ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג'ל ניתוח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את תוצרי הביניים המבניים של ה-DNA המתרחשים כאשר שכפול נתקל בנגעי DNA באמצעות ניתוח ג'ל דו מימדי. זה מושג על ידי בידוד ה-DNA תחילה מתאים מתחלקים באופן פעיל בהם הושרו נגעים חוסמי שכפול. לאחר מכן משתמשים באלקטרופורזה של ג'ל כדי להפריד את ה-DNA המשוחזר על סמך גודל.

לאחר מכן, הנתיבים נחתכים ויוצקים מחדש אופקית בג'ל שני המפריד עוד יותר את ה-DNA על סמך גודל וצורה. לבסוף, ניתוח דרומי משמש להמחשת מבני ה-DNA הקשורים לשכפול שברי DNA בזמנים לפני ובזמנים שונים לאחר הכנסת נזק הנגרם על ידי UV. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהליך זה כדי להראות שחוסר היכולת לעבד נגעי DNA במוטציות מסוימות מביא להצטברות של חומרי ביניים לתיקון DNA.

היי, שמי ארתור איאן. אני ממעבדת קורלה באוניברסיטת פורטלנד סטייט. היי, שמי ברנד היא, גם אני ממעבדת קורלה.

היום אנו הולכים להראות לכם הליך לאלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור שכפול DNA ותיקון מתווכים. אז בואו נתחיל.

כדי להתחיל בהליך זה, גדל תרבית לילה של 200 מיקרוליטר של אי קולי המכילה את הפלסמיד PBR 3 22 במדיום ירך DGC עם אמפיצילין ב-37 מעלות צלזיוס. השימוש במדיום ירך DGC ממזער את מיגון ה-UV. לאחר הדגירה של הלילה יש לגלול את התאים ב-14,000 RRP M למשך 30 שניות.

לאחר מכן השעו מחדש את כדור התא ב -200 מיקרוליטר של מדיום DG C החסר אמפיצילין וחיסון. 20 מיליליטר של מדיום ירך DG C מגדלים תרביות ללא בחירת אמפיצילין. באינקובטור רועד ב-37 מעלות צלזיוס עד OD 600 של 0.5, המקביל בערך פי חמישה פי 10 לשמינית התאים, גידול למיליליטר ללא אמפיצילין מונע ברירה כנגד מתווכי שכפול חריגים או לא פרודוקטיביים שעלולים להיווצר במוטציות מסוימות.

בנוסף, אם משתמשים באור UV כדי לגרום נזק, הסרת האמפיצילין מהמדיה נחוצה מכיוון שהוא נספג חזק באורכי גל ומגנים אלה. התאים מפחיתים את המינון האפקטיבי של UV בזמן שהתאים גדלים. השתמש בפוטומטר UVC כדי לקבוע את המרחק ממנורה קוטל חיידקים של 15 וואט המייצרת קצב חשיפה של כ-JUUL אחד למטר מרובע לשנייה.

יש לבצע את השלבים הבאים באור צהוב מכיוון שהדבר ימנע היפוך הפעלה מחדש של ציקלו, בוטאן פרין דימרים על ידי פוטו ליאז, לאחר הקרנת UV. לאחר הגעה לצפיפות התאים הרצויה, השתמש בפיפטה כדי להעביר את התרבית לצלחת פטרי בקוטר 15 סנטימטר על פלטפורמה מסתובבת כדי להבטיח הקרנה אחידה של כל אוכלוסיית התאים. לאחר מכן, הקרינו את התרביות ב -50 ג'אול למטר בריבוע והעבירו אותם מיד לבקבוק סטרילי חם מראש והחזירו אותם לאינקובטור הרועד של 37 מעלות צלזיוס.

במשך הניסוי, מינון זה מייצר בממוצע דימר ציקלו בוטאן פרין אחד, כל 4.5 קילו-בסיסים של DNA חד-גדילי עבור כל נקודת זמן שיש לבדוק. פיפטה של 0.75 מיליליטר של התרבית לתוך 0.75 מיליליטר של רשת קרה כקרח 30. רשת חיץ 30 משמשת כמאגר עצירה המונע את המשך השכפול ותיקון כריתת נוקלאוטיד.

לאחר הוספת מאגר העצירה, ניתן לשמור את הדגימה על הקרח עד סוף מהלך הזמן. לאחר מהלך הזמן גלולה כל דגימה והשעו מחדש את הכדורים. ב -150 מיקרוליטר של מאגר ליזה מפרקים את התאים ב -37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ללא תסיסה.

מכיוון שמבנים משוכפלים עם אזורי גדיל בודד או נקודות הסתעפות רגישים יותר לגזירה של קצות פיפטה חתוכים בעזרת סכין גילוח כדי להרחיב את הפה ולמזער את כוחות הגזירה. באופן כללי, יש לשמור על פיפטינג ותסיסה למינימום עד לאחר עיכול ה- DNA עם אנזימי הגבלה, לאחר ליזה, להוסיף פרוטאינאז K ותא סרקס ולאפשר לדגירה להימשך שעה. זה משמש לשחרור שברי DNA הקשורים לחלבון.

מכיוון ששכפול פעיל של DNA קשור לעתים קרובות לקומפלקסים של חלבון או ממברנה, זה עוזר להגדיל את התשואה של שברי שכפול. לאחר שעה, חלץ את הדגימות על ידי הוספת שני נפחים של פנול לכל דגימה והיפוך עדין של הצינורות למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסיפו שני נפחים של כלורופורם, איזואמיל, אלכוהול, והפכו בעדינות את הצינורות למשך חמש דקות נוספות.

לאחר מכן, צנטריפוגה של הדגימות ב-14,000 סל"ד במיקרו-צנטריפוגה למשך חמש דקות והעבירו את השלב המימי העליון של כל דגימה לצינור טרי. לאחר מכן הוסיפו ארבעה נפחים של אלכוהול ISO כלורופורם, ושוב, הפכו בעדינות את הצינורות למשך חמש דקות. צנטריפוגה את הדגימות שוב ב-14,000 סל"ד למשך חמש דקות.

הניחו קרום דיאליזה על גבי 250 מיליליטר של 0.1 xte בכוס והשליכו 100 מיקרוליטר מכל דגימה על הממברנה. תן לדגימות לעבור דיאליזה במשך שעה לאחר הדיאליזה. מניחים 80 מיקרוליטר מכל דגימה בשפופרת טרייה של 1.5 מיליליטר המכילה 20 מיקרוליטר תערובת אנזימים.

עכל את הדגימות למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. PV שני ליניארי את הפלסמיד ממש במורד הזרם ממקור השכפול. לפני העמסת ג'ל האגרוס יש להוסיף 100 מיקרוליטר כלורופורם ו-20 מיקרוליטר של שישה x צבע טעינה המכיל ברומו.

פנול כחול וקסילן ציאן לכל דגימה וערבוב כלורופורם יפשיט את כל ה-PV שנותר שניים הקשורים לקצוות ה-DNA. התחל בניתוח ג'ל ארוס דו מימדי על ידי העברת דגימות ה-DNA המוגבלות דרך הממד הראשון. ראשית טען טוש אחורי של למבדה בשלושה גדלים לנתיב הראשון של ג'ל אגרוס 0.4% שהוכן בעבר ב-XTBE אחד.

לאחר מכן טען 40 מיקרוליטר מהשלב המימי המכיל את צבע ההעמסה עבור כל דגימה, ודלג על נתיבים כדי להקל על חיתוך הג'ל. לאחר אלקטרופורזה, הפעל את הממד הראשון בוולט לסנטימטר אחד למשך כ-12 עד 15 שעות. ג'ל ה-AGROS במתח נמוך ובאחוז נמוך משמש להפרדת שברי ה-DNA בעיקר על סמך הגודל.

לאחר שהממד הראשון רץ, השתמש בסכין קצבים גדולה כדי לחתוך את הנתיב הראשון המכיל את הסמן האחורי של למבדה ולהכתים באת'ריום ברומיד. עבור הממד השני, פורסים את נתיבי הג'ל באמצעות סכין הקצבים הגדולה באמצעות סמן שלושת ה-Lambda Hind כגידול מנחה והשליכו את האזור שמתחת למקום שבו צפוי הפלסמיד הליניארי לרוץ בכל נתיב. כדי להטיל את הממד השני, הנח כל פרוסה אופקית על פני החלק העליון של גלגלת ג'ל ריקה.

מכינים תמיסה של 1% AROS ב-XTBE אחד ומצננים ל-55 מעלות צלזיוס. לאחר שהתקרר, שפכו פנימה את תמיסת הג'ל כדי ליצוק את הממד השני, והקפידו לכסות לחלוטין את פרוסות הג'ל. חשוב לוודא שהפרוסות מכוונות באופן שווה ואת מפלס הקיק לפני ששופכים את הג'ל.

לאחר שהג'ל התייצב, הפעל את הממד השני, חמש וחצי עד שבע שעות ב-6.5 נפחים לסנטימטר ביחידת אלקטרופורזה המאפשרת למאגר למחזר את המתח הגבוה ואחוז גבוה ג'ל אגרוס מפריד ביעילות את שברי ה-DNA על סמך צורתם כמו גם גודלם. צורות לא ליניאריות עוברות לאט יותר דרך הממד השני לאחר אלקטרופורזה. שוטפים את הג'ל במים פעם אחת ואז שוטפים אותו פעמיים ב -400 מיליליטר של חומצה הידרוכלורית 0.25 מולרית למשך 15 דקות בתסיסה עדינה.

שטיפות החומצה משמשות לחיתוך חלקי של מולקולות ה-DNA לשברים קטנים יותר המועברים ביעילות רבה יותר במהלך הניתוח הדרומי והם נחוצים בשל הגודל הגדול והצורה יוצאת הדופן של מתווכי שכפול ה-DNA. להכנת הג'ל להעברת אלקלי, יש לשטוף את הג'ל שוב במים, ואז לשטוף אותו פעמיים ב -400 מיליליטר של 0.4 נתרן הידרוקסיד מולארי למשך 30 דקות. לאחר מכן, ה-DNA בג'לים מועבר לקרום קשר גבוה n בתוספת ניילון באמצעות מערכת העברת אלקלי כלפי מטה עם 0.4 נתרן הידרוקסיד מולארי כמתואר בחלק הכתוב של הליך זה, תן להעברת ה-DNA במשך שש עד 12 שעות לאחר העברת ה-DNA להמשיך בהכלאת בדיקה כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

לאחר שהקרום נבדק ונשטף, הניחו את הממברנה על מגבת נייר עד שהנוזל נעלם באופן גלוי. לאחר מכן עטפו את הממברנה בניילון פוליוויניל כלוריד וחשפו אותה למסך הדמיית פוספו. לבסוף, ניתן לדמיין ולכמת את הרדיואקטיביות באמצעות סערה שמונה 40 וכמות התמונה הקשורה אליה.

דפוס הנדידה של PV שני פלסמיד PBR 3 22 מעוכל שנצפה על ידי ניתוח ג'ל דו-ממדי מתואר. פלסמידים ליניאריים שאינם משכפלים פועלים כשבר ליניארי של 4.4 KB המשכפל את צורת הפלסמיד מבנים בצורת Y הנודדים לאט יותר מהשברים שאינם משכפלים בשל גודלם הגדול יותר וצורתם הלא ליניארית. דפוס נדידה זה יוצר קשת המשתרעת מהאזור הליניארי לכיוון הבאר לאחר קרינת UV.

מולקולות כפולות בצורת Y או X נצפות באזור החרוט ונודדות לאט יותר מהקשת של מולקולות בצורת Y. דוגמה לניתוח הדרומי של הג'ל הדו-ממדי שנבדק עם P 32 שכותרתו PBR 3 22 מוצגת עבור תאים מיד לאחר קרינת UV ו-15 דקות לאחר קרינת UV מיד לאחר קרינת UV. כ-1% מכלל ה-DNA של הפלזמה ניתן למצוא בקשת Y כאשר תאים גדלים במהירות בשלב אקספוננציאלי בעקבות קרינה.

עלייה חולפת במולקולות בצורת YS נצפית כאשר מזלגות שכפול חסומים מצטברים באתרים פגומים. מתווכי השכפול בצורת L גם הם באופן חולף, מצטברים ונמשכים עד לזמן המתואם עם תיקון הנגעים. זה עתה הראינו לך כיצד לדמיין חומרי ביניים לתיקון DNA באמצעות אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב להיות מודעים לכוחות גזירה שיכולים להפחית את התשואה ולהיות עדינים עם כל הדגימות והג'לים. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.