זיהוי פתוגנים לדגים באמצעות ניתוח חוזרות משתנה (VNTR)

התחל עם פלטת PCR המכילה תמיסת פירוק מבוססת פורמיד.

הוסף לכל באר את אמפליקוני ה-PCR המדוללים שמקורם בחיידק פתוגני לדגים.

אמפליקונים אלו מכילים חזרות טנדם (VNTRs) עם תגיגות פלואורסצנטיות, רצפים קצרים וחוזרים המשמשים כסמנים גנטיים לזיהוי חיידקים.

אטום את הפלטה והצנטריפוגה כדי להסיר בועות אוויר.

חממו את הפלטה במחזור תרמי כדי לפרק את ה-VNTRs הדו-גדיליים.

פורמיד משפר את הפרדת הגדילים ומעכב את החיישת החומרים מחדש.

קרר את הלוח במהירות כדי לייצב את ה-DNA החד-גדילי.

צנטריפוגה לאיסוף נפח הדגימה.

הסר את האטימה, וקבע את הפלטה עם מסגרת.

הניחו את צינור הנימים ובצעו אלקטרופורזה נימית.

במהלך אלקטרופורזה, קטעי VNTR נודדים דרך הנימים תחת שדה חשמלי ומופרדים לפי גודל.

לייזר מעורר את התגיות הפלואורסצנטיות על כל קטע, ומייצר אותות מקודדים בצבעים.

האלקטרופרוגרמה המתקבלת מראה דפוסי שיא של VNTR התואמים לחיידק הפתוגני.

לאחר אישור האמפליקונים של PCR, יש להשתמש ברצועות או לוחות PCR חדשים לדילול מוצרי PCR 1 עד 10 במים מזוהרים. מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר. בעת עבודה בארון אדים, הכינו תערובת ראשית בצינור צנטריפוגה המורכב מפורמיד ותמיסה סטנדרטית בגודל ייחוס.

בהתאם למספר מוצרי ה-PCR שיש לנתח, השתמש בנפחי תגובות כפי שמפורט בכתב היד. אפשר נפח עודף של 10%. Vortex לזמן קצר ומפזר 9.5 מיקרוליטר לבארות בודדות על פלטת PCR המתאימה למערכת