי-אקרילמיד בריכוז 10%.העריכו את הכמות ואת רמת הטוהר של mex B בכל פракציה. שלפו את הפראקציות המכילות את קומפלקסי הדטרגנט של חלבון ה-Mex B ורכזו אותן במרכז spin concentrator בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. היזהרו שחלבון לא ישקער בשלב זה.בצע מספר סבבי סבוב (spin) קצרים ועקוב אחר היווצרות משקעים. לאחר כל סבב, המשך לטיהור השברים המאוחדים באמצעות עמודת סינון ג'ל. בצע שיווי משקל מוקדם לעמודת Superose 12 HL 30 10/300 עם 24 milliliters של בופר ריצה והמתן לקבלת קו בסיס יציב.לאחר מכן, שטפו את לולאת הטעינה של מערכת המזרקים (actor system) עם בופר זורם. לפני יישום החלבון על העמודה, סננו את תמיסת החלבון באמצעות מסנן מזרק. לאחר מכן, טענו לעמודה עד 240 µL של תמיסת חלבון, בריכוז של עד 5 mg/mL.העבירו 1.5 נפחי עמודה של בופר ואספו פראקציות של 0.25 מיליליטר. קומפלקסי דטרגנט-חלבון XB נשטפים כשיא בנפח אלוציה של כ-10 עד 15 מיליליטר. קחו דגימות של חמישה מיקרוליטר מהפראקציות בשיא.ערבבו כל דגימה ביחס של אחד לאחד עם בופר דגימות SDS בריכוז פי שניים. נתחו את הדגימות על ג'ל poly acrylamide בריכוז 10% כדי להעריך את הכמות והטוהר של me Mex B בכל פרקציה, ובידלו את הפרקציות המכילות ME B טהור. ג'ל poly acrylamide זה נטען עם פרקציות שבודלו מעמודת ה-iMac ופרקציות בודדות מעמודת סינון הג'ל. לאחר עמודת סינון הג'ל, החלבון מופיע כטהור על ג'ל poly acrylamide שנצבע ב-kumasi.עקבה מעמודת סינון ג'ל מראה את השיא המרכזי של קומפלקס החלבון-דטרגנט הנשטף מהעמודה. התפוקה הממוצעת של חלבון mxb היא כ-שני מיליגרמים לכל שישה ליטרים של תרבית two XYT. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע הליך זה בשמונה שעות אם הוא מבוצע כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו מבטאים, ממיסים ומטהרים חלבון ממברנה.

expression-detergent-solubilization-purification-membrane-transporter

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים פרוטוקול לחקירה במבחנה של משאבות בזרימת מPseudomonas aeruginosa. פרוטוקול זה מאפשר לדור של שיפוע פרוטון חזק, הפיך, ומתכונן בתוך קרום יפוזום ולכן צריך להיות מותאם לכל חלבון קרום אנרגיה על ידי כוח protomotive.

במבחנה של החקירה וMexAB זרימת המשאבה מPseudomonas aeruginosa

גישה יעילה לבדיקות סקר לאיתור הביטוי של חלבונים בממברנה רקומביננטי בcoli Escherichia מבוסס על היתוך לחלבון פלואורסצנטי ירוק מוצגת.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

פרוטאוליפוזומים משמשים לחקר תעלות מטוהרות וטרנספורטרים שהוקמו מחדש בסביבה ביוכימית מוגדרת היטב. מודגם הליך ניסיוני למדידת פליטה בתיווך חלבונים אלה. מתוארים השלבים להכנת פרוטאוליפוסומים, ביצוע ההקלטות וניתוח נתונים כדי לקבוע כמותית את התכונות הפונקציונליות של החלבון המשוחזר.

Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl<sup-&gt;</sup&gt; ערוצים ומסועים

הפרוטוקול המוצג מתאר את הניתוח של הובלה מתווכת חלבון ממברנה ברמת הטרנספורטר היחיד באמצעות שכבות דו-שכבתיות נטולות שומנים נטולות ממס המשתרעות על פני נקבוביות. זה מושג על ידי יצירת שבבי מערך ננו-נקבוביות המיוצרים בתפזורת, בשילוב עם איסוף וניתוח נתונים מקבילים ביותר, המאפשרים הקמה עתידית של הקרנות אפקטור חלבון ממברנה.

תחבורת ממברנה תהליכים נותחה על ידי מערכת שבב nanopore מקבילה מאוד ברזולוצית חלבון יחידה

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים מרביים הכינון של קרום חלבונים לתוך fusogenic proteoliposomes, פיוז'ן של proteoliposomes כזה עם היעד bilayers השומנים למסירה ללא אבקת החלבונים האלה ממברנה לתוך bilayer postfusion. השילוב של גישות אלה מאפשר הרכבה מהירה וקלה לשליטה של מערכות ממברנה רב רכיבים מורכבים.

ללא דטרגנט מרביים להתחדשות ומבנה של קרום חלבונים לתוך השומנים Bilayers באמצעות Fusogenic משלימים טעונה Proteoliposomes.

כאן אנו מציגים פרוטוקול אקספרס, solubilize של לטהר מספר שנאים בוראט האיקריוטים עם הומולוגיה למשפחה טרנספורטר SLC4 בעזרת שמרים. אנו מתארים גם assay cross-linking כימי כדי להעריך את החלבונים homomeric מטוהרים להרכבה multimeric. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים חלבונים ממברנה מאתגרים אחרים.

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

אנו מתארים שיטה לאפיון של מובילי הממברנה המונעת על ידי פרוטון בתכשירים ושלפוחית ממברנה המיוצרים על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli והליזה של תאים באמצעות עיתונות צרפתית.

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

מאמר זה מציג פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן לאפיון קנדידה albicans ABC (קלטת מחייבת ATP) Cdr1, overexpressed ב Saccharomyces cerevisiae. תג כפול של מסוף C-מחשוף של פרוטאז עם מקשר של 16 שאריות בין Cdr1 לתג תוכנן כדי להקל על הטיהור והקרנת חומר הניקוי של Cdr1.

הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח קנדידה אלביקנס CDR1-mGFPHis

מחקרים מבניים וביוכימיים של מובילי ממברנות אנושיים דורשים כמויות מיליגרם של חלבון יציב, שלם והומוגני. כאן אנו מתארים שיטות ניתנות להרחבה לסינון, ביטוי וטיהור מובילי מומסים אנושיים באמצעות גנים ממוטבים לקודון.

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

פרוטוקול זה מתאר שיטת טיהור SERCA משופרת, הכוללת את הטרהלוז הדו-סוכר בשלב הצנטריפוגה הסופי. פחמימה זו מייצבת חלבונים בתנאים קשים. ה-SERCA המטוהר היה פעיל קטליטית והפגין טוהר גבוה, מה שהופך אותו למתאים למחקרים מבניים ופונקציונליים.

טיהור הרטיקולום הסרקו-אנדופלזמי Ca2+-ATPase משריר הארנב

למדו לבטא, למסות ולטהר את חלבון הממברנה MexB מ-Pseudomonas aeruginosa באמצעות שיטות DNA רקומביננטי וכרומטוגרפיית iMac. פרוטוקול זה מספק מודל לחקר חלבוני ממברנה ומנגנוני עמידות לאנטיביוטיקה.

הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור Transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות MexB Multidrug

גלה סרטונים נוספים