פרוטוקול המעבדה הגנטית ניתוחים תוכן הבטן של הימית Macroinvertebrates באמצעות קבוצה ספציפית rDNA תחל

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לשפר את החקירות של אקולוגיה טרופית, במיוחד מדגימות שדה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האקולוגיה של שרשרת המזון, כגון ההשפעה של מינים פולשים על אינטראקציות טרופיות. היתרון העיקרי הוא היישום הנוסף לשילוב זמן רב יותר של ניתוחים טרופיים עבור אותן דגימות בדיוק ושניתן ליישם אותו כמעט על ידי כל אקולוג.

למרות שביססנו גישה זו כדי לספק תובנה לגבי צריכת הטרף של צרכני מים, ניתן ליישם אותה גם למטרות אחרות, למשל, כדי לקבוע את הרכב המינים בתוך דגימות מקרו-חסרי חוליות בנתיים. מי שידגים את ההליך יהיה כריסטיאן סודמן, טכנאי מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בניסוי זה, העבירו את מערכת העיכול של טורף שנותח בעבר לצינור תגובה של שני מיליליטר המכיל 440 מיקרוליטר של מאגר מיצוי מלח.

הקפיאו מיד את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד למיצוי ה-DNA. לאחר הוצאת הדגימות מהמקפיא, התחל במיצוי DNA באמצעות מלקחיים כדי להוסיף חרוז נירוסטה אחד של חמישה מיליליטר לכל צינור דגימה, ולאחר מכן השאר את הדגימות על הספסל בטמפרטורת החדר להפשרה. בעזרת טחנת חרוזים, הומוגניזציה של הדגימות למשך דקה אחת ב -15 הרץ.

לאחר סיבוב הדגימות תוך זמן קצר, הוסף לדגימות 90 מיקרוליטר של 10% SDS וחמישה מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K. לאחר מכן, מערבלים היטב את הדגימות, ומדגרים אותן ב-60 מעלות צלזיוס עם ניעור מתמיד ב-400 סל"ד ב-ThermoMixer למשך שעה. כדי לקדם עוד יותר את הליזה, מערבול את הדגימות כל 10 דקות במהלך הדגירה הזו.

לאחר סיבוב צנטריפוגה קצר, פיפטה 350 מיקרוליטר של חמש נתרן כלורי מולארי לתוך הדגימות. מערבולת למשך 30 שניות עד דקה כדי לערבב לחלוטין את הדגימות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 16, 200 פעמים גרם בחמש מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.

לכן אחד הדברים הקריטיים ביותר כאשר מוציאים את הדגימות מהצנטריפוגה הוא להימנע מכך שהחרוזים זזים ומפריעים לכדור המכיל את כל החלקיקים שצריך להסיר על ידי הצעד. לאחר מכן, העבירו בזהירות כ-600 מיקרוליטר של סופרנטנט לתוך צינור חדש של 1.5 מיליליטר, והקפידו לא להפריע לגלולה. הוסף 600 מיקרוליטר איזופרופנול קר כקרח, והפוך בזהירות את הצינור כמה פעמים.

יש לאחסן בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הוצאת הדגימות מהמקפיא, יש לצנטריפוגה אותן בחום של 16, 200 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. השליכו את הסופרנטנט תוך הקפדה לא לאבד את הגלולה, והשתמשו בנייר טישו כדי לייבש בזהירות את הצינור.

שטפו את הכדורים המכילים DNA על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של 70% אתנול קר כקרח ולאחר מכן צנטריפוגה ב-16, 200 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. השליכו את חומר הטישו בזהירות, והשתמשו בנייר טישו נטול מוך כדי לייבש בזהירות את הצינור. לבסוף, בעזרת פיפטה של 10 מיקרוליטר המותאמת לשמונה מיקרוליטר, הסר בזהירות את הסופרנטנט שנותר, והקפד לא להפריע לגלולה.

יבש את הגלולה עד שכל האתנול מתאדה. לאחר מכן הוסיפו 50 עד 100 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, מערבולת קצרה והשאירו בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להמיס את הגלולה. כדי לאמת את היעילות התפקודית של דגימות DNA המופקות כאן, בדוק כל אחת מהן באמצעות PCR, באמצעות ערכות פריימר אוניברסליות המתאימות למקור המזון המתאים.

התחל בהוספת פריימרים, תערובת dNTP, מאגר תגובה, Taq DNA פולימראז ומים מטוהרים בצינור תגובה של 1.5 או 2.5 מיליליטר ומערבולת תערובת התגובה הסטנדרטית. כעת, עבור כל דגימת DNA, העבירו מיקרוליטר אחד של תמצית DNA מתאימה לתשעה מיקרוליטרים של תערובת התגובה הסטנדרטית בתוך צלחת PCR. סגור את הצלחת, והנח אותה לתוך התרמו-סייקלר והתחל את תוכנית ה-PCR.

לאחר תגובת ה-PCR המוגמרת, השתמש באפשרות ריצה קצרה של מיני צנטריפוגה כדי לסובב את מוצרי ה-PCR. לאחר מכן מערבבים שלושה מיקרוליטר מכל מוצר PCR עם מיקרוליטר אחד של שש פעמים טעינת צבע. טען את הדגימות הללו לתוך חריצי ג'ל של ג'ל אגרוז שהוכן בעבר.

טען 1.5 מיקרוליטר של סולם DNA של 100 זוגות בסיסים לחריץ אחד של הג'ל כתקן גודל. סגור את המכסה של יחידת האלקטרופורזה, חבר אותה לאספקת חשמל והפעל את הג'ל ב-100 וולט לסנטימטר למשך 35 דקות. לאחר הפעלת האלקטרופורזה, הסר את הג'ל והניח אותו באמבט מכתים שהוכן בעבר למשך כ -10 דקות.

לבסוף, הסר את הג'ל מאמבט הצביעה, והנח אותו על מערכת תיעוד ג'ל, ודמיין אותו בהתאם למדריך. כדי לנתח את תכולת המעיים של הטורף, השתמש בתמיסות עבודה שהוכנו בעבר של תמצית DNA. בצע תגובות PCR נפרדות עבור כל אחת מ-16 ערכות הפריימר הספציפיות לקבוצת הטרף.

כלול בקרה חיובית אחת עם DNA מדגימה השייכת לקבוצת הטרף המתאימה ובקרה שלילית אחת עם DNA ממין הטורף. חיוני לתעד את הקצאת הדגימה בתוך כל לוחית PCR בדיוק כדי להימנע מאיגום דגימות שונות תוך העמסתן על לוחית ריצוף לזיהוי רצף הקצאה ובסופו של דבר הקצאת תוצאות שגויות לאדם צרכן. לאחר מכן, הפעל את תגובות ה-PCR באמצעות אותו פרוטוקול כפי שתואר קודם לכן, מותאם לטמפרטורת החישול הספציפית ולמספר המחזור עבור כל ערכת פריימר בשימוש.

כדי לזהות את השברים המוגברים בתגובות PCR אלה, הפעל ניתוחי שברים אוטומטיים בשתי קבוצות, A ו-B.הכן תערובת המכילה תמיסת טעינת דגימה, או SLS, ואת תקן הגודל המתאים לכל אצווה. לאחר מכן, הפשירו את מוצרי ה-PCR שהוקפאו בעבר של שמונה תגובות ה-PCR השייכות לאצווה המתאימה, וודאו שהם נשמרים בחושך. השתמש באפשרות ריצה קצרה של מיני צנטריפוגה כדי לסובב אותם.

על לוחית ריצוף, טען את מספר הבארות המתאים למספר הדגימות שיש לנתח עם 22 מיקרוליטר מהתערובת הסטנדרטית בגודל SLS המתאימה עבור כל דגימה. לאחר מכן טען מיקרוליטר אחד של תוצר PCR של כל אחת משמונה תגובות ה-PCR לבארות ההתאמה של הצלחת. לאחר מכן, השתמש באפשרות ריצה קצרה של צנטריפוגה מיני צלחת כדי לסובב בזהירות את התערובת הזו.

לאחר מכן, מכסים כל באר בטיפה אחת של שמן מינרלי. לאחר מכן מלאו את בארות התגובה של לוחית חיץ ב-250 עד 300 מיקרוליטר של מאגר הפרדת DNA. השתמש בתוכנת רצף הנימים כדי ליצור הגדרה לדוגמה בהתאם להוראות היצרן.

ודא שהקצאת הדגימות בתוך מערך הדגימה תואמת את הקצאת הדגימה בלוחית הרצף ושהגדרת הדגימה מכילה את השיטה המתאימה לעיבוד האצווה המתאימה. בעת ניתוח תוצאות, חשוב לבדוק מחדש ויזואלית את האלקטרופרוגרמה של כל דגימה ולאשר/לבטל כל שיא שנקרא עבור כל פריימר סמן שהוגדר בנפרד ולהכניס שיאים שלא נקראו המתאימים לקריטריונים של ערכת פריימר סמן באופן ידני או למחוק פסגות שגויות. לאחר ביצוע ניסויי הזנה כדי לקבוע את היעילות של ערכות פריימר ספציפיות לקבוצה שנקבעו עבור ניתוחי ה-PCR שבוצעו בפרוטוקול זה, תוצאות PCR באמצעות DNA ממערכת העיכול של הטורף נותחו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וכן פולימורפיזם קונפורמציה חד-גדילי, או SSCP.

אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז חשפה רצועות בודדות של DNA דו-גדילי, שלא ניתן היה להבחין בין מיני הטרף השונים שנחקרו. בניגוד לכך, אלקטרופורזה של SSCP הצליחה להבחין בין מיני הטרף השונים על ידי השוואת דגימות תכולת המעיים עם דגימות הייחוס. DNA שהופק מהמעיים של קרדית המים לאחר ניסוי האכלה רוצף בתקופות זמן שונות לאחר צריכת הטרף.

בין שעה ל-50 שעות לאחר האכלה, הכמויות היחסיות של ה-DNA של הטרף שזוהו הופחתו משמעותית. DNA שהופק מהאמפיפוד הפולשני, Dikerogammarus villosus gut, נבדק ל-DNA של טרף מקרו-חסרי חוליות באמצעות 16 ערכות פריימר ספציפיות לקבוצה המתוארות בפרוטוקול זה. רק 16% מתכולת המעיים של D.villosus הייתה חיובית ל-DNA השייך לכל אחד מ-16 מיני הטרף הממוקדים.

יתר על כן, DNA של 12 טקסוני טרף שנבדקו נמצא בדגימה אחת לפחות בעוד DNA של ארבעה טקסונים מעולם לא זוהה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להרגיע שהפריימרים המשמשים הם ספציפיים לטקסונים בתוך המערכת שלך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרחיב את המחקר שלך על אינטראקציות טרופיות על ידי השלמת השיטות המשמשות באופן שגרתי במעבדה שלך עם ניתוחים גנטיים.