Name: השימוש זרימה טפטוף ו כורים דיסק סיבוב עבור Staphylococcus aureus Biofilm ניתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: למד לגדל ביופילמים חיידקיים של Staphylococcus aureus באמצעות כורי זרימת טפטוף ודיסק סיבוב. השיטה מאפשרת ייצור ביומסה גבוהה וניתוח מבנה הביופילם במיקרוסקופ אלקטרונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIAID מענק K22AI081748.

1. תזרים בטפטוף biofilm Reactor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרם טפטוף biofilm הכור (זמין טכנולוגיות Biosurface או גרסאות מותאמות אישית נועד בדרך כלל ניתן על ידי החנויות אוניברסיטה מכונה, ראה תרשים 1) היא התאספו autoclaved. העצרת כוללת קופונים הדבקת בתאי ומכסים קאמרית האבטחה. החדר, יחד עם biofilm בינוני (מרק סויה tryptic 2 גרם / ליטר ו - 2 גרם גלוקוז / L), ואת צינורות ההזנה influent הם מעוקרים ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה של הכור זרם טפטוף הוא preformed ידי הצבת את הכור על משטח שטוח, מהדק את קווי צינורות שפכים, מילוי כל תא עם מרק סויה 10 מ"ל tryptic והוספת 10 μL של ס תרבות aureus גדל בן לילה במרק סויה tryptic. הכור הוא מחוסן אז מקום 37 ° C בחממה במשך 18 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 18 שעות של דגירה, צינורות השפכים הוא unclamped ואת הכור ממוקם על בלוק עץ לחתוך בזווית של ° 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, לחבר את צינורות ההזנה influent לבקבוק המכיל את מרק מזין זרימה רציפה. להאכיל את קו צינורות דרך המשאבה לבין הממשלה את הצינורות על ידי הפעלת המשאבה במהירות המקסימלית (משתנה בהתאם לדגם משאבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בצינור influent ערוכה לעצור את המשאבה ואת לצרף מחטים להתחבר (22 מד, 1 אינץ') לסוף כל צינור. נגבו את פקק היניקה קאמרית עם אתנול לנגב בסביבה נקייה מחיידקים, להכניס את המחטים באמצעות פקק היניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה ולאפשר התקשורת כדי לטפטף לאט (קצב זרימה ~ 125 μL / דקה) על קופונים. התקשורת צריכה לזרום כלפי מטה לאורך הקופון מנמל פקק כניסת ליציאת השפכים. הפעילו את הכור זרימה רציפה של 2-5 ימים (בהתאם ליישום), מדי פעם לבדוק את הכור לניקוז תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקצור את זרם טפטוף biofilms הכור, להפסיק את המשאבה בזהירות להסיר את המחטים מהכור. הכור אז יכול להיות מונח על משטח שטוח את הקופונים ניתן להסיר בסביבה נקייה מחיידקים באמצעות מלקחיים סטרילית. אם במיקרוסקופ הוא הרצוי, את הקופונים יכולים כעת להיות מעובד בהתאם (תרשים 2B הוא מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של biofilm S. aureus גדל כור biofilm טפטוף). אם כימות של ביומסה biofilm או לימודי הפיזיולוגיה הם מטרת המחקר, biofilm ניתן להסיר את הקופון באמצעות מגרד התא. בעוד מחזיק את הקופונים עם מלקחיים, בעדינות לגרד את biofilm את הקופון לתוך צינור חרוטי המכיל פוספט שנאגרו מלוחים באמצעות מגרד התא. הערה: לכמת את המושבה להרכיב יחידות biofilms, יש צורך homogenize biofilms שנקטפו עם רקמות homogenizer כדי disaggregate גושים ויוצרים ההשעיה הומוגנית. מודלים שונים של רקמות homogenizers מתאימים עבור יישום זה. אנו מנצלים מדעי פישר Tissuemiser Homogenizer (מוצר # 15-338-420) במלוא המהירות לרגע 1 עד homogenize דגימות biofilm. אי homogenize biofilm תגרום הערכה נמוכה מדי של המושבה הקמת יחידות להציג במדגם. </li></ol> 2. Biofilm סיבוב הדיסק Reactor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biofilm מסתובב הדיסק הכור (זמין זמין טכנולוגיות Biosurface או יכול להיות מותאם אישית עשה, ראה איור 3) היא התאספו autoclaved. להרכיב את הכור על ידי המקום הראשון ספינינג קופונים דיסק לתוך החריצים של הדיסק ספינינג הצבת אותו לתוך כוס 1 ליטר זכוכית עם יציאת בגלישה. מספר 15-פקק גומי עם חורים שנקדחו בו כדי לאפשר זרימת מדיה אוורור משמש מכסה את הכור. הכור, biofilm מדיה (מרק סויה tryptic 2 g / L של הגלוקוז 2 g / L), צינורות היניקה הם מעוקרים לאחר מכן על ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biofilm מסתובב הכור הדיסק הוא מחוסן ידי הצבת 250 MLS של המדיום סטרילי לתוך הכור, ומוסיף 0.5 מ"ל של ס 'לילה תרבות aureus גדל מרק סויה tryptic. הכור ממוקם אז בצלחת ומערבבים מוגדר 250 סל"ד ו מודגרות לילה בטמפרטורה הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 16 שעות של דגירה לחבר את צינור היניקה לנמל על מאגר בינוני ולחבר אותו המשאבה peristaltic. המשאבה ואז להפעיל זרם מוגדר ~ 0.25 mL / min (תזרים ניתן לשנות בהתאם לקצב הצמיחה הרצוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות לעצור את הכור בסביבה נקייה מחיידקים, להסיר את הדיסק בלי לגעת קופונים biofilm. הסר את הקופונים באמצעות מלקחיים סטרילית לטבול כל אחד לתוך פוספט שנאגרו מלוחים כדי להסיר כל חיידקים המצורפת רופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בדיקות מתחם מיקרוביאלית, שבבי ניתן להציב לתוך בארות בודדים של צלחת 96 באר המכילים תרכובות של עניין. לאחר דגירה, שבבי מועברים לתוך 1.5 microcentrifuge צינורות מ"ל המכילה 1 מ"ל תמיסת מלח פוספט חיץ הומוגני עם רקמות homogenizer לפזר את biofilm ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם מדולל אז סדרתי מצופה על מדיום אגר מזין לקבוע המושבה formi קיימאng יחידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: וריאציות רבות יכול להתבצע על פרוטוקול לעיל. לדוגמה, קופונים דיסק מסתובב יכולים להיות מצופים או עשויים אנטי biofilm תרכובות פוטנציאל מבחן היעילות. Dispersants biofilm ניתן גם להעריך להיות דוגרים קופונים תרכובות dispersant וחיידקים לכימות מצורף לעומת מנותקת. </li></ol> 3. נציג תוצאות דוגמה להגדיר את הכור זרם טפטוף תוצג אם באיור 1. אחרי שלושה ימים של זרימת כמויות עצומות של biofilm יצטברו על פני השטח קופון, איור 2A. ביומסה סה"כ ישתנו בהתאם זני חיידקים ותנאי צמיחה מדויקת. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של ס biofilm aureus גדל הכור זרם טפטוף מוצג תרשים 2B. הכור דיסק מסתובב מוצגת דמות 3A. הפרוטוקול המתואר ניתן להתאים את הדרישות הספציפיות של כל מיקרואורגניזם בדרך כלל מסוגל להרכיב biofilm. איור 3 ב מציג את הדיסק מסתובב עם 18 דיסקיות פלסטיק מודבקת. דיסק גדל biofilms אלה הם במיוחד גם מתאים בדיקות מיקרוביאלית ו להניב תוצאות לשעתקו מאוד 11. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הזרימה לטפטף ההתקנה הכור. מרכיבים חשובים מסומנים. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. דוגמה זרימה טפטוף ס aureus biofilm. א) biofilm זה היה גדל במשך שלושה ימים בעקבות פרוטוקול המתואר. מכסים משני החדרים הראשונים של הכור יוסרו להראות ש צהוב biofilm aureus ביומסה. ב) Sacnning מיקרוסקופ אלקטרונים של ס biofilm aureus גדל הכור זרם טפטוף. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. הכור דיסק מסתובב. א) דוגמה של הכור מפעיל דיסק מסתובב. מרכיב מפתח מסומנים. ב) תקריב לאור דיסק מסתובב.

<ol><li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial Biofilms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li>
<li>Costerton, J. W., Cheng, K. J., Gessey, G. G., Ladd, T. I., Nickel, J. C., Dasgupta, M., Marrie, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms+in+nature+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms in nature and disease.</a> Ann. Rev. Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li>
<li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+biofilm+formation+in+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+proceeds+via+multiple%2C+convergent+signaling+pathways%3A+a+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Micro%22%5BJournal%5D)">Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis.</a> Mol. Micro. 28, 449-461 (2002).</li>
<li>Boles, B. R., Horswill, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agr-mediated+dispersal+of+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms.</a> PLoS Pathog. 4, e1000052-e1000052 (2008).</li>
<li>Goeres, D. M., Haamilton, M. A., Beck, N. A., Buckingham-Meyer, K., Hilyard, J., Loetterle, L. A., Walker, D. K., Stewart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4, 783-788 (2009).</li>
<li>Fu, W., Forster, T., Mayer, O., Curtin, J. J., Lehman, S. M., Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+cocktail+for+the+prevention+of+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+on+catheters+in+an+in+vitro+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 397-404 (2010).</li>
<li>Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Microbiology. 146, 547-549 (2000).</li>
<li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 4035-4039 (1998).</li>
<li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-generated+diversity+produces+%22insurance+effects%22+in+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 16630-16635 (2004).</li>
<li>Pitts, B., Willse, A., McFeters, G. A., Hamilton, M. A., Zelver, N., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+repeatable+laboratory+method+for+testing+the+efficacy+of+biocides+against+toilet+bowl+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A repeatable laboratory method for testing the efficacy of biocides against toilet bowl biofilms.</a> J. Appl. Microbiol. 91, 117-11 (2001).</li>
<li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhamnolipids+mediate+detachment+of+Pseudomonas+aeruginosa+from+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rhamnolipids mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms.</a> Mol. Microbiol. 57, 1210-1223 (2005).</li>
<li>Hentzer, M., Teitzel, G. M., Balzer, G. J., Heydorn, A., Molin, S., Givskov, M., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+overproduction+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function.</a> J. Bacteriol. 183, 5395-5401 (2001).</li>
<li>Lin, H. Y., Chen, C. T., Huang, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+merocyanine+540+for+photodynamic+inactivation+of+Staphylococcus+aureus+planktonic+and+biofilm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of merocyanine 540 for photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6453-6458 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Biofilms גדל כורים שונה לעיתים קרובות יש מאפיינים שונים הכור לכל יישומים שונים. בעבודה זו אנו מתארים את השימוש של שני כורים biofilm: זרימה טפטוף biofilm הכור כור דיסק מסתובב. בטפטוף כורים תזרים שימושיים גדל biofilms גזירה נמוך בממשק אוויר נוזלי והם להתאמה למגוון רחב של מצבים. אנחנו מוצאים אותם מאוד נוח ללימודי שבו כמות גדולה של ביומסה biofilm רצוי. התקנה זו יכול בקלות להיות מותאמים עבור מחקרים שכללו מעקב microsensor ואת בדיקות משטחי antibiofilm פוטנציאליים. <p class="jove_cont...

Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

<table><tbody><tr><td>כורי זרימה בטפטוף</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td>DFR 110</td><td></td></tr><tr><td>כורי דיסק מסתובב</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

השימוש זרימה טפטוף ו כורים דיסק סיבוב עבור staphylococcus aureus biofilm ניתוח

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

רוב החיידקים בטבע נחשבים להתקיים משטח הקשורים הקהילות biofilms. Biofilms 1 חיידקית נארזים בתוך מטריצה ​​ומצורפת היווצרות של 2 פני. Biofilm ופיתוח נלמדים בדרך כלל במעבדה באמצעות מערכות אצווה כגון צלחות microtiter או זרימה מערכות, כגון תאים הזרימה. מתודולוגיות אלה שימושיים להקרנה ספריות מוטציה כימיים (צלחות microtiter) 3 או גדל biofilms להדמיה (תאים זרימה) 4. כאן אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים סטפילוקוקוס גדל בשני סוגים נוספים של biofilms מערכת זרימה: זרימת לטפטף הכור biofilm ו biofilm המסתובב הכור דיסק. תזרים בטפטוף כורים biofilm מיועדים ללימוד biofilms גדל בתנאים גזירה נמוך. 5 הכור זרם טפטוף מורכבת מארבעה ערוצי בדיקה במקביל, כל אחד מסוגל להחזיק כוס אחת רגילה מיקרוסקופ שקופיות בגודל קופון, או אורך של קטטר או תפקיד. הכור זרם טפטוף אידיאלית עבור ניטור microsensor, כללי מחקרים biofilm, דגימות biofilm cryosectioning, ייצור ביומסה גבוהה, הערכות חומר רפואי, בדיקות שכינת המכשור הרפואי. 6,7,8,9 הכור דיסק מסתובב כולל דיסק המכיל טפלון נבכי קופונים נשלף. 10 קופונים נשלף ניתן על ידי מכל חומר machinable. התחתון של הדיסק מסתובב מכיל מגנט לבר כדי לאפשר סיבוב הדיסק כדי ליצור גזירה פני הנוזל על פני השטח, סומק קופונים. דיסק שלם המכיל 18 קופונים ממוקם ספינת 1000 מ&quot;ל בצד זרוע זכוכית הכור. התקשורת גידול נוזלי מופץ באמצעות כלי ואילו הדיסק הוא הסתובב על ידי stirrer מגנטי. קופונים מוסרים כלי הכור ואז מגורד לאסוף את דגימת biofilm למחקר נוסף או הדמיה במיקרוסקופ. כורים דיסק סיבוב מיועדים הערכות מעבדה יעילות biocide, הסרת biofilm, ואת הביצועים של חומרים אנטי עכירות. 9,11,12,13

הפרוטוקולים של ניצול לפתוח זרימת biofilms מערכת עם כורים זרימה טפטוף וסיבוב כורים דיסק מוצגים בפירוט.

השימוש זרימה טפטוף ו כורים דיסק סיבוב עבור Staphylococcus aureus Biofilm ניתוח

סברה היא שמרבית המיקרובים בטבע קיימים כקהילות הקשורות למשטחים בתוך ביופילמים.1 ביופילמים בקטריאליים עטופים בתוך מטריקס ומוצמדים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לגדל ביופילמים חיידקיים תחת כוח גזירה נמוך או בינוני, באמצעות ריאקטור ביופילם בעל זרימת טפטוף או ריאקטור בעל דיסק מסתובב. קופונים בריאקטור הביופילם מוחדרים תחילה בחיידקים ומודגמים בטמפרטורה של 37 °C כדי לאפשר לתאי החיידקים להיצמד למשטחי הגדילה. לאחר שהתאים נצמדו לקופונים, מופעלת זרימה של מצע גידול היוצרת כוח גזירה הפועל במהלך התפתחות הביופילם.ניתן לקצור ביופילמים בוגרים לצורך ניתוח ותצפית על הביופילמים. ניתן לבצע מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת כדי לקבוע את המבנה העל (ultra structure) של הביופילמים שנוצרו. אני בלייז בולס.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תאי זרימה, הוא שניתן להשיג בקלות ייצור ביומסה גבוה ובנייה של מספר ביופילמים זהים. את ההליך זה ידגימו רייצ'ל סטיבנסון וקלי שוורץ, טכנאית ותלמידה לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. כור ביופילם עם זרימה בטפטוף מורכב מארבעה תאים עם פתחי כניסה למדיום ופתחי יציאה לפסולת.בתוך כל תא נמצא קופון נשלף שעליו גדל הביופילם. כדי להרכיב את כור הביופילם בזרימה בטפטוף, מקמו את הקופונים בכל תא מקבילי והדקו את מכסי התאים. עקרו באוטוקלאב את הכור המורכב וכן את צינורות הזנת חומרי התזונה כדי לעקר את המערכת לפני השימוש.בצעו גם עיקור באוטוקלאב של מצע גידול הביופילם כדי להחדיר אותו למגיב הזרימה בטפטוף המעוקר. הניחו את המכשיר על משטח ישר והדקו את קווי השפכים. לאחר מכן, מלאו כל תא ב-10 milliliters של מצע גידול סטרילי המבוסס על triptych soy broth, והוסיפו 100 microliters של staphylococcus aureus.תרבית לילה שגודלה באותו מצע עבור כל תא בנפרד. יש להניח את הכור המוחדר באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 18 שעות כדי לאפשר לתאים להיצמד לפני השטח של הקופון. לאחר האינקובציה, יש לשחרר את התפסן של צינור השפכים ולהניח את הכור על גבי בלוק עץ נטוי בזווית של 10 degree באופן אספטי.חברו את צינורות ההזנה הזורמים לבקבוק המכיל ציר הזנה בזרימה רציפה. העבירו את קו הצינורות דרך המשאבה ובצעו הטרייה (priming) לצינורות על ידי הפעלת המשאבה במהירות מלאה. לאחר שהצינורות הזורמים הוטריו, עצרו את המשאבה וחברו מחטים במידה 22 gauge ובאורך שפה אחת לקצה של כל צינור.נגב את פקק כניסת התא באמצעות מטלית עם אתנול ובאופן אספטי. החדר את המחטים דרך פקק הכניסה. הפעל את המשאבה ואפשר למדיום לטפטף על הקופונים.בספיקה של כ-125 microliters per minute, המדיום צריך לזרום כלפי מטה מפתח פקק הכניסה אל פתח השפכים. הפעילו את הכור בזרימה רציפה למשך שלושה ימים, ובדקו מדי פעם שהניקוז מהכור תקין.יש לבדוק את הניקוז באמצעות בדיקה ויזואלית של התאים כדי לוודא שהמדיה אינה מצטברת בהם. אם המדיה מצטברת, לחיצה על צינור היציאה תסייע בדרך כלל לניקוז תקין לצורך קציר של הביופילמים; במקרה זה, יש לעצור את המשאבה ולהוציא את המחטים מהריאקטור. לאחר מכן, יש להניח את הריאקטור על משטח שטוח.לאחר שלושה ימים של זרימה רציפה, ביופילמים של staphylococcus aureus מופיעים כביומסה צהובה המפוזרת לאורך הקופונים שהוחדרו. מיקרוגרף של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של הביופילם חושף את staphylococcus aureus מכסה את הקופון בקהילת ביופילם הקשורה לפני השטח. כדי לכמת את הביומסה שהתקבלה, השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להוציא את הקופונים באופן אספטי, אספו את החיידקים באמצעות גורד תאים (cell scraper), ולאחר מכן העבירו אותם לשפופרת קונית המכילה חמישה מיליליטר של PBS סטרילי.באמצעות הומוגנייזר רקמות, פצלו את הגושים הבקטריאליים עד לקבלת סספנסיה אחידה. יחידות יוצרות מושבות (CFU) נמדדות על ידי זריעה של דילולים סדרתיים על צלחות triptych agar, דגירה למשך 24 שעות ב-37 degrees Celsius וספירת המושבות. ריאקטור הביופילם בעל הדיסק המסתובב מורכב מ-chemostat שדרכו מנוסב מצע גידול.דיסק מסתובב עם מוט כוכב ו-18 קופונים שתוכננו להתאים לדיסק המסתובב. כדי להרכיב את הכור, תחילה טענו את קופוני הדיסק המסתובב לתוך החריצים של הדיסק המסתובב. לאחר מכן, הניחו את הדיסק הטעון בתוך כלי ביקר זכוכית של ליטר אחד עם פתח גלישה, ואטמו את הכור בעזרת פקק גומי מספר 15 בעל חור אחד לזרימת המצע וחור אחד לאוורור.עקרו באוטוקלאב את הכור המורכב ואת צינור הכניסה כדי לעקר את המערכת. כדי להחדיר את התרבית לכור, מלאו את הכוס ב-250 milliliters של מצע גידול סטרילי והוסיפו 500 microliters של תרבית לילה של staphylococcus aureus שגודלה ב-triptych soy broth. הניחו את הכור על פלטת ערבוב המכוונת ל-250 rotations per minute והדגירו אותו למשך לילה ב-37 degrees Celsius כדי לאפשר לתאים להיצמד לקופונים.לאחר דגירה לילה, חברו את צינור הכניסה לפתח במאגר המצע ואל משאבה פריסטלטית. הפעילו את המשאבה וקבעו את קצב הזרימה ל-0.25 milliliters per minute. הניחו לריאקטור לפעול במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius כדי לאסוף את הביופילמים שהתקבלו.עצרו את הריאקטור ובאופן אספטי, הסירו את הדיסקה מבלי לגעת בקופונים. באמצעות פינצטה סטרילית, הוציאו את הקופונים וטבלו כל אחד מהם בזהירות ב-PBS סטרילי כדי להסיר חיידקים שאינם קשורים היטב, לצורך בדיקת תרכובות אנטימיקרוביאליות.באופן אספטי, מקם את הקופונים לבארות בודדות של פלטת 96 בארות המכילה את התרכובות הרלוונטיות. דגור את הפלטה למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, העבר את הקופונים לשפופרות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter המכילות 1× PBS ופזר את הביופילמים באמצעות הומוגנייזר.לבסוף, פזרו דילולים סדרתיים של התאים על מצע אגר עם חומרי הזנה כדי לקבוע את מספר יחידות יוצרות המושבות (CFU) החיות לדגימה, כפי שתואר קודם לכן. גרף זה מראה את מספר יחידות יוצרות המושבות בביופילמים שהוכנו באמצעות כור הדיסקים המסתובב ונחשפו למימן פחמוננית, עם יכולת להפיק עד 18 ביופילמים זהים. השימוש בכור הדיסקים המסתובב הופך טכניקה זו לאידיאלית לבדיקת תרכובות אנטימיקרוביאליות.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן ההפעלה של ביופילמים בכור תגובה בעל זרימה בטפטוף ובכור תגובה בעל דיסק מסתובב. כורי תגובה אלו לביופילמים מציעים חלופות לביופילמים בתאי זרימה ובפלטות מיקרוטיטר, והם אידיאליים כאשר נדרשת כמות גבוהה של ביומסה של ביופילם או כאשר מעוניינים בביצוע בדיקות אנטימיקרוביאליות על ביופילמים מבוססים.

the-use-drip-flow-rotating-disk-reactors-for-staphylococcus-aureus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הפרוטוקול מתאר את היישום של מערכת התא זרימה לגידול וניתוח biofilms חיידקים מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

בסרטון זה, אנו מדגימים את הכנת ביופילם במבחנה על ידי S. aureus בצלחת מרובת בארות מצופה פולי-L-ליזין. הצלחת בצורת ביופילם יכולה לשמש לניסויים במורד הזרם.

סינתזת ביופילם חוץ גופית מאת Staphylococcus aureus

לביופילמים יש אינטראקציות מורכבות עם הסביבה הסובבת אותם. כדי לחקור באופן מקיף אינטראקציות בין ביופילם לסביבה, אנו מציגים כאן סדרה של שיטות ליצירת סביבה כימית הטרוגנית להתפתחות ביופילם, לכימות מהירות זרימה מקומית ולניתוח הובלת מסה בתוך מושבות ביופילם ובסביבתן.

שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

רוב הזיהומים החיידקיים מייצרים ביופילם. מתוקף הסביבה שלהם, חיידקים הקשורים לביופילם הם לעתים קרובות עמידים לתרופות פנוטיפיות. מולקולות אנטיבקטריאליות חדשות שהורגות חיידקים בביופילמים נמצאות אפוא בעדיפות גבוהה. אנו מקימים בדיקה לסינון מהיר של תרכובות אנטי-מיקרוביאליות היעילות בהדברת ביופילמים.

מיקוד Associated Biofilm<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Assay רגישות בסמים בהתבסס Resazurin שימוש

אנו מתארים את מכלול, המבצע, ועוצב ניקוי של מנגנון זרימה כדי התמונה פטרייתי ביופילמים בזמן אמת בזמן תחת זרימה. אנחנו גם מספקים ולדון אלגוריתמים כמותיים כדי לשמש על תמונות נרכשות.

הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית

כאן, אנו מתארים את השימוש תפוקה גבוהה יותר microfluidic מגיב ביולוגי בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי לניתוח של גזירה השפעות על biofilms Pseudomonas aeruginosa המבטאים חלבונים ניאון ירוק, כולל כלי להגדיר, הקביעה של כיסוי biofilm, שיעור הצמיחה ומאפיינים מורפולוגי.

חיים תא ניתוח של גזירה על Pseudomonas aeruginosa באמצעות מערכת אוטומטית Microfluidic תפוקה גבוהה

מאמר זה מפרט שיטות הממחישות שלוש טכניקות נפוצות של קצירת ביופילם ופירוק חומרים על שני סוגי משטחים, בדיקות מחוספסות של שיטת קציר ומידע מינימלי שיש לקחת בחשבון בעת בחירה ואופטימיזציה של טכניקות קצירה ופירוק כדי להגביר את הרבייה.

קציר ופיזור: צעד מתעלם במחקר שיטות ביופילם

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה לביצוע צמיחת ביופילם ומדידות ביומסה באמצעות התקני לוח PCR עמוקים בהרכבה עצמית עבור הקרנת ביופילם סטטית של מכסה 96-היטב.

ייצור ביופילם ביומסה חיידקית גדולה יותר באמצעות מכשירי מיקרופלאט עמוק באר עמוקה צלחת PCR

פרוטוקול זה מתאר גישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות להערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים בתעשיית החלב. גישה זו עשויה לשמש גם לבדיקת יעילותן של פורמולציות ביולוגיות או כימיות חדשות לשליטה בביופילמים.

הערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים חלביים בגישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות

העור Murine מודל זיהום ברקמות רכות מנוצל להערכת תפקוד ארסיות של Staphylococcus aureus עמידים methicillin (MRSA) לבין התגובות החיסוניות המארח. כאן, הצגנו מודל זיהום תת עורי לעור זיהום ברקמות רכות.

זיהום תת עורי של סטפילוקוקוס אוראוס עמיד Methicillin (MRSA)

למד לגדל ביופילמים חיידקיים של Staphylococcus aureus באמצעות כורי זרימת טפטוף ודיסק סיבוב. השיטה מאפשרת ייצור ביומסה גבוהה וניתוח מבנה הביופילם במיקרוסקופ אלקטרונים.

השימוש זרימה טפטוף ו כורים דיסק סיבוב עבור Staphylococcus aureus Biofilm ניתוח

גלה סרטונים נוספים