במושבה שמרים והטבעה שיטה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להטמיע מושבות שמרים. זה מושג על ידי הסרת מושבה ואת האגר שמתחתיה מצלחת אגר, הנחתו על כמה טיפות של אגר מותך וכיסוי מהיר שלו בעוד אגר מותך. לאחר מכן, עודפי AER נחתכים מהמושבה כדי להפוך אותה לקטנה מספיק כדי להתאים לתבנית.

לאחר מכן המושבה המוטמעת ב-AER מתקבעת, מוכתמת, מיובשת ולבסוף חודרת עם שרף דורבנים. לאחר מכן מניחים את הבלוק בתבנית עם שרף דורבן נוסף, מודגר עד להתקשות ולאחר מכן נחתך. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את התפלגות סוגי התאים בתוך מושבת שמרים באמצעות מיקרוסקופ אור או אלקטרונים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, הוא שהיא מאפשרת לקבוע את המבנה הפנימי של המושבה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתפתחות המיקרוביאלית, כגון התפלגות סוגי התאים בתוך מושבות. שיטה זו סיפקה תובנה לגבי המבנה של מושבות CAC קרוצ'ה, אך סביר להניח שניתן ליישם אותה גם על מיקרואורגניזמים אחרים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שטיפול והטמעה של מושבות עשויים להיות קשים ללמוד מפרוטוקול כתוב. הרעיון לשיטה זו קיבל השראה מכמה נתונים גנטיים שפרסמנו ב-2002 שהצביעו על כך שהנבגים אינם מפוזרים באופן שווה במושבות. התאמנו שיטה לחיתוך מושבות שפותחה על ידי אנגלברג במעבדת הסנפיר.

אז בואו נתחיל. התחל בדגירת שמרי Wild S visi על צלחות מקדחה ב-30 מעלות עד לנוכחות של כ-300 מושבות. בעזרת מרית צרה, הסר מושבות בקוטר של מילימטר עד שניים, אחת בכל פעם מהצלחת.

לאחר מכן, בעזרת קצה פיפטה של מיליליטר אחד, הניחו כמה טיפות של 2% אגר ב-42 מעלות צלזיוס על שקופית מיקרוסקופ, והניחו מיד את המושבה על אגר עם הפנים כלפי מעלה לפני שה-AER מתמצק. הניחו עוד כמה טיפות אגר על המושבה ואפשרו לאגר להתמצק וודא שכל המושבה, כולל החלק העליון של המושבה, עטוף באגר. בכל שלבי הפרוטוקול הבאים עם סכין גילוח.

חתוך את ה-AER סביב המושבה ומקם את גוש ה-AER המכיל את המושבה. בבקבוקון בורג של 3.5 מיליליטר בו סיליקט המכיל 2% אלדהיד פרפורם, ו-2% גלוטראלדהיד יש לעבד מושבות קיבוע, אחת בכל פעם כדי למנוע התייבשות, אך ניתן להניח עד 10 מושבות באותו בקבוקון. השאירו את המושבות למשך שבעה ימים בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר שבוע יש להסיר את הקיבוע ולשטוף את מושבות החקלאות פעמיים, תוך שימוש בכ-1.5 מיליליטר של 0.15 נתרן מולארי. יש לדגור על קרח ב-pH 7.2 ולדגור על קרח לאחר כל שטיפה למשך 15 דקות ללא תסיסה. לאחר שטיפה זו פעמיים נוספות.

שימוש ב-1.5 מיליליטר של מאגר X OS אחד, המורכב מ-100 מילי-מולרי מונו-אשלגן פוספט, 10 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד ב-pH 6.0, דגירה על קרח במשך חמש דקות לאחר כל שטיפה. לאחר מכן, באמצעות אותו בקבוקון, בצע את הטיפול באוסמיום והשטיפות המפורטות כאן ובחלק הכתוב של פרוטוקול זה. לאחר מכן, באמצעות אותו בקבוקון, בצעו את ההתייבשות ההדרגתית המפורטת כאן ובפרוטוקול הכתוב הנלווה מוקדם בבוקר למחרת.

הכן מגיב דורבנים כפי שמוצג כאן ובפרוטוקול הכתוב הנלווה. שטפו מיד את הבלוקים החקלאיים חמש פעמים למשך 10 דקות כל אחד עם 1.5 מיליליטר של 100% אתנול בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת האתנול האחרונה, הסר רק מספיק אתנול כך שהבלוק החקלאי יישאר מכוסה.

בעזרת פיפטת מרעה, הכניסו לבקבוקון כ-0.5 מיליליטר מגיב דורבנים וסובבו על גלגל במהירות נמוכה למשך 15 דקות. בטמפרטורת החדר לאחר הסיבוב, הניחו לבקבוקון לעמוד למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסר את הפתרון לחלוטין.

לאחר מכן הוסף 1.5 מיליליטר של מגיב דורבן כדי לכסות את גוש החקלאות. שוב, סובב את הבקבוקון על גלגל למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר והניח לעמוד למשך 30 דקות. חזור על שטיפה זו.

צעד שלוש פעמים נוספות. לאחר 30 הדקות האחרונות, הסר את מגיב הדורבנים והוסף מגיב דורבן טרי כדי לכסות את הבלוקים. אפשר לבלוקים החקלאיים לעמוד בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות.

החלף את מגיב הדורבנים וסובב למשך הלילה. למחרת בבוקר, החלף את מגיב הדורבנים והשאיר את הבקבוקונים מסתובבים עד למחרת. למחרת בבוקר, הניחו מגיב דורבן בתבניות סיליקון ממוספרות כדי לכסות רק את תחתית התבניות.

לאחר מכן, הכניסו את גושי החקלאות לתבניות ודגרו בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר ארבע שעות, מלאו את התבניות בעוד דורבנים, ריאגנטים ודגרו בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הסר את הבלוקים מהתבנית לצורך חתך.

דוגמה למיקרוגרפיה קלה של קטע דרך מרכז מושבה של מושבת שמרי Wild S Visia מוצגת כאן. שמרים אלה הם זן בר המבודד מהפרשות עצים. המושבה הודגרה במשך שישה ימים על מדיום YNA לפני החיתוך.

בתמונה זו, ניתן להבחין בקלות באסאי, פסאודו היפי ושמרים ביציים ונראה גם אזור המושבה הפולש לאגר הבסיסי. חצים פתוחים מצביעים על חצים מלאים באסאי מייצגים מצביעים על תאים צמחיים ביציים מייצגים, ראש חץ מלא מצביעים על שרשראות של תאים מוארכים ו-si. תמונה זו היא דוגמה למיקרוגרף אלקטרונים מקטע דק של זן מעבדה של שמרים SH 1 0 2 0, ו- W 3 0 3.

המושבה הודגרה במשך שישה ימים על מדיום YNA לפני החיתוך. התמונה מציגה אזור במושבה המכיל תדירות גבוהה של תאים נבגים. חץ מציין את המבנה הדו-שכבתי של דופן הנבגים.

בחלק א', אנו מראים קטע של מושבה בת ארבעה ימים עם רשת המורכבת מ-15 מלבנים המונחים על התמונה בחלק ב'.תדירות התאים הקשורים לנבגים בכל מלבן היא השתלה עם 15 הפסים המתאימים ל-15 המלבנים המוצגים בחלק א'.הנתונים הם הממוצע ושגיאת התקן של ארבע מושבות עצמאיות של ארבעה ימים בחלק ג', מוצגים האמצעים ושגיאות התקן עבור ארבע מושבות עצמאיות של שמונה ימים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבועיים עם יום שלם אחד וכמה ימים של שעה עד שלוש שעות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להוסיף את הפתרונות באופן מיידי כדי שהבלוקים לא יתייבשו בעקבות הליך זה.

שיטות אחרות, כמו מיקרוסקופ אלקטרונים חיסוני, יכולות לשמש לקביעת התפלגות התאים המבטאים חלבונים מסוימים לאחר התפתחותו. טכניקה זו אפשרה לנו להסתכל לא רק על הדפוס של תאים נבגים, אלא גם על הדפוס של תאים פסאודו-היפליים במושבות CCI. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להטמיע מושבות שמרים לחיתוך.

אל תשכח שרבים מהריאגנטים המיקרוסקופיים המשמשים בפרוטוקול זה יכולים להיות מסוכנים ביותר. אנא זכור להשתמש במכסה אדים, ללבוש ביגוד מגן ולהשליך את הריאגנטים כראוי. אוקיי, זהו זה.

תודה שצפית. בהצלחה בניסויים שלך.