התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב E. coli באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכא
21 באוגוסט 2016
אנו מתארים כאן מערכת המשתמשת בבלוק חלבון in vivo ספציפי לאתר, הפיך כדי לעכב ולמוטט מזלגות שכפול ב-Escherichia coli. הקמת בלוק השכפול מוערכת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל אגרוז ניטרלי-ניטרלי משמשת להדמיית חומרי ביניים לשכפול.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לעכב מזלג שכפול בבלוק נוקלאופרוטאין ולצפות במבני ה-DNA באתר הבלוק לצורך חקר מסלולי תיקון DNA. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי שכפול ותיקון DNA, כגון כיצד ה-DNA מעובד כאשר מנגנון השכפול של התא נתקל במחסום חלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לעכב באופן הפיך מזלג שכפול במיקום מסוים על הכרומוזום על פני אוכלוסייה שלמה של תאים חיים.
מי שידגים את ההליך הזה יהיו החברות הבאות במעבדה שלי, ד"ר קרלה מטריק, והסטודנטית לתואר שני, ג'ורג'יה וויבר וטיילה-אן קורושר. זן E.coli הנושא מערך אופרטור טטרציקלין בפלסמיד pKM1 משמש להליך זה. pKM1 מקודד עבור TetR-YFP, חלבון מדכא טטרציקלין צהוב הניתן להשראה.
לדלל תרבית לילה טרייה של זן E.coli זה לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר של 0.01 בתווך מורכב מדולל עם אנטיביוטיקה כנדרש לבחירה. גדל את התרבות ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר של 0.05 עד 0.1. הסר דגימה של 10 מיליליטר כדי לשמש כבקרה לא מושרת.
הוסף 0.01% ארבינוז לתרבית הנותרת כדי לגרום לייצור TetR-YFP מ-pKM1. המשך לגדל הן את התרביות הלא מושרות והן את התרביות המושרות ב -30 מעלות צלזיוס עם טלטול. לאחר שעה, בדוק אם יש מוקד יחיד בתוך כל תא של התרבית המושרה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
אם התאים המושרים מאושרים חסומים, המסומנים על ידי יותר מ -70% מהתאים בעלי מיקוד יחיד, רשום את הצפיפות האופטית והסר 7.5 מיליליטר מהדגימה לניתוח על ידי אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל. הסר דגימה שווה ערך מתרבית הבקרה הלא מושרת. לפני מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הכינו את רפידות האגרוז למניעת תנועת התאים במהלך ההדמיה.
עבור כל כרית אגרוז, פיפטה 500 מיקרוליטר של אגרוז מותך על שקופית מיקרוסקופ ומכסה את הכיסוי מיד לפני שהאגרוז מתמצק. אחסן את השקופיות בין רקמות רטובות בארבע מעלות צלזיוס עד הצורך. כשהגיע הזמן לבדוק את התאים, הסר את הכיסוי מכרית האגרוז ופיפטה 10 מיקרוליטר של תרבית חיידקים על מרכז הרפיד.
לאחר כחמש דקות, כאשר כרית האגרוז התייבשה, החלף את הכיסוי. הניחו טיפת שמן טבילה על הכיסוי והניחו את המגלשה מתחת לאופטיקה. דמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופ פאזה בהגדלה של פי 100.
בתיבת הדו-שיח Acquire בתוך תוכנת ההדמיה, הגדר את זמן החשיפה ל- 100 אלפיות השנייה. בחר Acquire כדי ללכוד את התמונה. אל תזיז את הבמה.
בתיבת הדו-שיח נרכש, בחר YFP כתאורה עבור התריס החיצוני המקושר למצלמה. הגדר את זמן החשיפה ל-1,000 אלפיות השנייה. כבה את תאורת הבמה ובחר רכוש כדי ללכוד את תמונת הקרינה.
כדי להתחיל בהליך זה, הוסף נתרן אזיד לדגימות תרבית שנאספו בעבר לריכוז סופי של 0.1% ודגר על קרח למשך חמש דקות לפחות. צנטריפוגה של התאים ב -5, 000 פעמים גרם למשך עשר דקות. השליכו את הסופרנטנט.
השעו מחדש כל כדור תא ב-200 מיקרוליטר של מאגר PIV והעבירו את התאים לצינור מיקרופוגה. מיקרו-צנטריפוגה כדי לגלול את התאים ולהשליך את הסופרנטנט. טפל בשקופית מיקרוסקופ עם 40 מיקרוליטר של דוחה מים מזכוכית או תמיסת סיליקון מתאימה.
משפשפים את השקופית עם טישו עד שהיא יבשה. השעו מחדש את התאים עם צפיפות התאים הנמוכה ביותר ב-50 מיקרוליטר של PIV והניחו ב-50 מעלות צלזיוס בגוש חום. עבור כל שאר הדגימות, התאם את נפחי ה-PIV כך שצפיפות התא הסופית תהיה זהה בכל צינור.
הוסף נפח שווה של תמיסת אגרוז טרייה של 0.8% ב-PIV לדגימות . שמור את הדגימות בבלוק החום כדי להבטיח שהן מעל 50 מעלות צלזיוס כדי למנוע התמצקות. הנח 20 טיפות מיקרוליטר של תרחיף התאים-אגרוז על השקופית המטופלת כדי לייצר פקקים חצי כדוריים.
כאשר התקעים התמצקו, החלק בעדינות את כל התקעים מדגימה אחת לתוך צינור מיקרופוגה יחיד והוסף מיליליטר אחד של מאגר ליזה תאים. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר שעתיים, הסר את מאגר הליזיס של התאים והוסף 1 מיליליטר של תמיסת EDTA-Sarkosyl-Proteinase K או ESP.
דגירה בחום של 50 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד שהתקעים שקופים. לאחר שהתקעים שקופים, הסר את מאגר ה-ESP והעבר את התקעים לצינור של 15 מיליליטר. מוסיפים 12 מיליליטר של מאגר TE ומניחים לעמוד למשך 30 דקות.
שטפו את התקעים בסך הכל חמש פעמים עם מאגר TE. אחסן את התקעים בארבע מעלות צלזיוס במיליליטר אחד של מאגר TE. כדי לנתח את תוצרי הביניים של השכפול, ה-DNA בפקקי האגרוז מתעכל עם אנזים הגבלה מתאים לאזור העניין.
בדוגמה זו, EcoRV חותך את הדנ"א מיד לפני המערך, בתוך המערך ואחרי המערך, כדי לתת שברים של 5.5 קילו-בייט ו-6.7 קילו-בייט באזור העניין. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו פקק אגרוז לצינור מיקרופוגה טרי והוסיפו 150 מיקרוליטר של מאגר אנזים הגבלה. הוסיפו 25 עד 100 יחידות של אנזים הגבלה ועכלו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך שש עד שמונה שעות.
הכינו ג'ל אגרוז 0.4% בארבע מעלות צלזיוס. יוצקים 300 מיליליטר אגרוז מותך למגש ג'ל בגודל של כ -25 על 25 סנטימטרים. הכנס מסרק כדי להפוך את הבארות לרוחב זהה לקוטר התקע.
כאשר הג'ל מתייצב, הסר את המסרק והעביר את הג'ל לטמפרטורת החדר. בעזרת לולאת חיסון, החלק את אחד מפקקי האגרוז המעוכלים לבאר, ומקם את הצד השטוח של הפקק כנגד צד הבאר שבו ה-DNA ייכנס לג'ל. הכנס תקע בודד באותו אופן לכל באר שנייה.
פיפטה מותכת 0.4% אגרוז לתוך הבארות כדי לאטום את הפקקים במקומם. טען סולם DNA של קילו-בייט אחד בבאר ריקה, והשאיר פער בין הסולם לדגימות. יש למרוח את הג'ל למשך הלילה ב-1xTBE בטמפרטורת החדר.
למחרת, יש להכתים את הג'ל באמבט מים המכיל 0.3 מיקרוגרם למיליליטר של אתידיום ברומיד למשך 20 דקות. דמיין את ה-DNA עם משדר UV בעל גל ארוך וחתוך כל שבר נתיב בחיתוך ישר ואחיד הממזער את הכללת עודפי האגרוז משני צידי הנתיב. הנח את נתיב הג'ל הכרות במגש ג'ל ב-90 מעלות לכיוון נדידת ה-DNA.
השלב הבא הוא הכנת 300 מיליליטר אגרוז לג'ל הממד השני. כאשר האגרוז מקורר ל -50 מעלות צלזיוס, פיפטה את האגרוז המותך סביב פרוסות הג'ל כדי למצק את מיקומן. יוצקים את יתרת האגרוז למגש לעומק שלפחות שווה לפרוסות הג'ל.
לאחר שהג'ל מתמצק, אלקטרופור אותו ב-1xTBE המכיל 0.3 מיקרוגרם למיליליטר של אתידיום ברומיד בארבע מעלות צלזיוס עד שה-DNA נדד כ-10 סנטימטרים. כרתו את הבלוקים שבהם קיים ה-DNA הגנומי כולל הג'ל שמעליו, כדי לכלול את ה-DNA שאינו נראה. ה-DNA בתוך הג'ל מודגם לאחר מכן על ידי הכלאה דרומית כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
במערכת זו, בלוק שכפול אושר על ידי רוב התאים המכילים מוקד אחד המתאים לעותק אחד של המערך בתוך התא. התוספת של אנהידרוטטרציקלין הפכה את החסימה ושכפול המערך לאחר מכן הוצג כהצטברות של תאים עם מוקדים מרובים. תאים עם שכפול חסום הראו גם עיכוב גדילה שהתהפך על ידי צמיחה לאחר מכן בנוכחות אנהידרוטטרציקלין.
כדי לנתח את תוצרי הביניים של השכפול, ה-DNA עבר אלקטרופורזה בממד הראשון. לאחר מכן נכרת ה-DNA המעניין ואלקטרופורזה של הממד השני הביאה לאלכסון של DNA ליניארי. הכלאה דרומית של ה-DNA של המערך חשפה שתי נקודות בדגימה הלא חסומה המתאימות לשברי המערך הצפויים של 5.5kb ו-6.7kb.
הדגימה החסומה הראתה ירידה בנקודה של 5.5kb ותוספת של אות אליפטי המעיד על הצטברות של DNA בצורת Y. תוספת של אנהידרוטטרציקלין ביטלה את אות ה-DNA בצורת Y. ביניים נפוץ נוסף הוא צומת הולידיי המוצג כאות חרוט בחלק העליון של קשת ה-Y וספייק מה-DNA הליניארי בקצה קשת ה-Y.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שמונה ימים אם היא מבוצעת כראוי. אמנם מדובר בהליך דו-ממדי, אך חשוב לזכור שאיכות פקקי ה-DNA היא קריטית להדמיה אופטימלית של מבני ה-DNA.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לעצירה וקריסה של מזלגות שכפול ב-Escherichia coli באמצעות חסימת חלבון ספציפית לאתר וניתנת להשבה in vivo. הטכניקה מאפשרת תצפית על מבני DNA באתר החסימה, ומספקת תובנות לגבי מסלולי תיקון DNA.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מִקרוֹבּיוֹלוֹגְיָה
- בּיוֹלוֹגְיָה מולקולרית
- גנטיקה
רקע
- הבנת שכפול ה-DNA היא חיונית לתובנות על תהליכים תאיים.
- מזלגות השכפול עלולים להיתקל במכשולים המשפיעים על שלמות ה-DNA.
- חקר האופן שבו התאים מגיבים לחסימות אלו יכול לחשוף מנגנונים של תיקון DNA.
- Escherichia coli משמשת כאורגניזם מודל למחקרים אלו.
מטרת המחקר
- לעצור מזלג שכפול בחסימת נקלאופרוטאין.
- לצפות במבני DNA באתר החסימה.
- לחקור את עיבוד ה-DNA במהלך השכפול כאשר נתקלים בחסימת חלבון.
שיטות ששימשו
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה להערכת הקמת חסימת השכפול.
- אלקטרופורזה בג'ל אגרוזה דו-ממדי ניטרלי-ניטרלי לדמיה של ביניים בשכפול.
- שימוש בזן E. coli עם מערך אופרטור טטרציקלין בפלסמיד pKM1.
- שימוש בחלבון מדכא טטרציקלין מסומן פלואורסצנט צהוב (TetR-YFP) ניתן לגירוי לצורך הדמיה.
תוצאות עיקריות
- עצירה מוצלחת של מזלגות שכפול במיקום ספציפי.
- דמיה של מבני DNA בחסימת השכפול.
- תובנות לגבי התגובה התאית ללחץ שכפול.
- הדגמה של יעילות השיטה על פני אוכלוסייה של תאים חיים.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי רב עוצמה לחקר שכפול ותיקון ה-DNA.
- עצירה הפיכה של מזלגות שכפול מאפשרת ניתוח מפורט של עיבוד ה-DNA.
- גישה זו יכולה לשפר את הבנתנו את התגובות התאיות לנזקי DNA.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables site-specific, reversible stalling of replication forks in living bacterial cells, providing a controlled system to study DNA repair mechanisms under defined replication stress. By visualizing replication intermediates and fork collapse events, it supports mechanistic de-risking of DNA-targeting therapeutics and enhances predictive confidence in early-stage target validation. The approach offers a scalable, quantitative platform for probing genomic stability pathways relevant to antimicrobial and anticancer drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by inducing defined replication fork stalling to assess DNA damage response pathways.
- Operational Value: Provides a reversible, inducible system for consistent induction of replication stress across cell populations.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking protein-DNA interactions to functional outcomes in fork stability and repair.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable replication intermediate profiles via 2D gel electrophoresis for compound-induced DNA structural changes.
- Operational Value: Standardizes detection of Y-shaped DNA and Holliday junction formation as biomarkers of replication stress.
- Assay Readiness: Uses fluorescence microscopy to confirm block establishment (>70% single foci) as a quantitative gate for downstream analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of recombination proteins and helicases in fork recovery using genetic knockouts, informing target prioritization.
- Operational Value: Integrates temperature-sensitive replisome mutants (e.g., DnaBts) for synchronous fork collapse to improve reproducibility.
- Translational Continuity: Connects bacterial replication stress responses to conserved eukaryotic DNA repair mechanisms relevant to preclinical modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows by enabling hypothesis-driven interrogation of replication-associated targets before lead identification, with outputs informing mechanistic de-risking and assay readiness for screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of protein-DNA interactions as replication obstacles and their impact on fork progression.
- Screening: Enables development of fluorescence-based and gel-based assays to quantify replication block establishment and reversal.
- Analytics: Produces measurable outputs including focal point accumulation, Y-arc signals, and cone/spike intermediates for comparative condition analysis.
- Translational Research: Links bacterial fork recovery mechanisms to eukaryotic repair pathways, supporting cross-species target validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for inducible, site-specific replication stress applicable across multiple target classes and strain backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets through direct visualization of replication fork processing and repair intermediate formation.
- Operational Value: Reversible induction via arabinose/TetR-YFP and anhydrotetracycline enables washout and recovery studies in synchronized populations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying target engagement effects on genomic stability and repair pathway activation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA-associated targets based on functional validation in a living-cell replication stress model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, 2D gel electrophoresis, and molecular cloning for plasmid maintenance.
- Dependent on agarose plug preparation quality and restriction enzyme selection for region-of-interest analysis.
- Necessitates standardization of induction timing, OD monitoring, and focal point quantification across replicates.
- Adaptation to other model systems requires functional orthologs of TetR operator arrays and compatible replisome components.
- Practical limitations include plug preparation time and sensitivity of 2D gel resolution to DNA integrity and agarose purity.
