התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב E. coli באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכא

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לעכב מזלג שכפול בבלוק נוקלאופרוטאין ולצפות במבני ה-DNA באתר הבלוק לצורך חקר מסלולי תיקון DNA. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי שכפול ותיקון DNA, כגון כיצד ה-DNA מעובד כאשר מנגנון השכפול של התא נתקל במחסום חלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לעכב באופן הפיך מזלג שכפול במיקום מסוים על הכרומוזום על פני אוכלוסייה שלמה של תאים חיים.

מי שידגים את ההליך הזה יהיו החברות הבאות במעבדה שלי, ד"ר קרלה מטריק, והסטודנטית לתואר שני, ג'ורג'יה וויבר וטיילה-אן קורושר. זן E.coli הנושא מערך אופרטור טטרציקלין בפלסמיד pKM1 משמש להליך זה. pKM1 מקודד עבור TetR-YFP, חלבון מדכא טטרציקלין צהוב הניתן להשראה.

לדלל תרבית לילה טרייה של זן E.coli זה לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר של 0.01 בתווך מורכב מדולל עם אנטיביוטיקה כנדרש לבחירה. גדל את התרבות ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר של 0.05 עד 0.1. הסר דגימה של 10 מיליליטר כדי לשמש כבקרה לא מושרת.

הוסף 0.01% ארבינוז לתרבית הנותרת כדי לגרום לייצור TetR-YFP מ-pKM1. המשך לגדל הן את התרביות הלא מושרות והן את התרביות המושרות ב -30 מעלות צלזיוס עם טלטול. לאחר שעה, בדוק אם יש מוקד יחיד בתוך כל תא של התרבית המושרה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

אם התאים המושרים מאושרים חסומים, המסומנים על ידי יותר מ -70% מהתאים בעלי מיקוד יחיד, רשום את הצפיפות האופטית והסר 7.5 מיליליטר מהדגימה לניתוח על ידי אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל. הסר דגימה שווה ערך מתרבית הבקרה הלא מושרת. לפני מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הכינו את רפידות האגרוז למניעת תנועת התאים במהלך ההדמיה.

עבור כל כרית אגרוז, פיפטה 500 מיקרוליטר של אגרוז מותך על שקופית מיקרוסקופ ומכסה את הכיסוי מיד לפני שהאגרוז מתמצק. אחסן את השקופיות בין רקמות רטובות בארבע מעלות צלזיוס עד הצורך. כשהגיע הזמן לבדוק את התאים, הסר את הכיסוי מכרית האגרוז ופיפטה 10 מיקרוליטר של תרבית חיידקים על מרכז הרפיד.

לאחר כחמש דקות, כאשר כרית האגרוז התייבשה, החלף את הכיסוי. הניחו טיפת שמן טבילה על הכיסוי והניחו את המגלשה מתחת לאופטיקה. דמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופ פאזה בהגדלה של פי 100.

בתיבת הדו-שיח Acquire בתוך תוכנת ההדמיה, הגדר את זמן החשיפה ל- 100 אלפיות השנייה. בחר Acquire כדי ללכוד את התמונה. אל תזיז את הבמה.

בתיבת הדו-שיח נרכש, בחר YFP כתאורה עבור התריס החיצוני המקושר למצלמה. הגדר את זמן החשיפה ל-1,000 אלפיות השנייה. כבה את תאורת הבמה ובחר רכוש כדי ללכוד את תמונת הקרינה.

כדי להתחיל בהליך זה, הוסף נתרן אזיד לדגימות תרבית שנאספו בעבר לריכוז סופי של 0.1% ודגר על קרח למשך חמש דקות לפחות. צנטריפוגה של התאים ב -5, 000 פעמים גרם למשך עשר דקות. השליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש כל כדור תא ב-200 מיקרוליטר של מאגר PIV והעבירו את התאים לצינור מיקרופוגה. מיקרו-צנטריפוגה כדי לגלול את התאים ולהשליך את הסופרנטנט. טפל בשקופית מיקרוסקופ עם 40 מיקרוליטר של דוחה מים מזכוכית או תמיסת סיליקון מתאימה.

משפשפים את השקופית עם טישו עד שהיא יבשה. השעו מחדש את התאים עם צפיפות התאים הנמוכה ביותר ב-50 מיקרוליטר של PIV והניחו ב-50 מעלות צלזיוס בגוש חום. עבור כל שאר הדגימות, התאם את נפחי ה-PIV כך שצפיפות התא הסופית תהיה זהה בכל צינור.

הוסף נפח שווה של תמיסת אגרוז טרייה של 0.8% ב-PIV לדגימות . שמור את הדגימות בבלוק החום כדי להבטיח שהן מעל 50 מעלות צלזיוס כדי למנוע התמצקות. הנח 20 טיפות מיקרוליטר של תרחיף התאים-אגרוז על השקופית המטופלת כדי לייצר פקקים חצי כדוריים.

כאשר התקעים התמצקו, החלק בעדינות את כל התקעים מדגימה אחת לתוך צינור מיקרופוגה יחיד והוסף מיליליטר אחד של מאגר ליזה תאים. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר שעתיים, הסר את מאגר הליזיס של התאים והוסף 1 מיליליטר של תמיסת EDTA-Sarkosyl-Proteinase K או ESP.

דגירה בחום של 50 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד שהתקעים שקופים. לאחר שהתקעים שקופים, הסר את מאגר ה-ESP והעבר את התקעים לצינור של 15 מיליליטר. מוסיפים 12 מיליליטר של מאגר TE ומניחים לעמוד למשך 30 דקות.

שטפו את התקעים בסך הכל חמש פעמים עם מאגר TE. אחסן את התקעים בארבע מעלות צלזיוס במיליליטר אחד של מאגר TE. כדי לנתח את תוצרי הביניים של השכפול, ה-DNA בפקקי האגרוז מתעכל עם אנזים הגבלה מתאים לאזור העניין.

בדוגמה זו, EcoRV חותך את הדנ"א מיד לפני המערך, בתוך המערך ואחרי המערך, כדי לתת שברים של 5.5 קילו-בייט ו-6.7 קילו-בייט באזור העניין. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו פקק אגרוז לצינור מיקרופוגה טרי והוסיפו 150 מיקרוליטר של מאגר אנזים הגבלה. הוסיפו 25 עד 100 יחידות של אנזים הגבלה ועכלו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך שש עד שמונה שעות.

הכינו ג'ל אגרוז 0.4% בארבע מעלות צלזיוס. יוצקים 300 מיליליטר אגרוז מותך למגש ג'ל בגודל של כ -25 על 25 סנטימטרים. הכנס מסרק כדי להפוך את הבארות לרוחב זהה לקוטר התקע.

כאשר הג'ל מתייצב, הסר את המסרק והעביר את הג'ל לטמפרטורת החדר. בעזרת לולאת חיסון, החלק את אחד מפקקי האגרוז המעוכלים לבאר, ומקם את הצד השטוח של הפקק כנגד צד הבאר שבו ה-DNA ייכנס לג'ל. הכנס תקע בודד באותו אופן לכל באר שנייה.

פיפטה מותכת 0.4% אגרוז לתוך הבארות כדי לאטום את הפקקים במקומם. טען סולם DNA של קילו-בייט אחד בבאר ריקה, והשאיר פער בין הסולם לדגימות. יש למרוח את הג'ל למשך הלילה ב-1xTBE בטמפרטורת החדר.

למחרת, יש להכתים את הג'ל באמבט מים המכיל 0.3 מיקרוגרם למיליליטר של אתידיום ברומיד למשך 20 דקות. דמיין את ה-DNA עם משדר UV בעל גל ארוך וחתוך כל שבר נתיב בחיתוך ישר ואחיד הממזער את הכללת עודפי האגרוז משני צידי הנתיב. הנח את נתיב הג'ל הכרות במגש ג'ל ב-90 מעלות לכיוון נדידת ה-DNA.

השלב הבא הוא הכנת 300 מיליליטר אגרוז לג'ל הממד השני. כאשר האגרוז מקורר ל -50 מעלות צלזיוס, פיפטה את האגרוז המותך סביב פרוסות הג'ל כדי למצק את מיקומן. יוצקים את יתרת האגרוז למגש לעומק שלפחות שווה לפרוסות הג'ל.

לאחר שהג'ל מתמצק, אלקטרופור אותו ב-1xTBE המכיל 0.3 מיקרוגרם למיליליטר של אתידיום ברומיד בארבע מעלות צלזיוס עד שה-DNA נדד כ-10 סנטימטרים. כרתו את הבלוקים שבהם קיים ה-DNA הגנומי כולל הג'ל שמעליו, כדי לכלול את ה-DNA שאינו נראה. ה-DNA בתוך הג'ל מודגם לאחר מכן על ידי הכלאה דרומית כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

במערכת זו, בלוק שכפול אושר על ידי רוב התאים המכילים מוקד אחד המתאים לעותק אחד של המערך בתוך התא. התוספת של אנהידרוטטרציקלין הפכה את החסימה ושכפול המערך לאחר מכן הוצג כהצטברות של תאים עם מוקדים מרובים. תאים עם שכפול חסום הראו גם עיכוב גדילה שהתהפך על ידי צמיחה לאחר מכן בנוכחות אנהידרוטטרציקלין.

כדי לנתח את תוצרי הביניים של השכפול, ה-DNA עבר אלקטרופורזה בממד הראשון. לאחר מכן נכרת ה-DNA המעניין ואלקטרופורזה של הממד השני הביאה לאלכסון של DNA ליניארי. הכלאה דרומית של ה-DNA של המערך חשפה שתי נקודות בדגימה הלא חסומה המתאימות לשברי המערך הצפויים של 5.5kb ו-6.7kb.

הדגימה החסומה הראתה ירידה בנקודה של 5.5kb ותוספת של אות אליפטי המעיד על הצטברות של DNA בצורת Y. תוספת של אנהידרוטטרציקלין ביטלה את אות ה-DNA בצורת Y. ביניים נפוץ נוסף הוא צומת הולידיי המוצג כאות חרוט בחלק העליון של קשת ה-Y וספייק מה-DNA הליניארי בקצה קשת ה-Y.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שמונה ימים אם היא מבוצעת כראוי. אמנם מדובר בהליך דו-ממדי, אך חשוב לזכור שאיכות פקקי ה-DNA היא קריטית להדמיה אופטימלית של מבני ה-DNA.