מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסנן במהירות גנוטיפים, מוטציות או טרנסגנים שונים בדג הזברה. זה מושג על ידי חילוץ DNA תחילה מקליפסים דקים ולאחר מכן הגברת ה-DNA על ידי PCR. השלב הבא הוא דנטורציה של אמפליקוני ה-PCR תוך הקלטת עקומות ההיתוך, המנותחות על ידי תוכנה.

בסופו של דבר, התוצאות מראות עקומות התכה ניתנות להבחנה עבור גנוטיפים שונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטה קיימת כמו ג'ל אלקטרופורזה בנפח PCR, הוא שהיא רגישה לשינויים בנוקלאוטידים בודדים, החדרה קטנה, כל המחיקות, וטכניקה זו מהירה ואמינה. למרות שטכניקה זו עשויה לשמש לגנוטיפ מהיר ויעיל של דגי זברה, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות ואורגניזמים מודלים, כולל קווי תאים, עכברים ובעלי חיים אחרים.

ביום הכנת ה- DNA, הוסף חלבון K טרי למאגר הליזיס בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר. ניתן לאסוף רקמות מדג בוגר באמצעות קליפס דק או מדג עוברי. ראשית יש להרדים את הדג בתמיסת טריקה.

המתן עד שתנועות הזימים יאטו. לאחר מכן הניחו את הדג על ערימת טישו ובעזרת סכין גילוח סטרילי, חתכו חתיכה קטנה מסנפיר הזנב באורך של כשניים עד שלושה מילימטרים. הניחו במהירות את הדגים במיכל מסומן עם מים מתוקים להתאוששות.

הרם את קליפ הסנפיר עם קצה פיפטה סטרילי והעביר אותו לצינור מלא ב-100 מיקרוליטר של מאגר ליזה DNA. הקפידו לסמן גם את המיכל של החיה וגם את הצינור, דגרו על כל הרקמות שנאספו למשך ארבע שעות לפחות ועד לילה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס לאחר הדגירה. השבת את החלבון ACE K על ידי חימום הצינורות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

יש להשתמש בדגימות אלו ל-PCR באופן מיידי, אך ניתן לאחסן אותן גם במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שלושה חודשים. בצע את ה-PCR בצלחת באר של 96 או 384 עבור כל תגובה. שלב לא יותר ממיקרוליטר אחד של ה- DNA הבוגר עם ארבעה מיקרוליטר של סורק אור.

תערובת מאסטר המכילה את הגשושית הפלואורסצנטית ופריימרים בריכוז סופי של חמישה פיקו טוחנת כל אחד. אם ה-DNA היה מעובר, השתמש בעד שלושה מיקרוליטר. מכסים את התגובות ב -30 מיקרוליטר שמן מינרלי ואז מכסים אותן.

לאחר מכן, כסו את לוחית ה-PCR הטעונה באטם דבק שקוף אופטית. כעת בצע אופטימיזציה של תנאי המחזור של PCR. סט מצבים טיפוסי מתחיל בחמש דקות של זמן התכה.

לאחר מכן 30 מחזורי PCR עם עשר שניות התכה, 25 שניות של זמן כריעה ו-30 שניות של התארכות. התגובה צריכה להסתיים בהתכה נוספת של 32 ואז להתקרר ל -15 מעלות צלזיוס. נתח את לוחית ה-PCR על ידי הכנסתה למערכת ניתוח התכה בתוכנה.

הגדר את הטמפרטורה וצור קובץ אחסון נתונים חדש. הגדר קבוצת משנה. בחר את הבארות עם דוגמאות בצד השמאלי התחתון של המסך.

בחר את הכרטיסייה המנורמלת כדי לבטל גרסאות פלורסנט. מקם ידנית את הקו הכפול המקביל באזורי טרום, התכה ואחרי התכה ונרמל אותות פלורסנט של פרמל ואחרי התכה של כל הדגימות לאחד ואפס בהתאמה. לאחר מכן, הבחין בין הגנוטיפים על סמך טמפרטורת ההיתוך שלהם על ידי בחירת קיבוץ תחילה.

לאחר מכן בחר קבוצה אוטומטית מרשימת הבחירה הרגילה. תחת קטע הקיבוץ, בחר נורמלי או גבוה עבור פרופילים נמסים עם מעברים בודדים או מעברים מרובים בהתאמה. הם נמצאים ברשימת בחירת הרגישות תחת מקטע הקיבוץ.

כעת בחר קבוצות מחשוב תחת קטע הקיבוץ ולאחר מכן עבור לתפריט הקובץ ולחץ על שמור כדי לשמור את התוצאות. ניתן לבצע את הפרוטוקול במהלך יום אחד או להפריד אותו בשלבים על פני מספר ימים. בעת ביצוע PCR, הטמפרטורות להתכה של האמפליקון תלויות בגודל ובתכולת ה-GC, אך בדרך כלל טמפרטורות התחלה וסיום של 60 מעלות צלזיוס ו-95 מעלות צלזיוס מתאימות לאחר ביצוע ההמסה.

ניתוח עקומות ההיתוך הפלואורסצנטי דורש בדרך כלל נורמליזציה של הווריאציה של עקומות הדגימה השונות תוך שימוש באזורים לפני ואחרי ההיתוך כסטנדרטים. זה משפר את ההשוואה בין תוצאות מדגימות שונות שבהן השונות של הקרינה קשורה לשינויים ניסיוניים קלים. יש למקם כל זוג קווי טמפרטורה לנורמליזציה במרחק של כמעלה צלזיוס זה מזה.

ניתן לייצג את הנתונים בשתי דרכים על ידי גרף המציג את קבצי פרופילי עקומת ההיתוך, או על ידי גרף המציג עלילת הפרש חיסור בהשוואה לדגימת ייחוס בעקבות ניתוח HRMA ניתן לזהות מוטציות או טרנסגנים. שתי מוטציות שונות בגן EIF 2 B 5 מצוינות על ידי העקומות האדומות והכחולות. דגימות מוטנטיות אלה מזוהות על ידי ההבדל המשמעותי שלהן בעקומת ההיתוך שלהן, בצורות או בשינוי הקרינה בהשוואה לעקומות הטבע הסטנדרטיות.

דוגמה זו של ארבעה גנוטיפים שונים באוסף יחיד של עוברים ממחישה את העוצמה והרגישות של השיטה. לאחר המאסטר, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משמונה שעות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע HRMA להקרנה יעילה בקנה מידה גדול של גנוטיפים של דג הזברה.