Name: ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose גל ניתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: למד לדמיין מבנים ביניים של DNA בשכפול לאחר נזק UV ב-E. coli באמצעות אלקטרופורזה דו-ממדית באגרוז. שיטה זו מאפשרת לחקור תהליכי תיקון DNA ולהבין את השפעת הנזק על שכפול התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדה שלנו נתמך על ידי אות הקריירה MCB0551798 מן הקרן הלאומית למדע אזור להעניק R15GM86839 מן NIGMS-NIH.

1. צמיחה הקרנת UV. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200μl של תרבות לילה טרי פלסמיד המכיל את pBR322 גדל דייויס בינוני 1 בתוספת גלוקוז 0.4%, 0.2% חומצות casamino, ו -10 מיקרוגרם / מ"ל תימין (בינוני DGCthy) ו -100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין הוא pelleted. התא הוא גלולה resuspended אז בינוני DGCthy 200μl חסר אמפיצילין ומשומשים לחסן 20 מ"ל של מדיום DGCthy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות גדלים ללא בחירה אמפיצילין ב חממה רועד ב 37 ° C עד 600 OD של 0.5 (~ 5 x 10 8 תאים / מ"ל). צמיחה ללא אמפיצילין נמנע מבחר ביניים נגד שכפול חריגה או יצרניים שעלולות להתעורר בתוך כמה מוטציות. בנוסף, אם באמצעות אור UV כדי לגרום נזק, הסרת אמפיצילין מהתקשורת הוא הכרחי משום שהוא סופג בתוקף על אורכי גל אלה מגינים על התאים, להפחית את המינון האפקטיבי של UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה תחת אורות צהובים, התרבות ממוקם צלחת בקוטר 15 ס"מ פטרי על פלטפורמה מסתובבת על תסיסה. התרבויות שלנו ממוקמות במרחק מנורה 15 וואט קוטל חידקים שמייצר שיעור החשיפה של ~ 1 J/m2/sec, הנמדד באמצעות פוטומטר UVC. תרבויות הם מוקרן עם 50 J/m2 ואז להציב מיד בחזרה לתוך רעד 37 ° C החממה למשך הניסוי. מינון זה מייצר, בממוצע, 1 cyclobutane פירימידין dimer כל 4.5 קילו של ssDNA. תאורה צהובה מונע photoreactivation-היפוך של הדימרים פירימידין cyclobutane ידי photolyase. </li></ol> 2. בידוד ה-DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפעמים כאשר ביניים שכפול הם להיבדק, aliquot 0.75 מ"ל של התרבות מכניסים 0.75 הצפת מ"ל קרח קר NET30 (100 mM NaCl, 10 mM טריס, pH 8.0, 30 mM EDTA) והניח על הקרח עד סוף את הקורס הזמן. אנחנו בדרך כלל להפעיל כמובן זמן 90 דקות, עם דגימות שנבדקו על 0, 15, 30, 45, 60, ו - 90 דקות. EDTA וטמפרטורה קרה לשרת ביעילות להפסיק שכפול ותיקון כריתה נוקלאוטיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם כל כך pelleted, resuspended ב μl 150 ליזוזים של 1.5 מ"ג / מ"ל ​​ו - 0.2 מ"ג / מ"ל ​​RNaseA ב TE (10 mM טריס, pH 8.0, 1 mM EDTA), ו lysed על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. בשלב זה, 10μl של proteinase K (10mg/ml) ו 10μl sarkosyl של 20% נוספים ואת הדגירה הוא הורשה להמשיך עבור שעות 1. Proteinase K ו sarkosyl לעזור לשחרר את שברי דנ"א עשויה להיות קשורה הממברנה או חלבונים לפני מיצוי פנול מתרחשת. מאז שכפול ה-DNA באופן פעיל כרוכה לעתים קרובות קומפלקסים חלבונים או קרום, זה עוזר להגדיל את התשואה של שברי שכפול, כי הם החלימו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות המחולצים אז על ידי הוספת 2 כרכים של פנול לטעום כל הצינורות הם הפוכים בעדינות במשך 5 דקות. ואז 2 כרכים של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (24 / 1) מתווספות ואת צינורות הם הפוכים בעדינות שוב במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות centrifuged ב 14,000 סל"ד ב microcentrifuge במשך 5 דקות ואת השלב מימית העליון של המדגם כל מוסר, והניח לתוך צינור טריים. אז 4 כרכים של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (24 / 1) מתווספות, הצינורות הם הפוכים בעדינות במשך 5 דקות, centrifuged שוב 14,000 סל"ד במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב העליון, מימית במדגם כל dialyzed מכן על ידי תצפית 100μl המדגם על כל דיסק 47mm 0.025 מיקרומטר Whatman הנקבוביות אשר צף על 250 מ"ל של 0.1X TE בכוס במשך שעה 1. בגלל מבנים שכפול עם אזורים גדיל בודד או נקודות סניף רגישים יותר גז, אנחנו בדרך כלל לגזור את קצות פיפטה שלנו עם סכין גילוח לעשות פה יותר ולמזער את כוחות הגזירה. באופן כללי, pipetting צריך להישמר עד למינימום עד אחרי ה-DNA כבר מעוכל עם אנזימי הגבלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם כל מעוכל לאחר מכן עם PvuII (ניו אינגלנד Biolabs) אשר linearizes הפלסמיד רק במורד הזרם מן המקור של שכפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני העמסה של ג'ל agarose, 100μl כלורופורם 20μl של צבע טעינת 6X המכיל Cyanol כחול קסילן Bromophenol מתווספים מדגם כל מעורבות. ואז, 40μl השלב מימית המכילה את צבען טוען הוא נטען לתוך הג'ל. כדי למזער הטיות מבניות, חפצים מבניות, הגז DNA, הליך זה הבידוד אינו כולל את השלבים הבאים כדי להעשיר עבור אזורים גדיל בודד, נמהרת, או לרכז את דגימות DNA לאחר תמוגה התא. </li></ol> 3. 2D ג'ל וניתוח הדרום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מימדי agarose ג'ל ניתוח הוא שונה מ 3. עבור ממד -1, דגימות ה-DNA מוגבל מופעלים באמצעות 0.4% agarose ג'ל 1X TBE ב 1V/cm. ליטר אחד של פתרון TBE 10X מניות מכילה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 108 גרם טריס Base </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 55 גרם חומצת בור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 מ"ל 0.5m EDTA (pH 8.0) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן הינד למבדה III גודל נטען במסלול הראשון, ואז דגימות נטענים בכל שביל אחר. אנחנו בדרך כלל בטווח ד firstimension ~ 12-15 שעות. דילוג על נתיבי מקלה על הפרוסה נתיבים החוצה להטיל בממד השני. מתח נמוך נמוך אחוז agarose ג'ל משמש כדי להפריד בין קטעי דנ"א מבוססת בעיקר על גודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הממד השני, נתיבי ג'ל הם פרוסים מתוך ג'ל הממד הראשון באמצעות סכין קצבים גדול. במסלול הראשון המכיל את סמן למבדה הינד III יכול להיות מוכתם ברומיד ethidium. באמצעות סמן למבדה הינד III כמו יבול מדריך, וזורקים את האזור של ג'ל כי הוא מתחת היכן הפלסמיד לינארית צפוי לרוץ. בתנאים אלה, אנו מוצאים כי pBR322 לינארית רץ מעט מעל cyanol קסילן הכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפיל את הממד השני, נתיב אחד ממוקם בצורה אופקית לרוחב החלק העליון של גלגלית ג'ל ריקה. הפתרון של agarose 1.0% ב 1X TBE מוכן ומקורר עד 55 ° C. בשלב זה, הפתרון הוא ג'ל זרמו להטיל את המימד השני, מוודא כדי לכסות לחלוטין את פרוסות ג'ל. לאחר ג'ל הציבה, היא לרוץ 6.5V/cm ביחידה אלקטרופורזה המאפשר למאגר כדי recirculate. אנחנו בדרך כלל להפעיל את המימד השני ~ 5.5-7 שעות. מתח גבוה גבוה אחוז agarose ג'ל ביעילות המפריד בין שברי DNA המבוססת על הצורה שלהם, כמו גם גודל. צורות קוי לרוץ יותר לאט דרך הממד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אלקטרופורזה, הג'ל היא שטפה אז H 2 O, שטף פעמיים 400ml של חומצה הידרוכלורית 0.25M במשך 15 דקות, לשטוף עם H 2 O;, ורחץ אז פעמיים 400 מ"ל 0.4M NaOH במשך 30 דקות. חומצה שוטף לשרת באופן חלקי ניק מולקולות DNA לרסיסים קטנים יותר להעביר בצורה יעילה יותר. צעד זה הוא הכרחי בשל גודל גדול של צורות יוצא דופן ביניים שכפול הדנ"א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדנ"א של הג'לים הוא הועבר לאחר מכן N Hybond + קרום ניילון 4. אנו משתמשים במערכת מטה העברת אלקלי עם NaOH 0.4M. בקצרה, שני גיליונות נייר סופג ספוג 0.4M NaOH ממוקמות על ערימה גדולה של מגבות נייר. הממברנה ניילון ספוגה גם 0.4M NaOH והניח על גבי נייר סופג. הג'ל הוא אז שכבתית בזהירות על גבי זה, ואחריו עוד חתיכה של נייר סופג, הרטובות בפתרון NaOH. לבסוף, חתיכה ארוכה של נייר סופג הרטובות היא שכבתית לרוחב החלק העליון ואת שני הקצוות שלה ממוקמים לתוך מנות המכיל 1 ליטר של תמיסת NaOH 0.4M לשמש הפתיל. אנחנו בדרך כלל לאפשר את העברת ה-DNA של 6-12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום ניילון מוסר, שטף 20-30 שניות בתוך מאגר SSC 5X, והניח בתוך בקבוק הכלאה רולר המכיל פתרון Prehybridization 10.5ml. ואז, הממברנה היא מודגרות ב 42 ° C עם רוטציה יותר 6hrs. Prehybridization פתרון: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5.0 מ"ל לפוראמיד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 מ"ל 20% SDS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 מ"ל 20X SSC * </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.0 מ"ל של 50X Denhardt * </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 0.5 מ"ל סלמון DNA (10mg/ml) * מתכונים SSC ו Denhardt זה ניתן למצוא 5 </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך התקופה prehybridization, 1 מיקרוגרם של pBR322 פלסמיד התווית 32P בתרגום הכינוי לפי הפרוטוקול מסופק על ידי אלפא רוש באמצעות שכותרתו [32-P], dCTP. החללית radiolabeled (100μl) הוא מפוגל ידי דוגרים על 98 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בתוך צינור כובע בורג microcentrifuge, ולאחר מכן הניח מיד על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החללית מפוגל מתווסף פתרון 5.9 מ"ל הכלאה, אשר מכיל: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.0 מ"ל לפוראמיד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 מ"ל SSC </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.0 מ"ל H 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.15 מ"ל של 50X Denhardt </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.10 מ"ל 20% SDS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.15 מ"ל זרע 10mg/ml סלמון DNA </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון prehybridization נמזג מהבקבוק הרים את הפתרון הכלאה הוא שפך פנימה בקבוק רולר הוא חזר אז על 42 מעלות צלזיוס חממה וסובב יותר 12hrs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון הכלאה נמזג מהבקבוק הרים. ואז, כתם הוא שטף 4 פעמים למשך 20 דקות בבקבוק 150 מ"ל עם רולר ~ של פתרון לשטוף המכיל SSC 0.5X, SDS 0.1% ב 42 ° C עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לשטוף האחרון, קרום מושם על מגבת נייר עד הנוזל נעלם לעין. הממברנה הוא עטוף מכן לעטוף פוליוויניל כלוריד, פלסטיק חשוף למסך phosphorimager. אנו לחזות ולכמת את הרדיואקטיביות באמצעות סטורם 840 ותוכנה ImageQuant הקשורים אליו. </li></ol> 4. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ביניים שכפול פלסמיד נצפתה נוכחות והיעדר נזק UV-Induced DNA. הדפוס ההגירה של PvuII מתעכל pBR322 פלסמיד ציין ידי ניתוח 2D-agarose ג'ל הוא ניתח. Non-שכפול פלסמידים ליניארי לרוץ כמו שבר 4.4 קילו ליניארי. פלסמידים שכפול טופס בצורת האות V מבנים להעביר איטי יותר מאשר אי - שכפול שברי בשל גודל גדול שלהם לאnlinear צורה. דפוס ההגירה צורות קשת המשתרע מן האזור ליניארי לעבר הבאר. בעקבות UV-קרינה, פעמיים Y או X בצורת מולקולות הם נצפו באזור חרוט כי נודד לאט יותר מאשר קשת של Y בצורת מולקולות. דוגמה של ניתוח הדרומי של הג'ל 2D נחקר עם 32P שכותרתו pBR322 מוצג עבור תאים מיד לאחר הקרנת UV ו 15 דקות לאחר הקרנת UV (לשכפל באישור המו"ל).

<ol><li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li>
<li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li>
<li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li>
<li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22METHODS%3A+A+Companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning - A laboratory manual</a>. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li>
<li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork%3A+a+comparison+to+UV-induced+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecBCD+and+RecJ%2FRecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li>
<li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תוצאות אופייניות שהתקבלו תאים סוג בר בנוכחות והיעדר נזק UV-Induced מוצגים באיור 1. בהעדר נזק, ~ 1% מה-DNA של פלסמיד הכולל ניתן למצוא קשת Y כאשר התאים גדל במהירות בשלב מעריכי. בעקבות הקרנה, גידול חולפות מולקולות בצורת Y הוא ציין כמו מזלגות שכפול חסום לצבור באתרים שניזוקו. ה-X בצורת ביניים שכפול גם transiently מצטברים להתמיד עד אשר תואמת כאשר הנגעים הם תוקנו. במקום ניתוח הדרום ביניים שכפול ניתן אגרוף מתוך הג&#39;ל ...

<table><tbody><tr><td>דוגמה לניתוח Southern של ג'ל דו-ממדי שעבר היברידיזציה</td><td>GE Healthcare</td><td>G15T8</td><td>Yellow Lighting</td></tr><tr><td>מנורה קוטלת חיידקים בהספק 15 &amp;mu;watt</td><td>Sylvania</td><td>F20T12/GO</td><td>מנורת UV</td></tr><tr><td>מד עוצמת UV מדגם Blak-Ray 254nm</td><td>Daigger</td><td>EF28195T</td><td>פוטומטר UVC</td></tr><tr><td>דיסקיות נקבוביות בגודל 0.025 &amp;mu;m</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>VSWP04700</td><td>דיסקיות דיאליזה צפות</td></tr><tr><td>PvuII</td><td>Fermentas</td><td>ER0632</td><td>אנדונוקלאז הגבלה</td></tr><tr><td>ערכה להעברה בשיטת Nick-translation</td><td>Roche Group</td><td>976776</td><td>ליצירת גשוש מסומן ב-32P</td></tr><tr><td>נייר בלটিং</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-704</td><td>להעברה בשיטת Southern</td></tr><tr><td>ממברנת ניילון</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203S</td><td>להעברה בשיטת Southern</td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של uv-induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג&#39;ל ניתוח

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

שכפול מדויק בנוכחות נזק לדנ&quot;א אחראי על רוב rearrangements הסלולר mutagenesis נצפתה בכל סוגי התאים הוא האמין נרחב כדי להיות מקושר ישירות עם התפתחות של סרטן בבני אדם. נזק לדנ&quot;א, כגון זה הנגרם על ידי קרינת UV, קשות ביכולתם של שכפול לשכפל את הגנום תבנית מדויקת. מספר מוצרים הגן זוהו נדרשים כאשר שכפול ה-DNA מפגשים נגעים בתבנית. עם זאת, האתגר שנותר היה לקבוע כיצד החלבונים האלה נגעים במהלך תהליך השכפול<em&gt; In vivo</em&gt;. שימוש coli Escherichia כמודל למערכת, אנו מתארים תהליך בו שני ממדי agarose ג&#39;ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את התשומות מבניים שעולות על פלסמידים שכפול<em&gt; In vivo</em&gt; הבאים UV-Induced נזק לדנ&quot;א. הליך זה נעשה שימוש על מנת להוכיח כי מזלגות שכפול נחסם על ידי נזק UV-Induced עבר מהפך זמני, כי הוא התייצב על ידי RecA ומוצרי מספר גנים הקשורים מסלול RecF. הטכניקה מוכיח כי אלה ביניים שכפול נשמרות עד זמן זה בקורלציה עם הסרת נגעים על ידי תיקון כריתה נוקלאוטיד וקורות חיים שכפול.

אנו מציגים הליך שבאמצעותו דו מימדי agarose ג&#39;ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את מבנה ביניים שכפול המתרחשות בעקבות קרינה UV.

ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג&#39;ל ניתוח

שחזור לא מדויק בנוכחות נזק ל-DNA הוא האחראי לרוב העיבודים המבניים התאיים ולמוטגנזה הנצפות בכל סוגי התאים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להמחיש את תוצרי הביניים המבניים של ה-DNA המתרחשים כאשר השכפול נתקל בנגעי DNA, וזאת באמצעות אנליזת ג'ל דו-ממדית. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד ה-DNA מתאים המתחלקים באופן פעיל, שבהם הוּשרו נגעים החוסמים את השכפול. לאחר מכן, נעשה שימוש באלקטרופורזה של ג'ל כדי להפריד את ה-DNA שהופק על בסיס גודלו.בשלב הבא, נגזרים הנתיבים ומוטבעים מחדש באופן אופקי בתוך ג'ל שני, המבצע הפרדה נוספת של ה-DNA על בסיס הגודל והצורה כאחד. לבסוף, נעשה שימוש בניתוח Southern כדי להדמיאן את מבני ה-DNA הקשורים למקטעי DNA בשכפול, בנקודות זמן לפני ובזמנים שונים לאחר הפעלת נזק המושרה על ידי UV. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהליך זה כדי להראות כי חוסר יכולת לעבד נגעים ב-DNA במוטנטים מסוימים מוביל להצטברות של תוצרי ביניים של תיקון DNA.שלום, שמי ארתור איאן. אני ממעבדת Corella באוניברסיטת פורטלנד סטייט. שלום, שמי ברנד שי, גם אני ממעבדת Corella.היום נדגים לכם פרוצדורה של אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדית. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור תוצרי ביניים של רפליקציה ותיקון DNA. בואו נתחיל.כדי להתחיל בהליך זה, גדלו תרבית לילה של 200 microliter של e coli המכילה את הפלסמיד PBR 3 22 במצע DGC thigh עם ampicillin בטמפטורה של 37 degrees Celsius. השימוש במצע DGC thigh ממזער את מיסוך ה-UV. לאחר דגירה למשך לילה, השקיעו את התאים ב-14, 000 RRP M למשך 30 שניות.לאחר מכן, השביה מחדש את משקע התאים ב-200 µL של מצע DG C ללא ampicillin ובצע הזרקה. גדל תרביות ב-20 milliliters של מצע DG C ללא ברירה באמצעות ampicillin, באינקובטור עם ניעור ב-37 °C עד להגעה ל-OD 600 של 0.5, המקביל לכ-5 × 10⁸ תאים למיליליטר. גידול ללא ampicillin מונע ברירה נגד תוצרי ביניים של רפליקציה לא תקינים או לא יעילים שעשויים להיווצר בחלק מהמוטנטים.בנוסף, במידה ומשתמשים באור UV להשראת נזק, יש להסיר את האמפיסילין מהמצע מכיוון שהוא בולע חזק באורכי גל אלה ומהווה הגנה עבור התאים, ובכך מפחית את מינון ה-UV האפקטיבי בזמן גדילת התאים. השתמשו בפוטומטר UVC כדי לקבוע את המרחק מנורה קוטלת חיידקים של 15 watt המפיקה קצב חשיפה של כ-one JUUL למטר רבוע לשנייה.יש לבצע את השלבים הבאים תחת תאורה צהובה, שכן הדבר ימנע הפיכה של דימרים של cyclo butane perine על ידי photo liase לאחר הקרנה ב-UV. עם הגעה לצפיפות התאים הרצויה, השתמש בפפית כדי להעביר את התרבית לצלוחית פטרי בקוטר 15 סנטימטר על פלטפורמה מסתובבת, כדי להבטיח הקרנה אחידה של כל אוכלוסיית התאים. לאחר מכן, הקרן את התרביות ב-50 joules per meter squared והעבר אותן מיד לבקבוק סטרילי שחומם מראש, והחזר אותן לדגרה הרוגשת ב-37 degrees Celsius.במהלך הניסוי, מינון זה מייצר בממוצע דימר אחד של cyclobutane pyrimidine, בכל 4.5 kilobases של DNA גדילי, עבור כל נקודת זמן שיש לבחון. העבירו בפיפטה מנה של 0.75 milliliter מהתרבית לתוך 0.75 milliliters של באפר net 30 קר מאוד. באפר net 30 משמש כבאפר עצירה המונע מהשכפול ומתיקון חיתוך נוקלאוטידים (nucleotide excision repair) להמשיך.לאחר הוספת באפר העצירה, ניתן לשמור את הדגימה על קרח עד לסיום מסלול הזמן. עם סיום מסלול הזמן, יש לצנטריפוג כל דגימה להשגת משקע ולפתוח מחדש את המשקעים. יש לבצע ליזיס לתאים ב-150 microliters של באפר ליזיס בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 20 דקות ללא ערבוב.מכיוון שמבנים משוכפלים בעלי אזורי גדיל יחיד או נקודות פיצול רגישים יותר לשבירה, יש לחתוך את קצות התכשירים של הפיפטה בעזרת להב תער כדי להרחיב את הפתח ולמזער את כוחות השבירה. באופן כללי, יש להמעיט בפיפטינג ובערבול עד לאחר עיכול ה-DNA באמצעות אנזימי הגבלה; לאחר הליזיס, יש להוסיף proteinase K ו-sarcas cell ולאפשר לדגירה להימשך שעה אחת. פעולה זו משמשת לשחרור מקטעי DNA הקשורים לחלבון.מכיוון ש-DNA בשעת שכפול פעיל קשור לעיתים קרובות למתחמי חלבון או ממברנה, דבר זה מסייע להגדיל את תנובת מקטעי השכפול. לאחר שעה, הוצא את הדגימות על ידי הוספת שני נפחים של פנול לכל דגימה והפיכה עדינה של המבחנות במשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף שני נפחים של כלורופורם, איזואמיל אלכוהול, והפך בעדינות את המבחנות למשך חמש דקות נוספות.בשלב הבא, סובב את הדגימות בצנטריפוגת מיקרו במהירות של 14,000 RPM למשך חמש דקות והעבר את הפאזה המימי העליונה של כל דגימה למבחנה נקייה. לאחר מכן, הוסף ארבעה נפחים של תמיסת כלורוכלורול-איסו-אלכוהול, ושוב, הפי את המבחנות בעדינות למשך חמש דקות. סובב את הדגימות פעם נוספת בצנטריפוגה במהירות של 14,000 RPM למשך חמש דקות.הניחו ממbranת דיאליזה מעל 250 milliliters של 0.1 xte בכ كأس, וטפטפו 100 microliters מכל דגימה על גבי הממברנה. הניחו לדגימות לעבור דיאליזה במשך שעה אחת לאחר תחילת התהליך. העבירו 80 microliters מכל דגימה לפ menutup 1.5 milliliter נקי המכיל 20 microliters של תערובת אנזימים.בצעו עיכול של הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. PV two מקיימת ליניאריזציה של הפלסמיד מיד לאחר מקור השכפול. לפני טעינת ג'ל האגרוז, הוסיפו 100 µL כלורופורם ו-20 µL צבע טעינה בריכוז six x המכיל ברומו.הוסף Phenol blue ו-xylene cyan לכל דגימה וערבב; כלורופורם יסיר כל PV two שנותר קשור לקצות ה-DNA. התחל בניתוח ג'ל אגרוז דו-ממדי על ידי הרצת דגימות ה-DNA שהגבילו בממד הראשון. ראשית, טען סמן גודל Lambda hind three לנתיב הראשון של ג'ל אגרוז 0.4% שהוכן מראש ב-one XTBE.לאחר מכן, טענו 40 µL של הפאזה המימית המכילה את צבע הטעינה עבור כל דגימה, תוך השארת נתיבים ריקים כדי להקל על חיתוך הג'ל. לאחר האלקטרופורזה, הריצו את הממד הראשון במתח של וולט אחד לסנטימטר למשך כ-12 עד 15 שעות. המתח הנמוך וריכוז ה-AGROS הנמוך בג'ל משמשים להפרדת מקטעי ה-DNA בעיקר על בסיס גודלם.לאחר הרצת הממד הראשון, השתמשו בסכין קצבים גדולה כדי לגזור את הנתיב הראשון המכיל את סמן ה-Lambda hind three וצבעו באמצעות atherium bromide. עבור הממד השני, גזרו את נתיבי הג'ל באמצעות סכין הקצבים הגדולה, כאשר סמן ה-Lambda Hind three משמש כנקודת ייחוס; חתכו והשליכו את האזור שמתחת למקום שבו צפוי לרוץ הפלסמיד הליניארי בכל נתיב. כדי ליצוק את הממד השני, הניחו כל פרוסה בצורה אופקית על פניו של יצוק ג'ל ריק.הכינו תמיסה של 1%AROS בתוך XTBE אחד וקררו ל-55 degrees Celsius. לאחר הקירור, שפכו את תמיסת הג'ל כדי ליצוק את הממד השני, תוך וידוא כי פרוסות הג'ל מכוסות לחלוטין. חשוב לוודא כי הפרוסות מכוונות באופן אחיד וכי התבנית מפולסת לפני יציקת הג'ל.לאחר שהג'ל הת굳ב, הרץ את הממד השני במשך חמיש וחצי עד שבע שעות ב-6.5 vols לסנטימטר ביחידת אלקטרופורזה המאפשרת סירקולציה של הבאפר; המתח הגבוה ואחוז ה-Agros הגבוה בג'ל מפרידים ביעילות את מקטעי ה-DNA על בסיס הצורה שלהם וכן על בסיס גודלם. צורות לא לינאריות נעות לאט יותר בממד השני לאחר האלקטרופורזה. שטוף את הג'ל במים פעם אחת ולאחר מכן שטוף אותו פעמיים ב-400 milliliters של 0.25 molar hydrochloric acid למשך 15 דקות תוך כדי ערבוב עדין.שטיפות החומצה נועדו ליצור חתכים חלקיים במולקולות ה-DNA למקטעים קטנים יותר, המועברים ביעילות רבה יותר במהלך ניתוח הסאד'רן (southern analysis), והן נחוצות בשל הגודל הרב והצורה הבלתי שגרתית של תוצרי הביניים של שכפול ה-DNA. כדי להכין את הג'ל להעברה בבסיס (alkali transfer), שטפו את הג'ל שוב במים, ולאחר מכן שטפו אותו פעמיים ב-400 milliliters של 0.4 molar sodium hydroxide למשך 30 דקות. לאחר מכן, ה-DNA בג'לים מועבר לממברנת nylon מסוג high bond n plus באמצעות מערכת העברה בסיסית כלפי מטה עם 0.4 molar sodium hydroxide, כפי שמתואר בחלק הכתוב של פרוטוקול זה; המתינו להעברת ה-DNA במשך שש עד 12 שעות. לאחר העברת ה-DNA, המשיכו בהיברידיזציה של הגשוש (probe hybridization) כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.לאחר בדיקת הממברנה ושטיפתה, הניחו אותה על נייר סופג עד שהנוזל ייעלם מהעין. לאחר מכן, עטפו את הממברנה בניילון נצמד (polyvinyl chloride) וחשפו אותה למסך phospho imager. לבסוף, ניתן להדגים ולכמת את הרדיואקטיביות באמצעות storm eight 40 ותוכנת ה-image quant הנלווית לו.מוצגת תרשים של דפוס הנדידה של פלסמיד PBR 3 22 שעבר עיכול על ידי PV two, כפי שנצפה בניתוח ג'ל 2D agarose. פלסמידים ליניאריים שאינם משכפלים נעים כפרגמנט ליניארי בגודל 4.4 KB; פלסמידים משכפלים יוצרים מבנים דמויי Y שנדידתם איטית יותר מהפרגמנטים שאינם משכפלים, בשל גודלם הגדול יותר וצורתם הלא-ליניארית. דפוס נדידה זה יוצר קשת הנמתחת מהאזור הליניארי לכיוון הבאר לאחר הקרנה ב-UV.מולקולות בצורת Y כפול או בצורת X נצפות באזור הקונוס ונדדות לאט יותר מקשת המולקולות בצורת Y. דוגמה לניתוח הדרומי של ג'ל דו-ממדי שנחשף ל-PBR 3 22 המסומן ב-P 32 מוצגת עבור תאים מיד לאחר הקרנת UV ו-15 דקות לאחר הקרנת UV מיד לאחר הקרנת UV. כ-1% מסך ה-DNA של הפלסמיד ניתן למצוא בקשת ה-Y כאשר תאים גדלים במהירות בשלב אקספוננציאלי לאחר הקרנה.עלייה זמנית במולקולות בצורת Yה נצפית כאשר מזלגות שכפול חסומים מצטברים באתרים פגומים. גם תוצרי ביניים של שכפול בצורת L מצטברים באופן זמני ונשארים עד לזמן המתאם לתיקון הפגומים. הרגשנו להראות לכם כיצד ניתן להדמיות תוצרי ביניים של תיקון DNA באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להיות מודעים לכוחות גזירה שעלולים להפחית את התפוקה, ולהיזהר בטיפול בכל הדגימות והג'לים. זהו כל השלב. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.

visualization-uv-induced-replication-intermediates-e-coli-using-two

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מדגים במיקרוסקופ פשוט מולקולה בודדת פלואורסצנציה טכניקה חזותי שכפול ה-DNA על ידי replisomes הפרט בזמן אמת.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

DT40, מערכת החולייתנים מודל גנטי, מספק כלי רב עוצמה כדי לנתח את תפקוד החלבון. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת ניתוח איכותני של פרמטרים המשפיעים על סינתזת דנ"א בשלב S-של DT40 תאים ברמת מולקולה בודדת.

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

מקור: Cayron, J., and Lesterlin, C. ניתוח רב-ממדי של גידול חיידקים תחת טיפולי לחץ. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההליך להערכת נימה של E. coli ושכפול DNA תחת טיפול אנטיביוטי מעכב חלוקת תאים באמצעות ציפוי למדידת כדאיות וזרימה ציטומטרית לניתוח גודל התא ותכולת ה-DNA.

הערכת נימה הנגרמת על ידי אנטיביוטיקה ב-E. coli באמצעות בדיקת ציפוי וזרימה ציטומטרית

מקור: מטריק, ק. א., לורנס ואחרים, השראת חסימת שכפול ספציפית לאתר ב-E. coli באמצעות מערכת מפעילי מדכא פלואורסצנטי. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון הזה מדגים חסימת מזלג שכפול ספציפית לאתר ב-Escherichia coli באמצעות ביטוי מושרה על ידי ערבינוז של TetR חלבון פלואורסצנטי צהוב המתויג בקשר למערכי טטו כרומוזומליים.

חסימת שכפול מתווכת חלבון מדכא פלואורסצנטית באשריכיה קולי

מקור: ברטון, ב. פ. ואחרים, הדמיה תלת-ממדית של תאי חיידק לייצוגים תאיים מדויקים ומיקום חלבונים מדויק. J. Vis. Exp. (2019)הסרטון הזה מדגים את השיטה לרכישת וניתוח תמונות פלואורסצנציה תלת-ממדיות של תאי חיידק כדי לחקור ארגון חלבונים ברמת התא היחיד.

הדמיית התפלגות חלבוני חיידק בשלושה ממדים באמצעות הדמיית פלואורסצנציה

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

מיקרוסקופיה photoactivated הלוקליזציה (PALM) בשילוב עם מעקב מולקולה בודדת מאפשרת התבוננות ישירה וכימות של אינטראקציות החלבון-DNA בתאי חיידקי Escherichia חיים.

לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

אנו מציגים תוכנית אסטרטגית ופרוטוקול לזיהוי וריאנטים גנטיים לא מקודדים המשפיעים על קשירת ה-DNA של גורם השעתוק (TF). פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק לבדיקת משמרת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) וניתוח משקעים של זיקה ל-DNA (DAPA) של קשירת TF DNA תלויה בגנוטיפ.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

אנו מתארים כאן מערכת המשתמשת בבלוק חלבון in vivo ספציפי לאתר, הפיך כדי לעכב ולמוטט מזלגות שכפול ב-Escherichia coli. הקמת בלוק השכפול מוערכת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל אגרוז ניטרלי-ניטרלי משמשת להדמיית חומרי ביניים לשכפול.

התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב<i&gt; E. coli</i&gt; באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכא

כאן, אנו מתארים את ההליך לניתוח התקדמות השכפול באמצעות חזרות פתוגניות, נוטות למבנה באמצעות אלקטרופורזה ג'ל דו מימדית.

ניתוח אלקטרופורטי של שכפול באמצעות DNA נוטה למבנה חוזר בתוך אפיזום אנושי מבוסס SV40

למד לדמיין מבנים ביניים של DNA בשכפול לאחר נזק UV ב-E. coli באמצעות אלקטרופורזה דו-ממדית באגרוז. שיטה זו מאפשרת לחקור תהליכי תיקון DNA ולהבין את השפעת הנזק על שכפול התא.

ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג'ל ניתוח

גלה סרטונים נוספים