Name: מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: למדו שיטת גנוטיפינג מהירה ויעילה לדגי זברה באמצעות PCR וניתוח התמסה ברזולוציה גבוהה. השיטה מאפשרת זיהוי מוטציות ושינויים בנוקלאוטיד בודד במהירות ובאמינות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברים של מעבדות Blaschke, גרינוולד, וWittwer לקבלת ייעוץ וסיוע טכני. עבודה זו נתמכת על ידי קרן PCMC, NIH R01 MH092256 וDP2 MH100008, והמצעד הפרוטות קרן # מענק מחקר 1-FY13-425, לJLB.

1. ה-DNA הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר תמוגה-DNA: 50 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ טריס-HCl pH 8.3, 0.3% Tween 20, NP40 0.3%. להוסיף טרי proteinase K לריכוז סופי של 1 מ&quot;ג / מיליליטר ביום של שימוש 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף רקמות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקליפ סנפיר דגים הבוגר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי דגים: מניחים את הדג ב0.004% MS-222 פתרון (tricaine). חכה עד שתנועת זימים מאטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הדג על ערימה של 5-10 Kimwipes ולחתוך חתיכה קטנה של סנפיר הזנב, על 2-3 מ&quot;מ, בסכין גילוח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות למקום הדגים במכל שכותרתו עם מים טריים להתאוששות; לתייג גם את המכל וצינור מקביל שיכיל את הקליפ הסנפיר בזהירות. להחליף את המים ולהאכיל את הדגים כל יום אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים את הקליפ הסנפיר עם קצה פיפטה סטרילית ולהעביר אותו לתוך צינור מלא ב100 מאגר תמוגה DNA μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את קצה פיפטה, וזורקים את סכין הגילוח לתוך מיכל חד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקליפ זנב עובר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עוברים ל0.004% MS-222 פתרון (tricaine). לחכות 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכה של זנב עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הזנב לתוך צינור שכותרתו מלא ב30 מאגר תמוגה DNA μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות הכניס את העובר לתוך צינור המכיל 100 paraformaldehyde μl 4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות לייבל עם עוברים וצינורות הזנב המקביל שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הצינורות עם עוברים על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה קיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המלקחיים באמצעות מים מילי-Q וKimwipes בין כל עובר כדי למזער את הזיהום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל עוברים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עוברים ל0.004% MS-222 פתרון (tricaine). לחכות 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 1-5 עובר בצינור מלא ב100 מאגר תמוגה DNA μl. Dechorionation אינו הכרחי. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול ה-DNA דגירה צינורות עם (קליפים סנפיר או זנב או עוברים) רקמה על 55 מעלות צלזיוסעבור 4 שעות עד 12 הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית proteinase K צינורות חום ל-C ° 95 15 12 דקות. ה-DNA צריך לשמש עבור PCR באופן מיידי, או מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. </li></ol> 2. PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Primers עיצוב באופן ידני או על ידי תוכנת עיצוב פריימר (למשל Lightscanner פריימר עיצוב תוכנת Biofire). מוצרי ה-PCR לHRMA הם בדרך כלל 50-200 נ&quot;ב; מוצרי ה-PCR לגילוי SNP צריכים להיות, בדרך כלל 50-80 נ&quot;ב קטן יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע תגובת PCR בצלחת 96 היטב או 384 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 10 μl נפח כולל: 4 תמהיל μl LightScanner מאסטר (0.1 U חם להתחיל תקי-AB פולימראז, חיץ, 0.2 dNTPs מ&quot;מ, כלוריד 2 מ&quot;מ מגנזיום, ו1x צבע מחייב גדילי הדנ&quot;א כפול ניאון); 5 pmol כל צבע יסוד, ותבנית הדנ&quot;א הגנומי μl 1 חולץ מסנפיר זנב מבוגר או 3 הדנ&quot;א הגנומי μl מזנב עוברי 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות כיסוי עם 30 שמן מינרלי μl. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הצלחת עם חותם דבק אופטי שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל את תנאי תנאים טיפוסיים רכיבה על אופניים PCR הם 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו30 מחזורים של 10 שניות ב 95 מעלות צלזיוס, 25 שניות ב 60 ° C, 30 שניות ב72 מעלות צלזיוס, שהסתיימו עם 95 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות ומקוררות 15 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות PCR חנות ב 4 מעלות צלזיוס או להמשיך ישירות לHRMA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר המוצר ה-PCR שלנו על ידי ניתוח של הגודל שלה באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose במהלך אופטימיזציה ראשונית של ה-PCR, ואם הצביע, על ידי רצף של המוצר ה-PCR. </li></ol></li></ol> 3. HRMA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות חום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת במערכת ניתוח להמיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה (LightScanner תוכנה התקשר-IT 2.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות חום 60-95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור קובץ אחסון נתונים חדש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נתונים HRMA (איור 2). שלבים מרובים של ניתוח הם אפשריים. אנחנו מראים את הסט הנפוץ ביותר של m נתוניםanipulations. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת משנה לחץ על כרטיסיית משנה. בחר את הבארות עם דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נורמליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה לנרמל בפנל השמאלי. לחסל את שונות הקרינה, מיקום באופן ידני כפול הקו המקביל בטרום (ראשוני) ואזורים שלאחר להמיס (סופי) כפי שמודגם (איור 2C, ראשי חץ) ולנרמל את אותות premelt וקרינה שלאחר להמיס של כל הדגימות ל1 ו 0 , בהתאמה 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המיקום של הקווים כך שהאזור להמיס הוא בתחום שבין לפני ואחרי להמיס הקווים, אך לא נבחר. באופן כללי, מינימלי הנמוך יותר ויותר מקסימום (והמינימום עליון ועליון מקס) צריכים להיות ממוקמים קווי טמפרטורה כ 1 ° C לגזרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עמדות טמפרטורה לנורמליזציה כאלה שיש להם את כל הדגימות (100%) הקרינה המרבית או מלאה לאזור premelt והמינימום או לא (0%) הקרינה לאזור שלאחר להמיס (כמיטב possible). נורמליזציה צריכה לגרום לקו כמעט אופקי בקרינה המרבית של 1 המשתרעת עד לנקודה שנמסה ולאחר מכן קו כמעט אופקי מהנקודה להמיס בקרינה המינימלית של 0; לא צריכה להיות רמות הקרינה מעל 1 או מתחת 0 . לדוגמא, באיור 2C, לנרמל את קימורי premelting באמצעות טווחי טמפרטורה של 79-80 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוץ / קיבוץ באשכולות להבחין גנוטיפים המבוססים על טמפרטורת ההתכה שלהם (איור 2 ג, קופסא ירוקה). בחר קיבוץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר Autogroup מרשימת בחירת התקנים תחת סעיף הקיבוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר רגיל או גבוה להתכת פרופילים עם מעברים בודדים או מעברים מרובים בהתאמה מרשימת בחירת הרגישות תחת סעיף הקיבוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Compute בחרקבוצות תחת סעיף הקיבוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לתפריט הקובץ ולחץ על השמירה כדי לשמור את התוצאות. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Sander, J. D., Cade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li>
<li>Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li>
<li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+%28HRMA%29%3A+more+than+just+sequence+variant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutation%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening.</a> Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).</li>
<li>Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), (2012).</li>
<li>Liew, M., Pryor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+single-nucleotide+polymorphisms+by+high-resolution+melting+of+small+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons.</a> Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%3A+cross-platform+comparison+of+instruments+and+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes.</a> Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).</li>
<li>Carrillo, J., Martínez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+analysis+for+the+identification+of+novel+mutations+in+DKC1+and+TERT+genes+in+patients+with+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cell.+Mol.+Dis.%22%5BJournal%5D)">High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita.</a> Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).</li>
<li>Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melt+analysis+%28HRMA%29%3B+a+viable+alternative+to+agarose+gel+electrophoresis+for+mouse+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping.</a> PloS one. 7 (9), (2012).</li>
<li>Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+hotspot+mutation+scanning+by+a+novel+and+highly+sensitive+high-resolution+small+amplicon+melting+analysis+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method.</a> J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
<li>Xing, L., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+foxP2+zinc+finger+nuclease+mutant+has+normal+axon+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding.</a> PloS one. 7 (8), (2012).</li>
<li>Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+High+Resolution+Melting+analysis+as+an+alternate+tool+to+screen+for+risk+alleles+associated+with+small+kidneys+in+Indian+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns.</a> BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Expanded+instrument+comparison+of+amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping.</a> Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).</li>
<li>Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Genotyping+by+Amplicon+Melting+Analysis+Using+LCGreen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen.</a> Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).</li>
<li>Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+closed-tube+methylation-sensitive+high+resolution+melting+assay+%28MS-HRMA%29+for+the+semi-quantitative+determination+of+CST6+promoter+methylation+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples.</a> BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).</li>
<li>Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+two+broad-range+PCR+assays+for+pathogen+detection+in+positive-blood-culture+bottles%3A+PCR-high-resolution+melting+analysis+versus+PCR-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry.</a> J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

PCR בשילוב עם HRMA הוא טכנולוגיה רבת עוצמה לגנוטיפ דג הזברה. היתרונות של גישה זו הם המהירות שלו, חוסן, ורגישות לזיהוי מוטציות אפילו נקודה. כל הפרוטוקול, מניתוח כדי להמס עקומת סנפיר קליפ, יכול להתבצע תוך פחות משמונה שעות על ידי אדם אחד. בנוסף, הטכניקה היא נוחה להקרנת תפוקה גבוהה; אינו מחייבת את השימוש במתיל בethidium; ואטום לכל PCR וצעדי ניתוח אשר מסייע למזער את בעיות זיהום. צעד קריטי לטכניקה זו הוא amplicon PCR ו...

דג הזברה (Danio rerio) היא מערכת מודל חוליות בשימוש נרחבת למחקרים של פיתוח ומודלים מחלה. לאחרונה, טכנולוגיות מהונדסים ומוטציה רבות פותחו עבור דג הזברה. טכניקות transgenesis מהירה, בדרך כלל מבוססות על מערכת transposon Tol2 1, כבר בשילוב עם אפשרויות שיבוט משופרות להרכבת קטע DNA מספר 2. nucleases אבץ האצבע (ZFNs) וnucleases השעתוק כמו activator-מפעיל (TALENs) שימשו למקד לוקוסים בשני תאים סומטיים וgermline ב3,4 דג הזברה. טכניקות אלו יעילות יכולות ליצור בעלי חיים מהונדסים גנטי, עם יצירת מוטציה בתדירות גבוהה וניבט קו תמסורת 3,4. למרות ההתפתחויות הללו, טכניקות גנוטיפ מסורתיות בדג הזברה להגביל את העצמה המלאה של הכלים mutagenesis וtransgenesis. PCR ואחריו ג&#39;ל אלקטרופורזה, לעתים בשילוב עם restrictioעיכול אנזים n, נעשה שימוש נרחב כדי לזהות שינוי הגנום, אבל הוא גוזל זמן ופחות רגיש לזהות הוספות קטנות או מחיקות. יש מבחני הבדיקה TaqMan עלויות ראשוניות גבוהות ודורשים אופטימיזציה זהירה. רצף של מוצרי ה-PCR יכול לקחת כמה ימים ולא מעשי להקרנה בקנה מידה גדולה. ניתוח פולימורפיזם בר הגבלת אורך (RFLP) יכול רק להפלות SNPs המשפיע על מגוון מצומצם של אתרי הכרת אנזים הגבלה. ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה (HRMA), שיטת ניתוח סגור צינור שלאחר PCR, היא שיטה שפותחה לאחרונה, כי הוא מהיר, רגיש, זול, ונוח להקרנת מספר גדול של דגימות. HRMA יכול לשמש כדי לזהות SNPs, מוטציות, וtransgenes 5-7. HRMA מבוסס על denaturation תרמית של DNAs פעמיים תקועים, ויש לו כל amplicon PCR דיסוציאציה ייחודית (להמס) אופיינית 5. יכולה להיות מופלים לדגימות לא בשלo ההרכב שלהם שונה נוקלאוטיד, תוכן GC, או האורך, בדרך כלל בשילוב עם צבע פלואורסצנטי שרק נקשר גדילי הדנ&quot;א כפול 8. לפיכך, HRMA יכול להבחין גנוטיפים שונים בהתבסס על המאפיינים להמיס עקומה השונות. בגלל HRMA משתמש ריאגנטים עלות נמוכה והוא תהליך שלאחר PCR בשלב יחיד, ניתן להשתמש בו לאסטרטגיות תפוקה גבוהה. HRMA הוא הורסות, כך שלאחר ניתוח amplicons PCR יכולה לשמש ליישומים אחרים. HRMA הוחל באורגניזמים רבים ומערכות, כוללים שורות תאים, עכברים ובני אדם 9-11. לאחרונה השימוש בו כבר תאר בדג זברה כדי לזהות מוטציות הנגרמות על ידי nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וTALENs 6,12,13. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לבצע HRMA PCR מבוסס בדג זברה עוברית ובוגרת (איור 1). פרוטוקול זה מתאים לאיתור SNPs, transgenes, ומוטציות, ובכלל זה siשינויי ngle בסיס זוג, הוספות או השמטות.

<table><tbody><tr><td>100 Reaction LightScanner Master Mix</td><td>BioFire</td><td>HRLS-ASY-0002</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>מעטפת קשיחה PCR 96 בארות BLK/WHT לוחות</td><td>Bio-Rad מעבדות</td><td>HSP9665</td><td></td></tr><tr><td>www.bio-rad.com אטמי דבק Microseal 'B' מעבדות</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001 www.bio-rad.com</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר LightScanner 96 בארות</td><td>BioFire</td><td>LSCN-ASY-0040</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>תוכנת LightScanner עם Call-IT 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>ניתוח התכה ברזולוציה גבוהה 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>LightScanner תוכנת עיצוב פריימר</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>וקטור NTI תוכנה</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מהירה ויעילה דג הזברה genotyping באמצעות pcr עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

דג הזברה היא מודל למערכת בעלי חוליות רבת עוצמה ללימוד פיתוח, דוגמנות מחלה, וביצוע הקרנת סמים. לאחרונה מגוון רחב של כלים גנטיים הוכנסו, כולל אסטרטגיות רבות לגרימת מוטציות ויצירת קווים מהונדסים. עם זאת, הקרנה בקנה מידה גדולה היא מוגבלת על ידי שיטות גנוטיפ מסורתיות, אשר גוזל זמן ועבודה אינטנסיבית. כאן אנו מתארים טכניקה לנתח גנוטיפים דג הזברה על ידי PCR בשילוב עם ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה (HRMA). גישה זו היא מהירה, רגישה, ולא יקרה, עם סיכון נמוך יותר של חפצי זיהום. Genotyping ידי PCR עם HRMA יכולה לשמש לעוברים או דגים בוגרים, לרבות בפרוטוקולי הקרנת תפוקה גבוהה.

הפרוטוקול ניתן לבצע במהלך יום אחד או פרוד בשלבים על פני כמה ימים (תרשים זרימה של עבודה מוצג באיור 1). מיצוי DNA אחריו להמיס וניתוח של amplicons ה-PCR. הטמפרטורות ללהמס של amplicon תלוי בגודל וGC-התוכן, אבל בדרך כלל מתחילות וטמפרטורות סוף 50 ˚ C ו 95 ˚ C מתאימות (2A דמויות ו2B). ברגע שלהמס מתבצע, הניתוח של העקומות להמיס הקרינה בדרך כלל דורש נורמליזציה של הווריאציה של עקומות מדגם השונות, תוך שימוש מראש ובאזורים שלאחר להמיס כתקנים (איור 2 ג)....

PCR בשילוב עם ניתוח ברזולוציה גבוהה להמיס (HRMA) הוא הוכיח כשיטת מהירה ויעילה לגנוטיפ דג הזברה.

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא סריקה מהירה של גנוטיפים, מוטציות או טרנסגנים שונים בדגי zebrafish. הדבר מתבצע תחילה על ידי מיצוי DNA מגזירי רקמה דקים, ולאחר מכן הגברה של ה-DNA באמצעות PCR. השלב הבא הוא דנטורציה של תוצרי ה-PCR (Amplicons) תוך כדי הקלטה של עקומות ההמסה, אשר מנותחות באמצעות תוכנה.בסופו של דבר, התוצאות מראות עקומות התכה נבדלות עבור גנוטיפים שונים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון PCR עם ג'ל אלקטרופורזה, הוא הרגישות לשינויים של נוקלאוטיד בודד, להחדרות קטנות ולמחיקות, וכן העובדה שטכניקה זו מהירה ואמינה. למרות שניתן להשתמש בטכניקה זו לביצוע גנוטיפינג מהיר ואפקטיבי של דגי זברה, ניתן ליישמה גם במערכות ובאורגניזמי מודל אחרים, כולל שורות תאים, עכברים ובעלי חיים אחרים.ביום הכנת ה-DNA, הוסיפו proteinase K טרי למסלק הליזה בריכוז של 1 mg/mL. ניתן לאסוף רקמה מדג בוגר באמצעות קליפ דק או מדג עוברי. ראשית, הרדימו את הדג בתמיסת Trica.המתינו עד שתנועת הזימים תואט. לאחר מכן, הניחו את הדג על ערימה של נייר סופג, ובאמצעות להב תער סטרילי, חתכו חתיכה קטנה של סנפיר הזנב באורך של כ-2 עד 3 מילימטרים. העבירו במהירות את הדג למכל מסומן עם מים טריים לצורך התאוששות.הרימו את קטע הסנפיר בעזרת טיפ של פיפטה סטרילית והעבירו אותו למבחנה המכילה 100 µL של תמיסת ליזיס של DNA. הקפידו לסמן הן את מיכל הדג והן את המבחנה; דגרו את כל הרקמות שנאספו למשך ארבע שעות לפחות ועד ללילה שלם בטמפרטורה של 55 °C. לאחר הדגירה, השביתו את החלבון ACE K על ידי חימום המבחנות בטמפרטורה של 95 °C למשך 15 דקות.יש להשתמש בדגימות אלה ל-PCR באופן מיידי, אך ניתן לאחסנן גם בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים. בצע את ה-PCR בלוחית של 96 או 384 בארות עבור כל תגובה. ערבב לא יותר מ-1 µL של ה-DNA מהמבוגר עם 4 µL של light scanner.תערובת מאסטר (Master mix) המכילה את הגשוש הפלואורסצנטי ואת הפריימרים בריכוז סופי של five pico molar לכל אחד. אם ה-DNA היה מעובר, השתמש בעד 3 µL. כסה את התגובות ב-30 µL של שמן מינרלי ולאחר מכן סגור אותן היטב.בשלב הבא, כסו את פלטת ה-PCR הטעונה באמצעות מדבקת איטום שקופה אופטית. כעת בצעו אופטימיזציה לתנאי מחזורי ה-PCR. סט תנאים טיפוסי מתחיל בחמש דקות של זמן המסה.לאחר מכן מבצעים 30 מחזורי PCR עם שלב דנטורציה של עשר שניות, זמן היסננה של 25 שניות ו-30 שניות של מארכה. התגובה צריכה להסתיים בשלב דנטורציה נוסף של 32 שניות ולאחר מכן קירור ל-15 °C. נתח את פלטת ה-PCR על ידי הצבתה במערכת לניתוח עקומות התכה בתוכנה.הגדירו את הטמפרטורה וצרו קובץ אחסון נתונים חדש. הגדירו תת-קבוצה. בחרו את הבארים עם הדגימות בצד השמאלי התחתון של המסך.בחר בלשונית ה-normalized כדי לבטל וריאנטים פלואורסצנטיים. מקם ידנית את הקו הכפול המקבילי באזורי ה-prem, ה-melt וה-post melt, ונרמל את אותות הפלואורסצנציה של ה-premel וה-post melt של כל הדגימות לאחד ולאפס, בהתאמה. לאחר מכן, הבחן בין הגנוטיפים על סמך טמפרטורת ההמסה שלהם על ידי בחירה ראשונית ב-grouping.לאחר מכן, בחרו auto group מרשימת הבחירה הסטנדרטית. תחת סעיף הקיבוץ (grouping), בחרו normal או high עבור פרופילי המסה בעלי מעברים בודדים או מעברים מרובים, בהתאמה. אלו מופיעים ברשימת בחירת הרגישות תחת סעיף הקיבוץ.כעת בחרו בקבוצות חישוב (compute groups) תחת סעיף הקיבוץ (grouping), ולאחר מכן עברו לתפריט הקבצים ולחצו על שמירה כדי לשמור את התוצאות. ניתן לבצע את הפרוטוקול במהלך יום אחד או לחלקו לשלבים לאורך מספר ימים. בעת ביצוע PCR, הטמפרטורות עבור התכת (melt) האמפליקון תלויות בגודל ובתוכן ה-GC, אך באופן כללי, טמפרטורות התחלה וסיום של 60 °C ו-95 °C הן מתאימות ברגע שההתכת מתבצעת.ניתוח עקומות ההמסה הפלואורסצנטיות דורש בדרך כלל נורמליזציה של השונות בין עקומות הדגימות השונות, תוך שימוש באזורים שלפני ואחרי ההמסה כסטנדרטים. דבר זה משפר את השוואת התוצאות מדגימות שונות, שבהן השונות בפלואורסצנציה קשורה לשינויים ניסיוניים מינוריים. יש למקם כל זוג קווי טמפרטורה לנורמליזציה במרווח של כמעלה אחת צלזיוס (°C) זה מזה.ניתן לייצג את הנתונים בשתי דרכים: באמצעות גרף המציג את קבצי פרופילי עקומות ההמסה, או באמצעות גרף המציג תרשים הפרשים חיסורי בהשוואה לדגימת ייחוס; בעקבות ניתוח HRMA ניתן לזהות מוטציות או טרנסגנים. שתי מוטציות שונות בגן EIF2B5 מסומנות על ידי העקומות האדומות והכחולות. דגימות מוטנטיות אלו מזוהות על ידי הבדל משמעותי בצורת עקומת ההמסה שלהן, או בשינוי בפלואורסצנציה בהשוואה לעקומות הסטנדרטיות של סוג הבר (wild type).דוגמה זו של ארבעה גנוטיפים שונים באסופה אחת של עוברים ממחישה את העוצמה והרגישות של השיטה. ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצעה בפחות משמונה שעות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ביצוע HRMA לסריקה יעילה בקנה מידה גדול של גנוטיפים של דגי זבראפיש.

rapid-efficient-zebrafish-genotyping-using-pcr-with-high-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר מיצוי DNA מקליפס זנב של דג זברה. הפרוטוקול מדגים שיטה מהירה ויעילה לניתוח גנוטיפים של דגי זברה.

מיצוי DNA מקליפ זנב: שיטה המשמשת בגנוטיפ של דגי זברה

בסרטון זה, אנו מתארים טכניקת PCR התכה ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע את פולימורפיזם האורך של מקטעי DNA באורכי רצף משתנים, בהתבסס על ניתוח טמפרטורת התכה.

PCR נמס ברזולוציה גבוהה לקביעת וריאציות רצף ברצפי DNA מוטנטיים

בעוד ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה מציע את היכולת להבחין בין פולימורפיזם של נוקלאוטיד הבודד באוכלוסייה הטרוגנית, הטיה ההגברה אלל מוטנטי יכולה להגדיל את יכולתה לזהות אללים נוכחים באחוזים נמוכים יחסית בתוך מדגם. פרוטוקול זה מתאר שיפורים המשפרים את הרגישות של ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה.

שיטות כדי להגדיל את הרגישות של רזולוציה גבוהה התכה יחידה נוקלאוטיד פולימורפיזם Genotyping במלריה

טכניקת גנוטיפ המתוארת כאן, אשר זוגות תגובת השרשרת של פולימראז פלורסנט (PCR) כדי נימי ג'ל אלקטרופורזה, מאפשרת גנוטיפ תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. זה עוקף מגבלות בפני טכניקות גנוטיפ אחרות הוא יותר חסכוני מאשר שיטות סידור.

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

הגנום יישוב עריכה במערכת מודל רזבורה rerio (דג זברה) כבר באופן משמעותי בהנחייתם של הופעתה של גישות CRISPR. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול יעילים, חזקים הדור, זיהוי של אללים נגזר CRISPR שטויות המשלבת וזמינותו ניידות heteroduplex וזיהוי מוטציות באמצעות הדור הבא רצפי.

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

דג זברה שימשו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA במהלך הפיתוח. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש דג זברה העוברים של פרופיל שכפול תזמון. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות ללמוד שכפול תזמון מוטציות, סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה ו מינים אחרים.

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

דג זברה שימשו מודל גנטי אמין האורגניזמים במחקר ביו-רפואי, במיוחד עם כניסתו של טכנולוגיות לעריכת ג'ין. כאשר הזחל פנוטיפים צפויים, זיהוי ה-DNA החילוץ, גנוטיפ יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מתארים הליך genotyping יעיל עבור הזחלים דג זברה, מאת הזנב מסיכה, מוקדם ככל 72-h שלאחר ההפריה.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

טכנולוגיות לעריכת גנים אפשרו לחוקרים ליצור מוטציות דג זברה לחקור פונקציה גנטית בקלות יחסית. כאן, אנו מספקים מדריך לבצע היפוך העובר מקבילי וכימות של אותות היברידיזציה באתרו ב zebrafish. גישה זו לא משוחדת מספק דיוק גדול יותר בניתוחים פנוטיניים המבוססים על היברידיזציה באתרו.

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג'ל.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון חלבונים עם תג חלבון פלואורסצנטי בזחלי דג הזברה, מערכת in vivo שפותחה לאחרונה ושונתה שימושית במיוחד להדמיית חלבונים בשפע נמוך בדג הזברה.

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

למדו שיטת גנוטיפינג מהירה ויעילה לדגי זברה באמצעות PCR וניתוח התמסה ברזולוציה גבוהה. השיטה מאפשרת זיהוי מוטציות ושינויים בנוקלאוטיד בודד במהירות ובאמינות.

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

גלה סרטונים נוספים