זיהוי פתוגנים לדגים באמצעות ניתוח חוזרות משתנה (VNTR)

התחל עם פלטת PCR המכילה תמיסת פירוק מבוססת פורמיד.

הוסף לכל באר את אמפליקוני ה-PCR המדוללים שמקורם בחיידק פתוגני לדגים.

אמפליקונים אלו מכילים חזרות טנדם (VNTRs) עם תגיגות פלואורסצנטיות, רצפים קצרים וחוזרים המשמשים כסמנים גנטיים לזיהוי חיידקים.

אטום את הפלטה והצנטריפוגה כדי להסיר בועות אוויר.

חממו את הפלטה במחזור תרמי כדי לפרק את ה-VNTRs הדו-גדיליים.

פורמיד משפר את הפרדת הגדילים ומעכב את החיישת החומרים מחדש.

קרר את הלוח במהירות כדי לייצב את ה-DNA החד-גדילי.

צנטריפוגה לאיסוף נפח הדגימה.

הסר את האטימה, וקבע את הפלטה עם מסגרת.

הניחו את צינור הנימים ובצעו אלקטרופורזה נימית.

במהלך אלקטרופורזה, קטעי VNTR נודדים דרך הנימים תחת שדה חשמלי ומופרדים לפי גודל.

לייזר מעורר את התגיות הפלואורסצנטיות על כל קטע, ומייצר אותות מקודדים בצבעים.

האלקטרופרוגרמה המתקבלת מראה דפוסי שיא של VNTR התואמים לחיידק הפתוגני.

לאחר אישור האמפליקונים של PCR, יש להשתמש ברצועות או לוחות PCR חדשים לדילול מוצרי PCR 1 עד 10 במים מזוהרים. מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר. בעת עבודה בארון אדים, הכינו תערובת ראשית בצינור צנטריפוגה המורכב מפורמיד ותמיסה סטנדרטית בגודל ייחוס.

בהתאם למספר מוצרי ה-PCR שיש לנתח, השתמש בנפחי תגובות כפי שמפורט בכתב היד. אפשר נפח עודף של 10%. Vortex לזמן קצר ומפזר 9.5 מיקרוליטר לבארות בודדות על פלטת PCR המתאימה למערכת האלקטרופורזה הקפילרית הזמינה.

לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיקרוליטר של מוצר PCR מדולל. אטימה וצנטריפוגה לזמן קצר. לאחר מכן, טען את הפלטה המכילה את הדגימות למחזור תרמו-מחזורי PCR ודנאטורציה של הדגימות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות לפני הקירור ל-4 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן.

צנטריפוגה בעוצמה של 1000 גרם למשך דקה, הסרת האטימה בזהירות והעמסת הפלטה על מערכת אלקטרופורזה קפילרית מכויילת לפי הוראות היצרן. ניתוח קטעי ריצה: אלקטרופורזה קפילרית, תוך שימוש בתגובות המתאימים למכשיר המועדף, והתאמת תנאי הריצה בהתאם לתיאור בכתב היד.