Name: התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב E. coli באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: למד כיצד לעצור ולקרוס שכפול DNA ב-E. coli באמצעות חסימת חלבון פלורסנטית מדכאת. שיטה זו מאפשרת תצפית במבני DNA באתר החסימה וחקר נתיבי תיקון DNA בחיידקים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר האוסטרלית [DP11010246].

<ol><li>Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+stalling+at+natural+impediments%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Replication fork stalling at natural impediments.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).</li>
<li>Gupta, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+complexes+are+the+primary+sources+of+replication+fork+pausing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).</li>
<li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).</li>
<li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+fork+dynamics+in+Escherichia+coli+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).</li>
<li>Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+stalling+and+cell+cycle+arrest+in+UV-irradiated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).</li>
<li>Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+replication+reduces+RecA-mediated+repair+of+UV-damaged+plasmids+introduced+into+competent+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli.</a> Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).</li>
<li>Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ruvA+and+ruvB+mutants+specifically+impaired+for+replication+fork+reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal.</a> Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).</li>
<li>Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+Escherichia+coli+chromosome+arms+locate+to+separate+cell+halves%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves.</a> Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).</li>
<li>Lau, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+replicating+Escherichia+coli+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes.</a> Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).</li>
<li>Gordon, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+and+low+copy+plasmid+segregation+in+E.+coli%3A+visual+evidence+for+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms.</a> Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).</li>
<li>Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+controlled+Escherichia+coli+replication+fork+stalling+and+restart+at+repressor-bound+DNA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo.</a> EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).</li>
<li>Payne, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+blockage+by+transcription+factor-DNA+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).</li>
<li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+localization+of+replication+origins+on+ARS+plasmids+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae.</a> Cell. 51 (3), 463-471 (1987).</li>
<li>Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+UV-induced+replication+intermediates+in+E.+coli+using+two-dimensional+agarose-gel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).</li>
<li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+replication+fork+regression+and+processing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli.</a> Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).</li>
<li>Mettrick, K. A., Grainge, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+blocked+replication+forks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stability of blocked replication forks in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Church, G. M., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).</li>
<li>Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+process+stalled+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways process stalled replication forks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).</li>
<li>Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+proteins+and+rescue+of+arrested+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Recombination proteins and rescue of arrested replication forks.</a> DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).</li>
<li>Carl, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+mutants+with+temperature-sensitive+synthesis+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA.</a> Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).</li>
<li>Nawotka, K. A., Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+gel+electrophoretic+method+for+mapping+DNA+replicons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons.</a> Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).</li>
<li>Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+psoralen+interstrand+cross-links+from+DNA+of+Escherichia+coli%3A+mechanism+and+genetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control.</a> J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

במהלך שכפול הכרומוזומים, מנגנון השכפול יתקל במכשולים שונים המונעים את התקדמותו. כדי להבטיח שכל הכרומוזום ממקור יחיד ישוכפל, לחיידקים יש מסלולים רבים לתיקון ה-DNA המאפשרים טעינה מחדש שלה-Replisome 20,21. נגעים, שברים חד-גדיליים, שברים דו-גדיליים וחלבונים הקשורים היטב ל-DNA עשויים להיות מטופלים כל אחד באמצעות מסלול ייעודי, אם כי סביר להניח שתהיה חפיפה משמעותית במסלולים אלה. המכשול הנפוץ ביותר לרפליזומים בתאים חיים הוא בלוק נוקלאופרוטאין2. עם זאת, שני קשיים ארוכי שנים בחקר ההתנגשות של רפליזום עם חסימת ...

במהלך שכפול ה- DNA, replisome פונה מכשולים על DNA הפוגע בהתנהלותה. נזק לדנ&quot;א כולל נגעים ופערים כמו גם מבנים סוטה יכול למנוע replisome מ שתמשיך 1. לאחרונה, זה כבר נמצא כי חלבונים מאוגדים ה- DNA הם המקור הנפוץ ביותר של מניעה שכפול התקדמות מזלג 2. הידע של אירועים בעקבות המפגש של replisome עם בלוק nucleoprotein הוגבל בעבר על ידי חוסר היכולת לגרום בלוק כזה כרומוזום של תא חי בבאתר ידוע. ניתוח במבחנה שיפרה את ההבנה שלנו של התנהגות קינטית של replisome פעיל כאשר הוא פוגש סתימה nucleoprotein 3, כמו גם את הפרטים מכניסטית של replisome עצמו 4,5. הבנה נוכחית של התיקון של שכפול נעשית בדרך כלל עם UV כסוכן המזיק ללמוד באמצעות פלסמיד דנ&quot;א in vivo 6-8 </sעד&gt;. בעוד החלבונים שעשויים להיות מעורב תיקון DNA לאחר היא נתקלת לחסום nucleoprotein vivo ב הם הבינו בדרך כלל ממחקרים אלה, אם ישנן וריאציות של האירועים המולקולריים בתוך מסלולי התיקון בשל הגורם הברור בבלוק שהכפול עדיין עדיין להיות נחוש. כאן אנו מתארים מערכת המאפשרת לחסום nucleoprotein שיוקם במיקום ספציפי של כרומוזום באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכאת (FROS). אנו מנצלים זן של E. coli כי יש לו מערך של 240 אתרי TETO שולבו כרומוזום 9. כל אתר TETO בתוך המערך יש רצף אקראי 10 נ&quot;ב איגוף זה כדי להגדיל את היציבות של המערך על ידי מניעת רקומבינציה בתיווך RecA בתוך המערך. מערך זה, ווריאציות של אותו, שימשו במקור להבין E. דינמיקת כרומוזום coli 10,11 אבל הותאמו ואז preveNT in vivo שכפול 12. המערך נמצא להישמר ביציבות לחסום קרוב ל -100% של מזלגות שכפול כאשר מחויב TetR 10,12. השימוש במערך Laco הדומה במבחנה מצא כמה כמו 22 אתרים היו מספיקים כדי לחסום 90% של שכפול, למרות מערך קצר זה היה פחות יעיל vivo 13. כדי להתאים את המערך ליצור סתימת nucleoprotein, החלבון המדכא חייב להיות overproduced מאוד בתנאי אופטימיזציה איפה זה אז נקשר המערך ליצור מחסום. היווצרות של חסימה, ולשחרר הבאים שלה, ניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אם גרסה מתויג fluorescently של מדכא ט משמש. מעמדו של שכפול בכל תא מותווה במספר המוקדים לראות, שם נקודה אחת מוקדים אומר רק עותק אחד של המערך נמצא בתוך התא מוקדים מרובים מעידים על שכפול פעיל. מחדש אקטיבית זוקפול מופעלת כאשר חסימת nucleoprotein מתהפכת על ידי התוספת של inducer מיותר כי מקטין את הזיקה המחייבת של TetR עבור האתר מפעיל מספיק עבור replisome ולעבור את המערך. החלבון המדכא עדיין מסוגל להיקשר ל- DNA עם זיקה גבוהה מספיק כי העותקים עכשיו המרובים של המערך ניתן דמיינו. עוד פרטים סבוכים של אירועי סתימת nucleoprotein יכולים להתגלות באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose ניטראלי ניטראלית דו ממדים ו כלת דרום 14-16. טכניקות אלו מאפשרים ניתוח של מבנים DNA על פני האוכלוסייה. ביניים שכפול אשר נוצרים במהלך האירוע, ואפשרות להישאר מתוקנים, ניתן דמיינו. על ידי שינוי אנזים ההגבלה ו ניצל חללי, את התשומות ניתן דמיינו לא רק באזור אלא גם מערך זרם של המערך כאשר המזלג שהכפול נסוג 17,18. הרגרסיה מתקיים לאחר ניתוק replisome; גדילי המתהווה המובילים מפגרים נפרדים מן גדילי התבנית לחשל זה לזה כמו גדילי תבנית במקביל מחדש לחשל וכתוצאה מכך מבנה ה- DNA ארבעה-כיווני (צומת הולידיי). באמצעות מערכת זו הוכחה כי המזלג שהכפול אינו יציב כאשר הוא נתקל בלוק זה 18. בנוסף, נגזרים רגישים לטמפרטורה של רכיבי replisome יכולים להיות מנוצלים כדי למנוע העמסת יתר של המזלג שכפול פעם זה קרס. לאחר בלוק מוקם, הזן יכול להיות מוזז לטמפרטורה אוֹסְרָנִי כדי להבטיח שחרור משרות סינכרוני של replisome וכן מניעת מבוקרת של העמסת יתר. הטמפרטורה הנגרמת זה שחרור משרות מבטיחה כל המזלגות בתוך האוכלוסייה קרסו בזמן נתון ומאפשר הערכה של מה קורה כאשר replisome מתמוטט, כיצד DNA מעובד, ומה נדרש כדי מחדשלהתחיל בתהליך של שכפול ה- DNA. אחד היתרונות של המערכת המתוארת כאן היא כי לחסום nucleoprotein הוא הפיך לחלוטין; ולכן, היכולת של התאים להתאושש מגוש nucleoprotein היא מסוגלת להיות אחריו. התוספת של anhydrotetracycline לתאי תקל על דוק מחייב של המדכא, המאפשרת מזלג שכפול ולעבור והתא להשיב כדאיות. ההקלה של סתימה ניתן דמיינו ידי נייטרלי נייטרלי דו מימדי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose לאחר 5 דק &#39;, ועל ידי מיקרוסקופיה בתוך 10 דקות. יתר על כן, ניתוח כדאיות יכול לחשוף את היכולת של הזן להתאושש הסתימה שהכפולה ממשיך להתרבות. על ידי שינוי הרקע הגנטי של הזנים המשמשים הליך הניסוי המתואר כאן, שמסלולי התיקון עבור סוג זה של חסימה ניתן הובהרו.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16922</td><td>רכיב מדיית גידול</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td>רכיב מדיית גידול</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>92144</td><td>רכיב מדיית גידול</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>רכיב מדיית גדילה; רכיב מאגר אשלגן</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>רכיב מדיית גדילה; רכיב מאגר אשלגן</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>לאינדוקציה של ייצור TetR-YFP</td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>שחרור בלואק שכפול</td></tr><tr><td>Axioskop 2 מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Zeiss</td><td>452310</td><td>הדמיה של תאים</td></tr><tr><td>eYFP סט מסננים</td><td>Chroma Technology</td><td>41028</td><td>הדמיה של</td></tr><tr><td>מצלמת YFP CCD</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-AG</td><td>הדמיה של תאים</td></tr><tr><td>MetaMorph&nbsp; תוכנה (התקנים מולקולריים)</td><td>SDR Scientific</td><td>31282</td><td>גרסה 7.8.0.0 המשמשת בהכנת כתב יד זה</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>לתקעי אגרוז ואלקטרופורזה ג'ל</td></tr><tr><td>דוחה מים מזכוכית מקורית (Rain-X)</td> <td>Autobarn</td><td>DIO1470</td><td>לייצור תקעי אגרוז</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>VWR</td><td>VWRC103157P</td><td>TE, רכיב</td></tr> <tr><td>מאגר TBEחומצה אתילן דיאמין-טראצטית</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA180</td><td>0.5 M EDTA תמיסת מלח דיסודיום מותאמת ל-pH 8.0 עם NaOH.</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S2002</td><td>חומר בקטריוסטטי</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td> רכיב חיץ <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>258148</td><td>TE</td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D6750</td><td>רכיב חיץ ליזה של תאים</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine מלח נתרן (סרקוזיל)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L5125</td><td>ליזיס תאים ורכיב חיץ ESP</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>רכיב מאגר ליזה של תאים</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>6300</td><td>רכיב מאגר ליזה של תאים</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>AM0706</td><td>ESP רכיב מאגר</td></tr><tr><td>תת-תא דגם 192</td><td>Cell BioRad</td><td>1704507</td><td>מערכת אלקטרופורזה</td></tr><tr><td>UV transilluminator 2000</td><td>BioRad</td><td>1708110</td><td>הדמיה של DNA</td></tr><tr><td>ניתן להשתמש גם ב-Ethidium Bromide</td><td>BioRad</td><td></td><td>1610433 הדמיה של DNA</td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>VWR</td><td>PROL20185.360</td><td>רכיב TBE</td></tr><tr><td>Hybond-XL ניילון Memrbane</td><td>Amersham</td><td>RPN203S</td><td>Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159)</td></tr><tr><td>נייר כרומטוגרפיה 3 מ"מ Whatman GE</td><td>Healthcare Life Sciences</td><td>3030690</td><td>Southern Blotting</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td>95-0031-01/02</td><td>קישור צולב של DNA והכלאה</td></tr><tr><td>חומצה דאוקסיריבונוקלאית מזרע סלמון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31149</td><td>רכיב חיץ הכלאה</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>רכיב חיץ דנטורציה</td></tr><tr><td>טריסודיום ציטראט דיהידראט</td><td>VWR</td><td>PROL27833.363</td><td>מאגר העברה</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>Amresco</td><td>227</td><td>Wash Buffer</td></tr><tr><td>רכיב אלבומין בסרום בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>רכיב מאגר היברידיזציה</td></tr><tr><td>פריימרים אקראיים של Hexamer</td><td>Bioline</td><td>BIO-38028</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5'-triphosphate-32P-ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td></td></tr><tr><td>אחסון זרחן מסך</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GEHE28-9564-76</td><td>BAS-IP MS 3543 E רב תכליתי תקן 35 ס"מ x 43 ס"מ מסך</td></tr><tr><td>טייפון FLA 7000</td><td>GE Healthcare מדעי החיים</td><td>28-9558-09</td><td>הדמיה של כתם</td></tr><tr><td>בקבוק הכלאה</td><td>UVP</td><td>07-0194-02</td><td>35 מ"מ x 300 מ"מ</td></tr></tbody></table>

התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב<i&gt; e. coli</i&gt; באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכא

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

מכשולים המצויים על גבי ה- DNA, כוללים חלבונים בחוזקה נכנס ונגעים שונים, יכולים לעכב את ההתקדמות קשה של השכפול של התא. ההשתהות של replisome יכולה להוביל את ניתוק מן כרומוזום, או באופן חלקי או בשלמותו, מובילה לקריסה של המזלג שכפול. ההתאוששות מקריסה זו היא הכרח עבור התא שכפול כרומוזומליות מלא במדויק ולאחר מכן לחלק. לכן, כאשר הקריסה מתרחשת, התא התפתח מנגנונים מגוונים המתרחשים לשחזר את מזלג DNA ולאפשר שכפול להסתיים עם איכות גבוהה. בעבר, מסלולי תיקון שכפול אלה בחיידקים נחקרו באמצעות נזק UV, אשר יש לו את החיסרון של לא להיות מקומי לאתר ידוע. כתב יד זה מתאר מערכת ניצול מערכת מפעיל הקרינה מדכא (FROS) כדי ליצור בלוק חלבון מסוים באתר שיכולים לגרום השתהות וקריסה של שכפול FOrks ב coli Escherichia. פרט הפרוטוקולים כיצד מצב של שכפול ניתן דמיינו תאים בודדים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ביניים DNA שכפול יכול להיות מנותח על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose 2-ממדי. מוטציות טמפרטורה רגישות של רכיבי replisome (למשל DnaBts) יכולות להיות משולבות לתוך המערכת כדי לגרום לקריסה סינכרוני של המזלגות שכפול. יתר על כן, את התפקידים של חלבונים רקומבינציה helicases כי הם מעורבים בתהליכים אלה ניתן ללמוד באמצעות knockouts הגנטי בתוך מערכת זו.

FROS הוא בלוק nucleoprotein מושרה, אתר ספציפי המאפשר ביניים שכפולים להיות דמיינו בתאי חי 12,18. עיצוב ניסיוני כללי על דגימת תאים מתואר באיור 1. העיתוי של דגימת וריאציות רקע גנטי לעשות זה מערכה צדדית ללימוד התיקון של גוש כזה. סכמטית ממחישה עד כמה מוטציות רגישות טמפרטורה, כגון dnaB ts ו dnaC ts שנוצלו בעבר 18, יכולות להיות מנוצלות במערכת זו. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

אנו מתארים כאן מערכת המשתמשת בבלוק חלבון in vivo ספציפי לאתר, הפיך כדי לעכב ולמוטט מזלגות שכפול ב-Escherichia coli. הקמת בלוק השכפול מוערכת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל אגרוז ניטרלי-ניטרלי משמשת להדמיית חומרי ביניים לשכפול.

התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב<i&gt; E. coli</i&gt; באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכא

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לעכב מזלג רפליקציה במחסום נוקלאו-חלבון ולבחון את מבני ה-DNA באתר החסימה לצורך לימוד מסלולי תיקון DNA. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לרפליקציה ותיקון DNA, כגון האופן שבו ה-DNA מעובד כאשר מנגנון הרפליקציה של התא נתקל במחסום חלבוני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לעכב באופן הפיך מזלג רפליקציה במיקום ספציפי על הכרומוזום בתוך אוכלוסייה שלמה של תאים חיים.את הפרוצדורה הזו ידגימו חברי המעבדה שלי, ד"ר Karla Mettrick, והסטודנטיות לתארים מתקדמים Georgia Weaver ו-Tayla-Ann Corocher. עבור פרוצדורה זו נעשה שימוש בזן של E.coli הנושא מערך של אופרטור לתטרהציקלין בפלסמיד pKM1. pKM1 מקודד ל-TetR-YFP, חלבון מדכא תטרהציקלין הניתן להשראה ומסומן בחלבון פלואורסצנטי צהוב.דללו תרבית לילה טרייה של זן E.coli זה לצפיפות אופטית ב-600 nanometers של 0.01 במצע מורכב מדולל עם אנטיביוטיקה כנדרש לסלקציה. גדלו את התרבית ב-30 degrees celsius עם ניעור עד לצפיפות אופטית ב-600 nanometers של 0.05 עד 0.1. הסירו דגימה של 10 milliliter שתשמש כביקורת לא מושרה.הוסיפו 0.01% arabinose לתרבית הנותרת כדי להשרות את ייצור ה-TetR-YFP מתוך pKM1. המשיכו לגדל הן את התרביות הבלתי-מושרות והן את התרביות המושרות בטמפרטורה של 30 degrees celsius עם ניעור. לאחר שעה אחת, בדקו את נוכחותו של מוקד בודד בתוך כל תא בתרבית המושרה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.אם הוכח כי התאים המושרים חסומים, כפי שמעידה נוכחות של פוקוס בודד ביותר מ-70% מהתאים, רשמו את הצפיפות האופטית והוציאו 7.5 milliliters מהדגימה לצורך אנליזה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי. הוציאו דגימה שוות מהתרבית של ביקורת ללא השראה. לפני ביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הכינו את פדי האגרוז למניעת תזוזת התאים במהלך ההדמיה.עבור כל פד אגרוז, טפטף באמצעות פיפט 500 microliters של אגרוז מומס על עלית מיקרוסקופ והנח מעליה את זכוכית הכיסוי מיד לפני שהאגרוז מתמצק. אחסן את העליות בין רקמות רטובות בטמפרטורה של ארבעה degrees celsius עד למועד השימוש. כאשר מגיע הזמן לבדוק את התאים, הסר את זכוכית הכיסוי מפד האגרוז וטפטף באמצעות פיפט 10 microliters של תרבית חיידקים למרכז הפד.לאחר כחמש דקות, כאשר פדית האגרוז התייבשה, החזירו את לבישת הזכוכית. טפטפו טיפת שמן אימרסיה על לבישת הזכוכית והניחו את הפסיידה תחת מערכת האופטיקה. הדמינו את התאים באמצעות מיקרוסקופיה של פאזה בהגדלה של 100x.בתיבת הדו-שיח Acquire בתוכנת ההדמיה, הגדירו את זמן החשיפה (Exposure Time) ל-100 milliseconds. בחרו ב-Acquire כדי ללכוד את התמונה. אין להזיז את הבמה.בתיבת הדו-שיח Acquired, בחרו ב-YFP כתאורה עבור התריס החיצוני המקושר למצלמה. הגדירו את זמן החשיפה (Exposure Time) ל-1,000 מילישניות. כבו את תאורת הבמה ובחרו ב-Acquire כדי ללכוד את תמונת הפלואורסצנציה.כדי להתחיל בהליך זה, יש להוסיף sodium azide לדגימות תרבית שנאספו קודם לכן עד לריכוז סופי של 0.1% ולהדגיר על קרח למשך חמש דקות לפחות. יש לצנטריפוג את התאים ב-5,000 ×g למשך עשר דקות. יש להסיר את העלייה.יש להמיס מחדש כל משקע תאים ב-200 microliters של PIV buffer ולהעביר את התאים לשפופרת מיקרופוג'. יש לבצע סרכוז במיקרוצנטריפוגה להשקעת התאים ולהסיר את הנוזל העליון. יש לטפל בפתית מיקרוסקופ בעזרת 40 microliters של תמיסת סיליקון או חומר דוחה מים מתאים לזכוכית.שפשפו את הפסית עם טישיו עד שתהיה יבשה. השביו את התאים בעלת צפיפות התאים הנמוכה ביותר ב-50 µL של PIV והניחו בבלוק חימום בטמפרטורה של 50 °C. עבור כל שאר הדגימות, התאימו את נפחי ה-PIV כך שצפיפות התאים הסופית תהיה זהה בכל מבחנה.הוסיפו לדגימות נפח שווה של תמיסת 0.8%Agarose שהוכנה טרי ב-PIV. השאירו את הדגימות בבלוק חימום כדי להבטיח שהן יישארו מעל 50 °C למניעת התגבשות. טפטפו טיפות של 20 µL מתלי התאים-אגרוז על השקופית המטופלת כדי ליצור פלאגים (plugs) חצי-כדוריים.כאשר הפקקים התגבשו, החליקו בעדינות את כל הפקקים מדגימה אחת לתוך מבחנת מיקרופוג אחת והוסיפו 1 mL של בופר לליזה של תאים. הדגירו ב-37 °C למשך שעתיים. לאחר שעתיים, הסירו את בופר הלליזה של התאים והוסיפו 1 mL של תמיסת EDTA-Sarkosyl-Proteinase K או תמיסת ESP.דגרו ב-50 °C למשך לילה או עד שהפקקים יהיו שקופים. לאחר שהפקקים שקופים, הסירו את באפר ה-ESP והעבירו את הפקקים לשפופרת של 15 ml. הוסיפו 12 ml של באפר TE והמתינו 30 דקות.שטפו את הפלאגים (plugs) סך הכל חמש פעמים עם באפר TE. אחסנו את הפלאגים בטמפרטורה של 4°C ב-1 mL של באפר TE. כדי לנתח את תוצרי הביניים של השכפול, עוברים על ה-DNA בפלאגי האגרוז עיכול באמצעות אנזים הגבלה מתאים לאזור הנחקר.בדוגמה זו, EcoRV חותך את ה-DNA מיד לפני המערך, בתוך המערך ואחרי המערך, כדי להניב מקטעים של 5.5 kb ו-6.7 kb באזור העניין. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו פלאג אגרוז למבחנה של מיקרופוגה נקייה והוסיפו 150 µL של באפר לאנזים הגבלה. הוסיפו 25 עד 100 יחידות של אנזים הגבלה ובצעו עיכול ב-37 °C למשך שש עד שמונה שעות.הכינו ג'ל אגרוז בריכוז 0.4% בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. צקו 300 milliliters של אגרוז מומס לתבנית ג'ל בגודל של כ-25 על 25 סנטימטרים. הכניסו מסרק כדי ליצור בארות ברוחב הדומֶה בקירוב לקוטר הפלאג.כאשר הג'ל התקשח, הוציאו את המסרק והעבירו את הג'ל לטמפרטורת החדר. בעזרת לולאת תג Dealers, החליקו את אחד מתוכני האגרוז העיכולים לתוך באר, תוך מיקום הצד השטוח של התוכן כנגד דופן הבאר שדרכה ה-DNA ייכנס לג'ל. הכניסו תוכן בודד באופן דומה לכל באר שנייה.טפטפו אגרוז מומס בריכוז 0.4% לתוך הבארים כדי לאטום את הפקקים במקומם. טענו סולם DNA של 1 kb לבאר ריקה, תוך השארת רווח בין הסולם לדגימות. הריצו את הג'ל למשך הלילה ב-1xTBE בטמפרטורת החדר.ביום למחרת, צבעו את הג'ל באמבט מים המכיל 0.3 micrograms per milliliter של ethidium bromide למשך 20 דקות. הדמינו את ה-DNA באמצעות transilluminator UV בעל גל ארוך וגזרו כל מקטע של נתיב בחיתוך ישר ואחיד, תוך מזעור הכללת עודפי אגרוז משני צדי הנתיב. הניחו את נתיב הג'ל הגזור בתבנית ג'ל בזווית של 90 מעלות לכיוון נדידת ה-DNA.השלב הבא הוא הכנת 300 מיליליטר של agarose עבור הג'ל בממד השני. כאשר ה-agarose יתקרר ל-50 °C, העבירו בעזרת פיפט את ה-agarose הנוזלי מסביב לפרוסות הג'ל כדי לקבע את מיקומן. מזגו את יתרת ה-agarose לתבנית עד לעומק שיהיה לפחות בגובה פרוסות הג'ל.לאחר שהג'ל התמצק, בצעו אלקטרופורזה ב-1xTBE המכיל 0.3 micrograms per milliliter של ethidium bromide בטמפרטורה של ארבעה degrees celsius עד שה-DNA נדדה כ-10 centimeters. גזרו את הבלוקים שבהם נמצא ה-genomic DNA כולל הג'ל שמעליהם, כדי לכלול גם את ה-DNA שאינו נראה. ה-DNA בתוך הג'ל מודגש לאחר מכן באמצעות Southern hybridization כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.במערכת זו, חסימת שכפול אוששה על ידי רוב של תאים שהכילו מוקד אחד המתאים לעותק אחד של המערך בתוך התא. הוספה של anhydrotetracycline ביטלה את החסימה, ושכפול עוקב של המערך נצפה כהצטברות של תאים עם מוקדים מרובים. תאים שבהם השכפול היה חסום הראו גם עיכוב בצמיחה, שבוטל על ידי צמיחה עוקבת בנוכחות anhydrotetracycline.כדי לנתח את תוצרי הביניים של השכפול, ה-DNA הועבר באלקטרופורזה בממד הראשון. לאחר מכן נגזר ה-DNA הרלוונטי, ואלקטרופורזה בממד שני הניבה אלכסון של DNA ליניארי. היברידיזציית Southern של ה-DNA של המערך חשפה שתי נקודות בדגימה שלא נחסמה, התואמות למקטעים הצפויים של המערך בגודל 5.5kb ו-6.7kb.הדגימה החסומה הראתה ירידה בכתם של 5.5kb והתווסף אות אליפטי המעיד על הצטברות של DNA בצורת Y. הוספה של anhydrotetracycline ביטלה את האות של ה-DNA בצורת Y. תוצר ביניים נפוץ אחר הוא צומת הולידיי (Holliday junction), המופיע כאות בצורת קונוס בראש קשת ה-Y וכקו חד (spike) מה-DNA הליניארי בקצה קשת ה-Y.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בשמונה ימים אם היא מבוצעת כראוי. למרות שמדובר בהליך דו-ממדי (2D), חשוב לזכור כי איכות פלאגי ה-DNA היא קריטית להדמיה אופטימלית של מבני ה-DNA.

inducing-site-specific-replication-blockage-e-coli-using-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה מהירה ויעילה לשלב דנ"א זר של עניין תוך מוכנות זנים נוטלים, המכונות משטח נחיתה זנים, מתואר. השיטה מאפשרת לאתר ספציפי לשילוב של הקלטת ה-DNA לתוך לוקוס משטח מהונדסים הנחיתה של זן מסוים, דרך הצמידה וביטוי integrase ΦC31.

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

העיצוב של קידוד סינטטי אופרון גם מנגנון ההפרשה ומונומרים המבניים של סיבי curli מתואר. ייצור יתר של amyloids אלה ופולימרי חסיד מאפשר מדידת רווח של היצמדות...

הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד

מקור: Lea-Smith, D. J., et al. יצירת מוטציות מסומנות וחסרות סמן במינים ציאנובקטריאליים מודלים. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון מדגים שיטה ליצירת מוטציות המסומנות באנטיביוטיקה בציאנובקטריה. הפרוטוקול מתחיל בתרבית ציאנובקטריה, ואחריו צנטריפוגה ושלבי שטיפה המשמרים את פני השטח. לאחר מכן מוצג פלסמיד הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה המוקף ברצפים הומולוגיים. במהלך הדגירה, הפלסמיד מופנם באמצעות פילי ומחליף את גן המטרה באמצעות רקומבינציה הומולוגית. בחירת אנטיביוטיקה וריסוק משמשים לבידוד וטיהור הזן המוטנטי.

יצירת מוטציות המסומנות באנטיביוטיקה בציאנובקטריה באמצעות רקומבינציה הומולוגית

מקור: מטריק, ק. א., לורנס ואחרים, השראת חסימת שכפול ספציפית לאתר ב-E. coli באמצעות מערכת מפעילי מדכא פלואורסצנטי. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון הזה מדגים חסימת מזלג שכפול ספציפית לאתר ב-Escherichia coli באמצעות ביטוי מושרה על ידי ערבינוז של TetR חלבון פלואורסצנטי צהוב המתויג בקשר למערכי טטו כרומוזומליים.

חסימת שכפול מתווכת חלבון מדכא פלואורסצנטית באשריכיה קולי

סרטון זה מדגים בדיקת in vivo בחיידקים כדי לחקור את האינטראקציה של חלבונים קושרי RNA (RBPs) עם RNA. תאי החיידק מותמרים באמצעות שני מבני פלסמיד – פלסמיד באתר קשירה המקודד mRNA המכיל גן כתב פלואורסצנטי במורד הזרם של אתר קשירת RBP – בעוד פלסמיד RBP מבטא את חלבוני RBP תחת שליטתו של משרה. עם עלייה בתיווך המושרה בייצור RBP, ה-RBPs נקשרים ל-mRNA, וכתוצאה מכך דיכוי תרגומי של הכתב באמצעות עיכוב של קשירת ריבוזום.

כתב בדיקת דיכוי גנים לחקר רגולציה תרגומית של גן מטרה

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC), לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו נמצאת בשימוש אחרי דינמיקת הביטוי האקראית של גורם שעתוק, λ repressor...

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

הכנסת שינויים גנומיים מרובים לציאנובקטריה היא כלי חיוני בפיתוח זנים למטרות מחקר תעשייתי ובסיסי. אנו מתארים מערכת ליצירת מוטציות לא מסומנות במיני המודל הציאנובקטריאליים Synechocystis sp. PCC6803 ומוטציות מסומנות ב-Synechococcus sp. PCC7002.

הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים

כאן נציג של השיטה הניסיונית כדי לבחון את התפקיד של פלסמידים multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה.

בוחן את התפקיד של פלסמידים Multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה

המתוארים כאן היא שיטה לניתוח ביטוי גנים חיידקיים ברקמות בעלי חיים ברמה התאית. שיטה זו מספקת משאב ללמוד את הגיוון פנוטיפי המתרחשים בתוך אוכלוסיה חיידקי בתגובה הסביבה רקמות במהלך זיהום.

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

למד כיצד לעצור ולקרוס שכפול DNA ב-E. coli באמצעות חסימת חלבון פלורסנטית מדכאת. שיטה זו מאפשרת תצפית במבני DNA באתר החסימה וחקר נתיבי תיקון DNA בחיידקים חיים.

התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב

גלה סרטונים נוספים