השימוש זרימה טפטוף ו כורים דיסק סיבוב עבור Staphylococcus aureus Biofilm ניתוח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגדל ביופילמים חיידקיים בכוח נמוך או בינוני באמצעות כור ביופילם זרימת טפטוף או כור דיסק מסתובב. קופונים בביופילם מגיבים כפי שהם מחוסנים לראשונה בחיידקים ומודגרים ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאי החיידקים להיצמד למשטחי הגידול. לאחר שהתאים נצמדו לקופונים, מתחילה זרימה של מצע גדילה המייצר כוח עצום הפועל במהלך פיתוח הביופילם.

לאחר מכן ניתן לקצור ביופילמים בוגרים לצורך תצפית אנליזה של הביופילמים. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ניתן לבצע כדי לקבוע את מבנה האולטרה של הביופילמים המיוצרים. אני בלייז בולס.

היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות כמו תאי זרימה הוא שייצור ביומסה גבוה ומספר ביופילמים זהים מושגים בקלות. מי שידגים את ההליך הזה יהיו רייצ'ל סטיבנסון וקלי שוורץ, טכנאית וסטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כור הביופילם של זרימת הטפטוף מורכב מארבעה תאים עם יציאות כניסה לכניסת מדיה ויציאות יציאה ליציאת פסולת.

בתוך כל תא יש קופון נשלף שעליו גדל הביופילם. כדי להרכיב את כור הביופילם של זרימת הטפטוף, הנח את הקופונים בכל תא מקביל ואבטח את מכסי החדר. חיטוי הכור המורכב כמו גם צינורות התזונה השוטפים כדי לעקר את המערכת לפני השימוש.

כמו כן, חיטוי מצע הגידול של הביופילם כדי לחסן את כור זרימת הטפטוף המעוקר. הנח את המכשיר על משטח ישר והדק את קווי הקולחין. לאחר מכן, מלאו כל תא ב -10 מיליליטר מדיום גידול מבוסס מרק סויה טריפטיכון סטרילי, והוסיפו 100 מיקרוליטר סטפילוקוקוס זהוב.

תרבית לילה שגדלה באותו מדיום לכל תא בנפרד. הנח את הכור המחוסן באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות כדי לאפשר לתאים להיצמד למשטח הקופון. לאחר הדגירה, UNC מהדק את צינור הקולחין ומניח את הכור על חותך בלוקים מעץ בשיפוע לזווית של 10 מעלות. אספטית.

חבר את צינורות התזונה השוטפים לבקבוק המכיל מרק תזונתי בזרימה רציפה. הזינו את קו הצינור דרך המשאבה והקימו את הצינור על ידי הפעלת המשאבה במלוא המהירות. לאחר שהצינור השוטף מוכן, עצור את המשאבה והצמד מחטים בגודל 22 אינץ' לקצה כל צינור.

נגב את פקק כניסת החדר במגבון אתנול ובאופן אספטי. הכנס את המחטים דרך פקק הכניסה. הפעל את המשאבה ואפשר למדיום לטפטף על הקופונים.

בקצב זרימה של כ-125 מיקרוליטר לדקה, המדיה צריכה לזרום כלפי מטה מיציאת פקק הכניסה ליציאת הקולחין. הפעל את הכור בזרימה רציפה במשך שלושה ימים. מדי פעם בודק את הכור לניקוז תקין.

הניקוז נבדק על ידי בדיקה ויזואלית של התאים כדי לוודא שהמדיה אינה מתאגדת בתאים. אם המדיה מצטברת, צובטת, צינורות הזרימה בדרך כלל יקדמו ניקוז תקין לקצירת הביופילמים, עצירת המשאבה והוצאת המחטים מהכור. לאחר מכן הניחו את הכור על משטח ישר.

לאחר שלושה ימים של זרימה רציפה, ביופילמים של סטפילוקוקוס זהוב מופיעים כביומסה צהובה המתפשטת לאורך הקופונים המחוסנים. מיקרוגרף אלקטרונים סורק של הביופילם מגלה סטפילוקוקוס זהוב המכסה את הקופון בקהילת ביופילם הקשורה על פני השטח. על מנת לכמת את הביומסה המתקבלת, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להסיר את הקופונים, לקצור את החיידקים באמצעות מגרד תאים, ואז להעביר אותם לצינור חרוטי המכיל חמישה מיליליטר PBS סטרילי.

בעזרת רקמה, הומוגנייזר מפרק את גושי החיידקים עד לקבלת תרחיף אחיד. יחידות יוצרות מושבות מכומתות על ידי ציפוי דילולים סדרתיים על לוחות סוגאר טריפטיכון, דגירה במשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס וספירת מושבות. כור הביופילם של הדיסק המסתובב מורכב מסטאט כימוס שדרכו נשאב מדיום הגידול.

דיסק מסתובב עם סרגל כוכב ו-18 קופונים שנועדו להתאים לדיסק המסתובב. כדי להרכיב את הכור תחילה, טען את קופוני הדיסק המסתובב לתוך החריצים של הדיסק המסתובב. לאחר מכן, הנח את הדיסק הטעון בתוך זכוכית של ליטר אחד עם יציאת הצפה וכסה את הכור עם פקק גומי מספר 15 עם חור אחד לזרימת מדיה וחור אחד לאוורור.

חיטוי, הכור המורכב וצינורות הכניסה לעיקור המערכת. כדי לחסן את הכור, מלאו את הכוס ב -250 מיליליטר של מדיום תרבית סטרילי והוסיפו 500 מיקרוליטר של תרבית לילה של סטפילוקוקוס זהוב שגדל במרק סויה טריפטיכון. הנח את הכור על צלחת ערבוב המוגדרת על 250 סיבובים לדקה ודגר אותו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים להיצמד לקופונים.

לאחר הדגירה הלילית, חבר את צינור הכניסה ליציאה במאגר הבינוני ולמשאבה הפריסטלטית. הפעל את המשאבה והגדר את הזרימה ל -0.25 מיליליטר לדקה. אפשר לכור לפעול במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לקצור את הביופילמים שנוצרו.

עצור את הכור ובאופן אספטי. הסר את הדיסק מבלי לגעת בקופונים. בעזרת מלקחיים סטריליים, הסר את הקופונים וטבל בזהירות כל אחד מהם ב-PBS סטרילי כדי להסיר חיידקים המחוברים באופן רופף לבדיקת תרכובות אנטי-מיקרוביאליות.

באופן אספטי, הנח את הקופונים לבארות בודדות של צלחת 96 בארות המכילה תרכובות מעניינות. דגרו את הצלחת למשך ארבע שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו את הקופונים לצינורות מיקרו צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר המכילים PBS פעם אחת ופזרו את הביופילמים באמצעות הומוגנייזר.

לבסוף, דילול סדרתי של הצלחות של התאים על מדיום אגר מזין כדי לקבוע את מספר היחידות היוצרות מושבה ברות קיימא לדגימה כפי שתואר קודם לכן. גרף זה מציג את מספר היחידות היוצרות מושבה בביופילמים שהוכנו באמצעות כור הדיסק המסתובב ונחשפו למי חמצן, היכולת לייצר עד 18 ביופילמים זהים. השימוש בכור הדיסק המסתובב הופך טכניקה זו לאידיאלית לבדיקת תרכובות אנטי-מיקרוביאליות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפעיל ביופילמים של כור דיסק מסתובב וזרימת טפטוף. כורי ביופילם אלה מציעים חלופות לביופילם של תאי זרימה וצלחות מיקרוטיטר, והם אידיאליים כאשר יש צורך בכמות גבוהה של ביומסה של ביופילם או רצוי בדיקה אנטי-מיקרוביאלית על ביופילמים מבוססים.