התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לעכב מזלג רפליקציה במחסום נוקלאו-חלבון ולבחון את מבני ה-DNA באתר החסימה לצורך לימוד מסלולי תיקון DNA. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לרפליקציה ותיקון DNA, כגון האופן שבו ה-DNA מעובד כאשר מנגנון הרפליקציה של התא נתקל במחסום חלבוני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לעכב באופן הפיך מזלג רפליקציה במיקום ספציפי על הכרומוזום בתוך אוכלוסייה שלמה של תאים חיים.

את הפרוצדורה הזו ידגימו חברי המעבדה שלי, ד"ר Karla Mettrick, והסטודנטיות לתארים מתקדמים Georgia Weaver ו-Tayla-Ann Corocher. עבור פרוצדורה זו נעשה שימוש בזן של E.coli הנושא מערך של אופרטור לתטרהציקלין בפלסמיד pKM1. pKM1 מקודד ל-TetR-YFP, חלבון מדכא תטרהציקלין הניתן להשראה ומסומן בחלבון פלואורסצנטי צהוב.

דללו תרבית לילה טרייה של זן E.coli זה לצפיפות אופטית ב-600 nanometers של 0.01 במצע מורכב מדולל עם אנטיביוטיקה כנדרש לסלקציה. גדלו את התרבית ב-30 degrees celsius עם ניעור עד לצפיפות אופטית ב-600 nanometers של 0.05 עד 0.1. הסירו דגימה של 10 milliliter שתשמש כביקורת לא מושרה.

הוסיפו 0.01% arabinose לתרבית הנותרת כדי להשרות את ייצור ה-TetR-YFP מתוך pKM1. המשיכו לגדל הן את התרביות הבלתי-מושרות והן את התרביות המושרות בטמפרטורה של 30 degrees celsius עם ניעור. לאחר שעה אחת, בדקו את נוכחותו של מוקד בודד בתוך כל תא בתרבית המושרה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

אם הוכח כי התאים המושרים חסומים, כפי שמעידה נוכחות של פוקוס בודד ביותר מ-70% מהתאים, רשמו את הצפיפות האופטית והוציאו 7.5 milliliters מהדגימה לצורך אנליזה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי. הוציאו דגימה שוות מהתרבית של ביקורת ללא השראה. לפני ביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הכינו את פדי האגרוז למניעת תזוזת התאים במהלך ההדמיה.

עבור כל פד אגרוז, טפטף באמצעות פיפט 500 microliters של אגרוז מומס על עלית מיקרוסקופ והנח מעליה את זכוכית הכיסוי מיד לפני שהאגרוז מתמצק. אחסן את העליות בין רקמות רטובות בטמפרטורה של ארבעה degrees celsius עד למועד השימוש. כאשר מגיע הזמן לבדוק את התאים, הסר את זכוכית הכיסוי מפד האגרוז וטפטף באמצעות פיפט 10 microliters של תרבית חיידקים למרכז הפד.

לאחר כחמש דקות, כאשר פדית האגרוז התייבשה, החזירו את לבישת הזכוכית. טפטפו טיפת שמן אימרסיה על לבישת הזכוכית והניחו את הפסיידה תחת מערכת האופטיקה. הדמינו את התאים באמצעות מיקרוסקופיה של פאזה בהגדלה של 100x.

בתיבת הדו-שיח Acquire בתוכנת ההדמיה, הגדירו את זמן החשיפה (Exposure Time) ל-100 milliseconds. בחרו ב-Acquire כדי ללכוד את התמונה. אין להזיז את הבמה.

בתיבת הדו-שיח Acquired, בחרו ב-YFP כתאורה עבור התריס החיצוני המקושר למצלמה. הגדירו את זמן החשיפה (Exposure Time) ל-1,000 מילישניות. כבו את תאורת הבמה ובחרו ב-Acquire כדי ללכוד את תמונת הפלואורסצנציה.

כדי להתחיל בהליך זה, יש להוסיף sodium azide לדגימות תרבית שנאספו קודם לכן עד לריכוז סופי של 0.1% ולהדגיר על קרח למשך חמש דקות לפחות. יש לצנטריפוג את התאים ב-5,000 ×g למשך עשר דקות. יש להסיר את העלייה.

יש להמיס מחדש כל משקע תאים ב-200 microliters של PIV buffer ולהעביר את התאים לשפופרת מיקרופוג'. יש לבצע סרכוז במיקרוצנטריפוגה להשקעת התאים ולהסיר את הנוזל העליון. יש לטפל בפתית מיקרוסקופ בעזרת 40 microliters של תמיסת סיליקון או חומר דוחה מים מתאים לזכוכית.

שפשפו את הפסית עם טישיו עד שתהיה יבשה. השביו את התאים בעלת צפיפות התאים הנמוכה ביותר ב-50 µL של PIV והניחו בבלוק חימום בטמפרטורה של 50 °C. עבור כל שאר הדגימות, התאימו את נפחי ה-PIV כך שצפיפות התאים הסופית תהיה זהה בכל מבחנה.

הוסיפו לדגימות נפח שווה של תמיסת 0.8%Agarose שהוכנה טרי ב-PIV. השאירו את הדגימות בבלוק חימום כדי להבטיח שהן יישארו מעל 50 °C למניעת התגבשות. טפטפו טיפות של 20 µL מתלי התאים-אגרוז על השקופית המטופלת כדי ליצור פלאגים (plugs) חצי-כדוריים.

כאשר הפקקים התגבשו, החליקו בעדינות את כל הפקקים מדגימה אחת לתוך מבחנת מיקרופוג אחת והוסיפו 1 mL של בופר לליזה של תאים. הדגירו ב-37 °C למשך שעתיים. לאחר שעתיים, הסירו את בופר הלליזה של התאים והוסיפו 1 mL של תמיסת EDTA-Sarkosyl-Proteinase K או תמיסת ESP.

דגרו ב-50 °C למשך לילה או עד שהפקקים יהיו שקופים. לאחר שהפקקים שקופים, הסירו את באפר ה-ESP והעבירו את הפקקים לשפופרת של 15 ml. הוסיפו 12 ml של באפר TE והמתינו 30 דקות.

שטפו את הפלאגים (plugs) סך הכל חמש פעמים עם באפר TE. אחסנו את הפלאגים בטמפרטורה של 4°C ב-1 mL של באפר TE. כדי לנתח את תוצרי הביניים של השכפול, עוברים על ה-DNA בפלאגי האגרוז עיכול באמצעות אנזים הגבלה מתאים לאזור הנחקר.

בדוגמה זו, EcoRV חותך את ה-DNA מיד לפני המערך, בתוך המערך ואחרי המערך, כדי להניב מקטעים של 5.5 kb ו-6.7 kb באזור העניין. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו פלאג אגרוז למבחנה של מיקרופוגה נקייה והוסיפו 150 µL של באפר לאנזים הגבלה. הוסיפו 25 עד 100 יחידות של אנזים הגבלה ובצעו עיכול ב-37 °C למשך שש עד שמונה שעות.

הכינו ג'ל אגרוז בריכוז 0.4% בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. צקו 300 milliliters של אגרוז מומס לתבנית ג'ל בגודל של כ-25 על 25 סנטימטרים. הכניסו מסרק כדי ליצור בארות ברוחב הדומֶה בקירוב לקוטר הפלאג.

כאשר הג'ל התקשח, הוציאו את המסרק והעבירו את הג'ל לטמפרטורת החדר. בעזרת לולאת תג Dealers, החליקו את אחד מתוכני האגרוז העיכולים לתוך באר, תוך מיקום הצד השטוח של התוכן כנגד דופן הבאר שדרכה ה-DNA ייכנס לג'ל. הכניסו תוכן בודד באופן דומה לכל באר שנייה.

טפטפו אגרוז מומס בריכוז 0.4% לתוך הבארים כדי לאטום את הפקקים במקומם. טענו סולם DNA של 1 kb לבאר ריקה, תוך השארת רווח בין הסולם לדגימות. הריצו את הג'ל למשך הלילה ב-1xTBE בטמפרטורת החדר.

ביום למחרת, צבעו את הג'ל באמבט מים המכיל 0.3 micrograms per milliliter של ethidium bromide למשך 20 דקות. הדמינו את ה-DNA באמצעות transilluminator UV בעל גל ארוך וגזרו כל מקטע של נתיב בחיתוך ישר ואחיד, תוך מזעור הכללת עודפי אגרוז משני צדי הנתיב. הניחו את נתיב הג'ל הגזור בתבנית ג'ל בזווית של 90 מעלות לכיוון נדידת ה-DNA.

השלב הבא הוא הכנת 300 מיליליטר של agarose עבור הג'ל בממד השני. כאשר ה-agarose יתקרר ל-50 °C, העבירו בעזרת פיפט את ה-agarose הנוזלי מסביב לפרוסות הג'ל כדי לקבע את מיקומן. מזגו את יתרת ה-agarose לתבנית עד לעומק שיהיה לפחות בגובה פרוסות הג'ל.

לאחר שהג'ל התמצק, בצעו אלקטרופורזה ב-1xTBE המכיל 0.3 micrograms per milliliter של ethidium bromide בטמפרטורה של ארבעה degrees celsius עד שה-DNA נדדה כ-10 centimeters. גזרו את הבלוקים שבהם נמצא ה-genomic DNA כולל הג'ל שמעליהם, כדי לכלול גם את ה-DNA שאינו נראה. ה-DNA בתוך הג'ל מודגש לאחר מכן באמצעות Southern hybridization כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.

במערכת זו, חסימת שכפול אוששה על ידי רוב של תאים שהכילו מוקד אחד המתאים לעותק אחד של המערך בתוך התא. הוספה של anhydrotetracycline ביטלה את החסימה, ושכפול עוקב של המערך נצפה כהצטברות של תאים עם מוקדים מרובים. תאים שבהם השכפול היה חסום הראו גם עיכוב בצמיחה, שבוטל על ידי צמיחה עוקבת בנוכחות anhydrotetracycline.

כדי לנתח את תוצרי הביניים של השכפול, ה-DNA הועבר באלקטרופורזה בממד הראשון. לאחר מכן נגזר ה-DNA הרלוונטי, ואלקטרופורזה בממד שני הניבה אלכסון של DNA ליניארי. היברידיזציית Southern של ה-DNA של המערך חשפה שתי נקודות בדגימה שלא נחסמה, התואמות למקטעים הצפויים של המערך בגודל 5.5kb ו-6.7kb.

הדגימה החסומה הראתה ירידה בכתם של 5.5kb והתווסף אות אליפטי המעיד על הצטברות של DNA בצורת Y. הוספה של anhydrotetracycline ביטלה את האות של ה-DNA בצורת Y. תוצר ביניים נפוץ אחר הוא צומת הולידיי (Holliday junction), המופיע כאות בצורת קונוס בראש קשת ה-Y וכקו חד (spike) מה-DNA הליניארי בקצה קשת ה-Y.

לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בשמונה ימים אם היא מבוצעת כראוי. למרות שמדובר בהליך דו-ממדי (2D), חשוב לזכור כי איכות פלאגי ה-DNA היא קריטית להדמיה אופטימלית של מבני ה-DNA.