הדמיית התפלגות חלבוני חיידק בשלושה ממדים באמצעות הדמיית פלואורסצנציה

התחילו עם שקופית אטומה המכילה תאי חיידק מסומנים בסמן פלואורסצנטי אדום ציטופלזמי וסמן פלואורסצנטי ירוק ייחודי לחלבון.

התבונן במחסנית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

אתר שדה המכיל תאי חיידק מבודדים היטב והתמקד במרכז של תא מייצג.

הגדר את ערוץ הפלואורסצנציה הראשון וקבל תמונת z-stack בפרמטרים מסוימים כדי ללכוד את הצורה התלת-ממדית של התא המייצג והתאים הסמוכים לו.

לאחר מכן, עברו לערוץ הפלואורסצנציה השני וקבלו תמונת z-stack נוספת של אותם תאים עם אותם פרמטרים.

הוא לוכד את התפלגות החלבונים החיידקיים בתוך התאים.

חותכים תאים בודדים מכל ערימת z כדי לבודדם לניתוח תא יחיד.

יישר את התמונות הללו כדי להמחיש את התפוצה של חלבוני חיידק ביחס לצורת התא, מה שמאפשר ניתוח מדויק במהלך אינטראקציות בין מארח לפתוגן.

מיד לאחר סגירת הכיסוי, הניחו את המחסנית על שלב מיקרוסקופ, ולאחר חמש דקות של איזון תרמי, השתמשו בגלגלי המיקוד של המיקרוסקופ כדי למקם את מרכז התא. בתוכנת המיקרוסקופ הנלווית תחת רכישת ND, יש לסמן את תיבת Z כדי לקבל מחסנית Z ולחץ על כפתור הבית כדי להגדיר את מרכז התא כנקודת התחלה. הגדר את גודל הצעד ל-0.1 מיקרומטר ואת הטווח לארבעה מיקרומטרים, וודא שמכשיר ה-Z מוגדר לשלב פייזו.

חשוב מאוד שיהיה טשטוש מספיק הן בחלק העליון והן בתחתית התא כך שהתא יהיה כמעט בלתי ניתן להבחנה מהרקע. הגדר את ערוצי הפלואורסצנט מתחת לחלון הלמדה להגדרות של המולקולות הפלואורסצנטיות המדוימות, ואשר שסדר הניסוי מוגדר למבדה כך שתתקבל ערימת Z שלמה בכל ערוץ צבע לפני המעבר. לאחר מכן, לחץ על 'רץ' עכשיו כדי להתחיל ברכישת התמונה.

לאחר שכל התמונות נאספו, פתח את הקבצים בתוכנת ניתוח תמונות מתאימה. צייר תיבה סביב תא בודד ושכפל את התא פעמיים, פעם אחת לכל ערוץ, לוודא שתיבת ה-Duplicate hyperstack מסומנת, ושנה את הערוץ לאחד או שניים. לאחר ששתי המחסניות זמינות, בחר תמונות, מחסניות, כלים ו-Concatenate כדי לשלב את התמונות.