ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג'ל ניתוח
21 בדצמבר 2010
אנו מציגים הליך שבאמצעותו דו מימדי agarose ג'ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את מבנה ביניים שכפול המתרחשות בעקבות קרינה UV.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את תוצרי הביניים המבניים של ה-DNA המתרחשים כאשר שכפול נתקל בנגעי DNA באמצעות ניתוח ג'ל דו מימדי. זה מושג על ידי בידוד ה-DNA תחילה מתאים מתחלקים באופן פעיל בהם הושרו נגעים חוסמי שכפול. לאחר מכן משתמשים באלקטרופורזה של ג'ל כדי להפריד את ה-DNA המשוחזר על סמך גודל.
לאחר מכן, הנתיבים נחתכים ויוצקים מחדש אופקית בג'ל שני המפריד עוד יותר את ה-DNA על סמך גודל וצורה. לבסוף, ניתוח דרומי משמש להמחשת מבני ה-DNA הקשורים לשכפול שברי DNA בזמנים לפני ובזמנים שונים לאחר הכנסת נזק הנגרם על ידי UV. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהליך זה כדי להראות שחוסר היכולת לעבד נגעי DNA במוטציות מסוימות מביא להצטברות של חומרי ביניים לתיקון DNA.
היי, שמי ארתור איאן. אני ממעבדת קורלה באוניברסיטת פורטלנד סטייט. היי, שמי ברנד היא, גם אני ממעבדת קורלה.
היום אנו הולכים להראות לכם הליך לאלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור שכפול DNA ותיקון מתווכים. אז בואו נתחיל.
כדי להתחיל בהליך זה, גדל תרבית לילה של 200 מיקרוליטר של אי קולי המכילה את הפלסמיד PBR 3 22 במדיום ירך DGC עם אמפיצילין ב-37 מעלות צלזיוס. השימוש במדיום ירך DGC ממזער את מיגון ה-UV. לאחר הדגירה של הלילה יש לגלול את התאים ב-14,000 RRP M למשך 30 שניות.
לאחר מכן השעו מחדש את כדור התא ב -200 מיקרוליטר של מדיום DG C החסר אמפיצילין וחיסון. 20 מיליליטר של מדיום ירך DG C מגדלים תרביות ללא בחירת אמפיצילין. באינקובטור רועד ב-37 מעלות צלזיוס עד OD 600 של 0.5, המקביל בערך פי חמישה פי 10 לשמינית התאים, גידול למיליליטר ללא אמפיצילין מונע ברירה כנגד מתווכי שכפול חריגים או לא פרודוקטיביים שעלולים להיווצר במוטציות מסוימות.
בנוסף, אם משתמשים באור UV כדי לגרום נזק, הסרת האמפיצילין מהמדיה נחוצה מכיוון שהוא נספג חזק באורכי גל ומגנים אלה. התאים מפחיתים את המינון האפקטיבי של UV בזמן שהתאים גדלים. השתמש בפוטומטר UVC כדי לקבוע את המרחק ממנורה קוטל חיידקים של 15 וואט המייצרת קצב חשיפה של כ-JUUL אחד למטר מרובע לשנייה.
יש לבצע את השלבים הבאים באור צהוב מכיוון שהדבר ימנע היפוך הפעלה מחדש של ציקלו, בוטאן פרין דימרים על ידי פוטו ליאז, לאחר הקרנת UV. לאחר הגעה לצפיפות התאים הרצויה, השתמש בפיפטה כדי להעביר את התרבית לצלחת פטרי בקוטר 15 סנטימטר על פלטפורמה מסתובבת כדי להבטיח הקרנה אחידה של כל אוכלוסיית התאים. לאחר מכן, הקרינו את התרביות ב -50 ג'אול למטר בריבוע והעבירו אותם מיד לבקבוק סטרילי חם מראש והחזירו אותם לאינקובטור הרועד של 37 מעלות צלזיוס.
במשך הניסוי, מינון זה מייצר בממוצע דימר ציקלו בוטאן פרין אחד, כל 4.5 קילו-בסיסים של DNA חד-גדילי עבור כל נקודת זמן שיש לבדוק. פיפטה של 0.75 מיליליטר של התרבית לתוך 0.75 מיליליטר של רשת קרה כקרח 30. רשת חיץ 30 משמשת כמאגר עצירה המונע את המשך השכפול ותיקון כריתת נוקלאוטיד.
לאחר הוספת מאגר העצירה, ניתן לשמור את הדגימה על הקרח עד סוף מהלך הזמן. לאחר מהלך הזמן גלולה כל דגימה והשעו מחדש את הכדורים. ב -150 מיקרוליטר של מאגר ליזה מפרקים את התאים ב -37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ללא תסיסה.
מכיוון שמבנים משוכפלים עם אזורי גדיל בודד או נקודות הסתעפות רגישים יותר לגזירה של קצות פיפטה חתוכים בעזרת סכין גילוח כדי להרחיב את הפה ולמזער את כוחות הגזירה. באופן כללי, יש לשמור על פיפטינג ותסיסה למינימום עד לאחר עיכול ה- DNA עם אנזימי הגבלה, לאחר ליזה, להוסיף פרוטאינאז K ותא סרקס ולאפשר לדגירה להימשך שעה. זה משמש לשחרור שברי DNA הקשורים לחלבון.
מכיוון ששכפול פעיל של DNA קשור לעתים קרובות לקומפלקסים של חלבון או ממברנה, זה עוזר להגדיל את התשואה של שברי שכפול. לאחר שעה, חלץ את הדגימות על ידי הוספת שני נפחים של פנול לכל דגימה והיפוך עדין של הצינורות למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסיפו שני נפחים של כלורופורם, איזואמיל, אלכוהול, והפכו בעדינות את הצינורות למשך חמש דקות נוספות.
לאחר מכן, צנטריפוגה של הדגימות ב-14,000 סל"ד במיקרו-צנטריפוגה למשך חמש דקות והעבירו את השלב המימי העליון של כל דגימה לצינור טרי. לאחר מכן הוסיפו ארבעה נפחים של אלכוהול ISO כלורופורם, ושוב, הפכו בעדינות את הצינורות למשך חמש דקות. צנטריפוגה את הדגימות שוב ב-14,000 סל"ד למשך חמש דקות.
הניחו קרום דיאליזה על גבי 250 מיליליטר של 0.1 xte בכוס והשליכו 100 מיקרוליטר מכל דגימה על הממברנה. תן לדגימות לעבור דיאליזה במשך שעה לאחר הדיאליזה. מניחים 80 מיקרוליטר מכל דגימה בשפופרת טרייה של 1.5 מיליליטר המכילה 20 מיקרוליטר תערובת אנזימים.
עכל את הדגימות למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. PV שני ליניארי את הפלסמיד ממש במורד הזרם ממקור השכפול. לפני העמסת ג'ל האגרוס יש להוסיף 100 מיקרוליטר כלורופורם ו-20 מיקרוליטר של שישה x צבע טעינה המכיל ברומו.
פנול כחול וקסילן ציאן לכל דגימה וערבוב כלורופורם יפשיט את כל ה-PV שנותר שניים הקשורים לקצוות ה-DNA. התחל בניתוח ג'ל ארוס דו מימדי על ידי העברת דגימות ה-DNA המוגבלות דרך הממד הראשון. ראשית טען טוש אחורי של למבדה בשלושה גדלים לנתיב הראשון של ג'ל אגרוס 0.4% שהוכן בעבר ב-XTBE אחד.
לאחר מכן טען 40 מיקרוליטר מהשלב המימי המכיל את צבע ההעמסה עבור כל דגימה, ודלג על נתיבים כדי להקל על חיתוך הג'ל. לאחר אלקטרופורזה, הפעל את הממד הראשון בוולט לסנטימטר אחד למשך כ-12 עד 15 שעות. ג'ל ה-AGROS במתח נמוך ובאחוז נמוך משמש להפרדת שברי ה-DNA בעיקר על סמך הגודל.
לאחר שהממד הראשון רץ, השתמש בסכין קצבים גדולה כדי לחתוך את הנתיב הראשון המכיל את הסמן האחורי של למבדה ולהכתים באת'ריום ברומיד. עבור הממד השני, פורסים את נתיבי הג'ל באמצעות סכין הקצבים הגדולה באמצעות סמן שלושת ה-Lambda Hind כגידול מנחה והשליכו את האזור שמתחת למקום שבו צפוי הפלסמיד הליניארי לרוץ בכל נתיב. כדי להטיל את הממד השני, הנח כל פרוסה אופקית על פני החלק העליון של גלגלת ג'ל ריקה.
מכינים תמיסה של 1% AROS ב-XTBE אחד ומצננים ל-55 מעלות צלזיוס. לאחר שהתקרר, שפכו פנימה את תמיסת הג'ל כדי ליצוק את הממד השני, והקפידו לכסות לחלוטין את פרוסות הג'ל. חשוב לוודא שהפרוסות מכוונות באופן שווה ואת מפלס הקיק לפני ששופכים את הג'ל.
לאחר שהג'ל התייצב, הפעל את הממד השני, חמש וחצי עד שבע שעות ב-6.5 נפחים לסנטימטר ביחידת אלקטרופורזה המאפשרת למאגר למחזר את המתח הגבוה ואחוז גבוה ג'ל אגרוס מפריד ביעילות את שברי ה-DNA על סמך צורתם כמו גם גודלם. צורות לא ליניאריות עוברות לאט יותר דרך הממד השני לאחר אלקטרופורזה. שוטפים את הג'ל במים פעם אחת ואז שוטפים אותו פעמיים ב -400 מיליליטר של חומצה הידרוכלורית 0.25 מולרית למשך 15 דקות בתסיסה עדינה.
שטיפות החומצה משמשות לחיתוך חלקי של מולקולות ה-DNA לשברים קטנים יותר המועברים ביעילות רבה יותר במהלך הניתוח הדרומי והם נחוצים בשל הגודל הגדול והצורה יוצאת הדופן של מתווכי שכפול ה-DNA. להכנת הג'ל להעברת אלקלי, יש לשטוף את הג'ל שוב במים, ואז לשטוף אותו פעמיים ב -400 מיליליטר של 0.4 נתרן הידרוקסיד מולארי למשך 30 דקות. לאחר מכן, ה-DNA בג'לים מועבר לקרום קשר גבוה n בתוספת ניילון באמצעות מערכת העברת אלקלי כלפי מטה עם 0.4 נתרן הידרוקסיד מולארי כמתואר בחלק הכתוב של הליך זה, תן להעברת ה-DNA במשך שש עד 12 שעות לאחר העברת ה-DNA להמשיך בהכלאת בדיקה כמתואר בפרוטוקול הכתוב.
לאחר שהקרום נבדק ונשטף, הניחו את הממברנה על מגבת נייר עד שהנוזל נעלם באופן גלוי. לאחר מכן עטפו את הממברנה בניילון פוליוויניל כלוריד וחשפו אותה למסך הדמיית פוספו. לבסוף, ניתן לדמיין ולכמת את הרדיואקטיביות באמצעות סערה שמונה 40 וכמות התמונה הקשורה אליה.
דפוס הנדידה של PV שני פלסמיד PBR 3 22 מעוכל שנצפה על ידי ניתוח ג'ל דו-ממדי מתואר. פלסמידים ליניאריים שאינם משכפלים פועלים כשבר ליניארי של 4.4 KB המשכפל את צורת הפלסמיד מבנים בצורת Y הנודדים לאט יותר מהשברים שאינם משכפלים בשל גודלם הגדול יותר וצורתם הלא ליניארית. דפוס נדידה זה יוצר קשת המשתרעת מהאזור הליניארי לכיוון הבאר לאחר קרינת UV.
מולקולות כפולות בצורת Y או X נצפות באזור החרוט ונודדות לאט יותר מהקשת של מולקולות בצורת Y. דוגמה לניתוח הדרומי של הג'ל הדו-ממדי שנבדק עם P 32 שכותרתו PBR 3 22 מוצגת עבור תאים מיד לאחר קרינת UV ו-15 דקות לאחר קרינת UV מיד לאחר קרינת UV. כ-1% מכלל ה-DNA של הפלזמה ניתן למצוא בקשת Y כאשר תאים גדלים במהירות בשלב אקספוננציאלי בעקבות קרינה.
עלייה חולפת במולקולות בצורת YS נצפית כאשר מזלגות שכפול חסומים מצטברים באתרים פגומים. מתווכי השכפול בצורת L גם הם באופן חולף, מצטברים ונמשכים עד לזמן המתואם עם תיקון הנגעים. זה עתה הראינו לך כיצד לדמיין חומרי ביניים לתיקון DNA באמצעות אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב להיות מודעים לכוחות גזירה שיכולים להפחית את התשואה ולהיות עדינים עם כל הדגימות והג'לים. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג נוהל להדמיית מרווחים מבניים של DNA המתרחשים במהלך שכפול בעת מפגש עם נגעי DNA, במיוחד לאחר הקרנת UV. השיטה משתמשת בניתוח ג'ל אגרוז שני מימדים כדי לזהות את המרווחים הללו.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- שכפול DNA
- תגובת נזקי DNA
- אלקטרופורזה בג'ל
רקע
- השכפול יכול להיות מופרע על ידי נגעי DNA.
- הבנת המבנה של מרווחים של שכפול חיונית לחקר מנגנוני תיקון DNA.
- ניתוח ג'ל דו מימדי מאפשר הפרדה מפורטת של שברי DNA.
- הקרנת UV היא שיטה נפוצה לגרימת נזקי DNA בתנאים ניסויים.
מטרת המחקר
- להדמיית מרווחים מבניים של DNA במהלך שכפול.
- להעריך את ההשפעה של נגעי DNA על תהליכי השכפול.
- להדגים את הצטברות מרווחי תיקון DNA במוטציות מסוימות.
שיטות ששימשו
- בידוד DNA מתאים מתחלקים באופן פעיל עם נגעים מושרים.
- הפרדת DNA באמצעות אלקטרופורזה בג'ל על בסיס גודל.
- הפרדה נוספת של נתיבים בג'ל שני לצורך הפרדה נוספת לפי גודל וצורה.
- ניתוח Southern להדמיית מבני DNA הקשורים בשכפול.
תוצאות עיקריות
- הדמייה מוצלחת של מרווחי DNA לאחר נזק UV.
- זיהוי של שינויים מבניים ב-DNA עקב נגעים.
- הוכחה להצטברות של מרווחי תיקון במוטציות מסוימות.
- הדגמה של יעילות ניתוח הג'ל הדו מימדי בחקר שכפול DNA.
מסקנות
- הנוהל חושף ביעילות את הדינמיקה של שכפול DNA בנוכחות נזק.
- התובנות שהושגו יכולות להדריך מחקרים עתידיים על מנגנוני תיקון DNA.
- שיטה זו ניתנת ליישומים במגוון מודלים של נזקי DNA.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Visualizing DNA replication intermediates provides mechanistic insight into how cells respond to genotoxic stress, informing target validation in DNA damage response pathways. This approach supports preclinical de-risking by linking molecular phenotypes to repair kinetics, enabling predictive confidence in therapeutic strategies targeting replication stress. The method’s applicability to bacterial models allows early-stage interrogation of conserved mechanisms relevant to mammalian systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing replication fork dynamics following UV-induced DNA damage.
- Operational Value: Clarifies functional roles of gene products like RecA and RecF pathway components in lesion processing.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating intermediate persistence with nucleotide excision repair activity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, shape- and size-resolved DNA outputs suitable for standardization across experimental conditions.
- Reproducibility: Two-dimensional gel separation reduces variability by resolving intermediates based on both size and conformation.
- Screening Utility: Facilitates comparison of replication intermediate profiles between wild-type and repair-deficient strains.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Provides a disease-relevant system for studying replication stress mechanisms conserved from bacteria to humans.
- Translational Continuity: Links UV-induced lesion removal kinetics to replication intermediate resolution, mirroring nucleotide excision repair timelines.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes transient fork reversal from pathological intermediate accumulation, informing go/no-go decisions in pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing in DNA repair biology prior to lead identification stages.
- Discovery Biology: Tests mechanistic models of replication fork behavior under genotoxic stress using structural readouts.
- Screening: Delivers assay-ready, quantifiable DNA structures enabling side-by-side comparison of genetic backgrounds.
- Analytics: Produces migration-pattern data that reflect changes in DNA shape and size, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects bacterial replication intermediate dynamics to conserved eukaryotic repair pathways when lesion removal correlates with intermediate resolution.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating genetic or chemical modulators of replication fidelity across multiple damage models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in replication repair by directly visualizing lesion-induced intermediates.
- Operational Value: Standardizes detection of replication-associated DNA structures through gel-based size and shape separation.
- Strategic Value: Improves pathway-level go/no-go decisions by linking intermediate accumulation to repair proficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in lesion-processing assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in DNA isolation, gel electrophoresis, and southern blotting techniques.
- Dependent on access to UV irradiation equipment and radiolabeling or detection systems for nucleic acids.
- Necessitates standardized sample handling to minimize shearing of fragile replication intermediates.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol from plasmid-based bacterial models to other systems.
- Practical limitations include low abundance of intermediates and requirement for synchronized cell populations to detect transient species.
