Name: במושבה שמרים והטבעה שיטה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: למד שיטת הטבעה למושבות שמרים לצורך ניתוח מיקרוסקופי של תאים ספורולטיים ופסאודוהיפליים. פרוטוקול זה מאפשר חקר ארגון תאים בקהילות פטרייתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר מומן על ידי NIH 1R15GM094770.

1. במושבה בידוד קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 300 מושבות על אגר בינוני בפעם המצוין (מושבה מבודדת צריך להיות 1-2 מ"מ קוטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר המושבה (את הפנים) ובינוניים הבסיסית בעזרת מרית צרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מספר טיפות של אגר 2% 42 ° C בשקופית באמצעות מיקרוסקופ 1 מ"ל pipetman קצה ומיד המושבה מקום על פני אגר לפני שזה מתמצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מספר טיפות של אגר 2% 42 ° C על המושבה ולאפשר לגבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבשו כפפות על צעדים במשך כל שארית של פרוטוקול זה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום חתוך עם סכין גילוח ומכניסים אותם בקבוקון 3.5 מ"ל בורג מכסה בורוסיליקט paraformaldehyde המכיל 2% / מקבע glutaraldehyde 2% למשך 7 ימים בבית 4 ° C. </li></ol> 2. רוחצת וטיפול אוסמיום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שבוע בערך 1, לשטוף בלוקים אגר על הקרח מתחת למכסה המנוע כימי קטר ידי דוגרים פעמיים במשך 15 דקות עם cacodylate 0.15M מספיק נתרן (pH 7.2) כדי לכסות לחלוטין את המושבה (כ 1.5 מ"ל) ולאחר מכן עוד פעמיים במשך 5 דקות עם אותו נפח של 1X OS חיץ (100 מ"מ KH 2 PO 4 10 mM MgCl 2, pH 6.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את נפח זהה של OSO 1% 4 [2 מ"ל OSO 4 (2%) + 2 מ"ל 2x OS הצפת] כדי בקבוקונים (על הקרח) כדי לכסות את קוביות אגר מתחת למכסה המנוע כימי לרתוח במשך שעה 1 ואז לשטוף פעמיים עם אותו סכום של 1X OS חיץ במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר מבחנות לילה ב 4 ° C במאגר OS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקבע וכל שוטף בשלב זה הם נפטרים כמו פסולת מסוכנת. Pipettes כל המכיל OSO 4 היו שטופים 3X עם שמן צמחי. </li></ol> 3. לשטוף והתייבשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף למחרת בבוקר אגר חוסם פעמיים על קרח עם נפח זהה מעל מים קרים במשך 10 דקות כל אחד באמצעות פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ברצף עם נפח זהה של 25%, 50%, 75%, אתנול 95% במשך 10 דקות כל אחד ואחריו 2 שוטף עם אתנול 100% במשך 10 דקות. השאירו לילה בשעה 4 ° C באתנול 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף כל בשלב זה הם נפטרים כמו פסולת מסוכנת. </li></ol> 4. Spurr של הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר (מוקדם ככל האפשר) לשקול את הפתרונות הבאים (EM למדעים) לתוך כוס פלסטיק חד פעמיות מתחת למכסה המנוע קטר להכין ריאגנט של Spurr. במשך כל העבודה שלאחר מכן באמצעות מגיב, להמשיך להשתמש ברדס קטר. (ERL 4221 פתרון 5 גרם) (DER 736 פתרון 4 גרם) (פתרון NSA 13 גרם) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב פתרונות אלה (לאט) במשך 20 דקות במנדף באמצעות בר ומערבבים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון DMAE 0.15 גרם ומערבבים 20 דקות לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגה התערובת מעל ל 1-2 שעות במנדף. </li></ol> 5. Spurr של הסתננות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע של Spurr עשוי לשטוף את רחובות אגר 5 פעמים עם נפח זהה של מעל 100 אתנול חדר temp% במשך 10 דקות כל אחד. לאחר לשטוף את אתנול האחרון להסיר את אתנול באמצעות פיפטה פסטר כך אתנול שנותרו רק מכסה את אבני אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כ כמות זהה של מגיב של Spurr (כ 0.5 מ"ל) ולסובב צלוחיות על ההגה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לאפשר לעמוד במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות להסיר את הפתרון לחלוטין בעזרת פיפטה פסטר, להוסיף Spurr של לכסות לחסום אגר (כ 1.5 מ"ל), לסובב צלוחיות על ההגה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולאפשר לעמוד במשך 30 דקות. חזור על החלפה של Spurr, סיבוב הדגירה 3 פעמים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 הדקות האחרונות, להסיר מגיב של Spurr ולהוסיף טרי Spurr של לכסות את רחובות. אפשר בלוקים אגר לעמוד טמפ החדר למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את Spurr של ולסובב לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר להחליף Spurr של ולהשאיר מסתובב עד יום המחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spurr הבא במקום בבוקר של בתבניות סיליקון ממוספרים (פישר סיינטיפיק) רק כדי לכסות את החלק התחתון של תבניות ולאחר מכן להוסיף קוביות אגר עם תבניות. לדגור על 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות, מעל גבי תבניות, עם יותר Spurr ושל דגירה ב 60 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לאחר הסרת אבני מתבניות בלוקים עדיין גמיש מעט, לחזור אל תבניות דגירה נוסף 2 ימים </li></ol> 6. חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microtome Ultracut S לייקה שימש לקצץ בסעיפים 0.5 μ עבה של מיקרוסקופ אור 0.1 μ סעיפים דק עבור EM השידור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור במיקרוסקופ אור, כמו החלקים נחתכו, הם הונחו על ירידה של DH 2 O, מיובשים על בלוק 52 מעלות צלזיוס חום. קטעים יבשים היו מוכתמים אז עם ירידה של 1.0% toluidine כחול, borate סודיום 1% עבור 5-15 שניות. לאחר מכתים, הסעיפים נשטפו מיד תחת זרם של מים, יבשים, מכוסה התקשורת הרכבה (KPL), וכן תלוש cover חתום על המדגם. </li></ol>&gt; 7. נציג תוצאות: הרלוונטיות רחב למדידת היווצרות דפוס בשמרים ומיקרואורגניזמים אחרים נבדקו בעבר 1. שים לב במיוחד הוא פונקציונליות מוגברת של מושבות מיקרוביאלי מאורגן היחסית לקהילות מאורגן. השיטה המתוארת הוא שינוי של שיטה להטבעת מושבות התמחה גדול 2 ו תיאור קצר של שינויים שלנו פורסמה 3. דוגמה מיקרוסקופ אור קטע דרך מרכז במושבה של פרא S. שמרים המושבה cerevisiae מוצג באיור 1. Asci, pseudohyphae ושמרים אובאלית וניתן להבחין בקלות, והאזור המושבה פולשים agar שבבסיס ניכרת גם. דוגמה מיקרוסקופ אלקטרון של זן מעבדה של שמרים (W303 רקע) הוא שמוצג באיור 2. התמונה מאזור המושבה המכיל בתדירות גבוהה של תאים sporulated. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. מיקרוסקופיה Light של מושבה שמרים פרא. שמרים זו (YPS133) היה מבודד לאחרונה מן ולפליטות עץ 4. המושבה הודגר עבור 6 ימים על YNA בינוני 5 לפני חתך. חיצים פתח מצביעים נציג asci, חיצים מילאו מצביעים נציג תאים וגטטיבי אובאלית, ראשי חץ מילאו מצביעים שרשראות של תאים מאורכים (pseudohyphae) ו asci. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> באיור 2. אלקטרונים מיקרוסקופית של זן שמרים מעבדה. המושבה של SH1020 (W303 רקע) הודגר עבור 6 ימים על בינוני YNA לפני חתך 3. Image מראה האזור הסעיף עם תדירות גבוהה של asci. החץ מציין את מבנה דו שכבת הקיר נבג. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. כימות בחלוקת תאים sporulated במושבות: A) רשת המכיל 15 מלבנים הסמוך מוערמים לאורך הצד ארוך שלהם הוא גבי האזור מרכזי של דימוי סעיף קולוניה. רשת היא scaled, תוך שמירה הפרופורציות שלה מתמדת, פשוט מכסה את העליון והתחתון המושבה. (B &amp; C) שבריר תאים sporulated במלבן כל היחסית לתאי סך במלבן כי נקבעת לפי בדיקה חזותית הדימויים מן 4-יום הישן (B) 8-יום הישן (C) מושבות. לדוגמה, את המלבן בחלקו העליון של המושבה (שכותרתו "1") המתאים בצד שמאל של הגרף. Mean של 4 מושבות מוצג; הסורגים שגיאה התצוגה std. שגיאה.

<ol><li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+symmetries%3A+regulation+of+Dictyostelium+development+through+chemoattractant+and+morphogen+signal-response%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response.</a> Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).</li>
<li>Palkova, Z., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+within+a+community%3A+benefit+to+yeast+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Life within a community: benefit to yeast long-term survival.</a> FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significances+of+bacterial+colony+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The significances of bacterial colony patterns.</a> Bioessays. 17, 597-597 (1995).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).</li>
<li>Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+stalk-like+structures+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).</li>
<li>Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+analysis+of+Saccharomyces+cerevisiae+stalk-like+structures+reveals+spatial+organization+and+cell+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization.</a> J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).</li>
<li>Piccirillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+pathway+and+alkaline+pH+regulate+pattern+formation+in+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies.</a> Genetics. 184, 707-707 (2010).</li>
<li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).</li>
<li>Piccirillo, S., Honigberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+patterning+and+invasive+growth+in+wild+and+domesticated+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies.</a> Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).</li>
<li>Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environ Microbiol. , (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה הציג חושף את המבנים הפנימיים של המושבות. בגלל השיטה יעילה בקביעת הדפוסים של סוגי תאים בטווח של ס זנים cerevisiae עם מורפולוגיות מושבה שונה, גם מינים הקשורים ס paradoxus 5, השיטה היא גם נוטים לעבוד על מגוון רחב של פטריות ומיקרואורגניזמים אחרים. צעד קריטי להצלחה של השיטה היא להבטיח את המושבה כולה, כולל החלק העליון של המושבה, הוא עטוף בכל פרוטוקול אגר. אם המושבות נארזים לחלוטין אגר...

<table><tbody><tr><td>אוסמיום טטראוקסיד</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>RT 19152</td><td></td></tr><tr><td>תבניות הטבעה מסיליקון</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC 9975029</td><td></td></tr><tr><td>שרף אפוקסי ציקלו-אליפטי</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>RT 15004</td><td>ERL 4221</td></tr><tr><td>שרף אפוקסי</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>RT 13000</td><td>DER 736</td></tr><tr><td>נונילי סוציניק אנהידריד</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>RT 19050</td><td>NSA</td></tr><tr><td>2-דימתילאמין&amp;#8211;אתנול</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>RT 13300</td><td>DMAE</td></tr><tr><td>תוכני קיבוע</td><td>KPL Inc</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>גלגל מסתובב</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Pelco 1055</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום</td><td>Leica Microsystems</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr></tbody></table>

במושבה שמרים והטבעה שיטה

Yeast Colony Embedding Method

דפוסים של סוגי תאים שונים העוברים הוא מנגנון מרכזי בפיתוח מטזואניים. הקהילות של מיקרואורגניזמים, כגון מושבות biofilms גם להציג דפוסים של סוגי תאים. לדוגמה, שמרים ס cerevisiae, תאים sporulated ותאי pseudohyphal אינם מפוזרים באופן אחיד במושבות. החשיבות התפקודית של דפוסים המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הדפוסים הללו הם עדיין ממעטים להבין. אתגר אחד ביחס לחקור דפוסים של סוגי תאים במושבות פטרייתי היא שבניגוד מטזואניים רקמות, תאים במושבות יחסית מצורף חלושות אחד לשני. בפרט, מושבות פטריות אינם מכילים את רמת נרחב זהה של תאי מטריקס נמצא ברוב הרקמות. כאן אנו מדווחים על שיטה להטבעת ו חתך מושבות שמרים החושף את דפוסי הפנים של סוגי תאים במושבות אלה. השיטה יכולה לשמש כדי להכין חלקים עבים (0.5 μ) שימושי במיקרוסקופ אור וחתכים דקים (0.1 μ) מתאים במיקרוסקופ אלקטרונים השידור. תאים Asci ו pseudohyphal ניתן בקלות להבחין בין תאים שמרים דמוי ביצה על ידי מיקרוסקופ אור, ואילו המבנה הפנימי של תאים אלה ניתן דמיינו ידי EM. השיטה מבוססת על הסובבים מושבות עם אגר, שחדר אותם עם המדיום של Spurr ולאחר מכן חתך. מושבות בקוטר בטווח של 1-2 מ&quot;מ מתאימים פרוטוקול זה. בנוסף לדמיין את הפנים של מושבות, השיטה מאפשרת הדמיה של האזור של המושבה כי פולש אגר הבסיסית.

שיטה להטבעת מושבות שמרים המאפשר חתך של מיקרוסקופ אור אלקטרונים. פרוטוקול זה מאפשר קביעה של חלוקת תאים sporulated ותאי pseudohyphal בתוך מושבות מתן כלי חדש לקראת הבנת הארגון של סוגי תאים בתוך קהילה פטרייתי.

דפוס התבססותם של סוגי תאים שונים בעוברים הוא מנגנון מפתח בהתפתחותם של רב-תאיים (metazoans). קהילות של מיקרואורגניזמים, כגון מושבות וביופלמים...

המטרה הכללית של הליך זה היא להטמיע מושבות שמרים. הדבר נעשה תחילה על ידי הסרת מושבה והאגר שמתחתיה מלוח אגר, הנחתה על מספר טיפות של אגר מומס וכסייתה במהירות באגר מומס נוסף. לאחר מכן, עודפי אגר נגזזים מהמושבה כדי להקטין אותה מספיק כדי שתוכל להיכנס לתבנית.לאחר מכן מקבעים, צובעים, מייבשים ולבסוף מחדירים את המושבה המוטמעת ב-AER בשרף spurs. את הבלוק מניחים בתבנית עם שרף spurs נוסף, מדגריים עד להתקשחות ולאחר מכן מבצעים חיתוך. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את התפלגות סוגי התאים בתוך מושבת שמרים באמצעות מיקרוסקופיה של אור או אלקטרונים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת, הוא שהיא מאפשרת לקבוע את המבנה הפנימי של המושבה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההתפתחות המיקרוביאלית, כגון התפלגות סוגי התאים בתוך מושבות. שיטה זו סיפקה תובבנות לגבי המבנה של מושבות croce CAC, אך סביר להניח שניתן להחילה גם על מיקרואורגניזמים אחרים.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שהטיפול במושבות והטמעתן עשויים להיות קשים ללמידה מפרוטוקול כתוב. הרעיון לשיטה זו נבע מנתונים גנטיים שפרסמנו בשנת 2002, אשר הצביעו על כך שנבגים אינם מפוזרים באופן אחיד במושבות. התאמנו שיטה לחיתוך מושבות שפותחה על ידי engelberg במעבדה של fin.אם כן, נתחיל. התחילו בביקורי שמרים מסוג Wild S visi על מצעי אגר בטמפרטורה של 30 מעלות עד להופעתם של כ-300 מושבות. בעזרת מרחקה צרה, הסירו מהצלחת מושבות בעלות קוטר של מילימטר אחד עד שניים, אחת לאחר אחת.לאחר מכן, באמצעות טיפ של פיפטה של 1 מיליליטר, הניחו מספר טיפות של 2% agar בטמפרטורה של 42 °C על זכוכית מיקרוסקופ, והניחו מיד את המושבה על ה-agar כאשר הפנים הפונה כלפי מעלה, לפני שה-AER מתמצק. הניחו מספר טיפות נוספות של agar על המושבה והמתינו שה-agar יתמצק, תוך וידוא כי כל המושבה, כולל חלקה העליון, עטופה ב-agar. בכל שלבי הפרוטוקול הבאים השתמשו בלהב תער.גזמו את ה-AER מסביב למושבה והניחו את בלוק ה-AER המכיל את המושבה בתוך מבחנה עם פקק הברגה מborosilicate בנפח 3.5 milliliter המכילה מקבע של 2%paraform aldehyde ו-2%glutaraldehyde. יש לעבד את המושבות אחת אחת כדי למנוע התייבשות, אך ניתן להניח עד 10 מושבות באותה מבחנה. השאירו את המושבות למשך שבעה ימים בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius.לאחר שבוע, הסירו את חומר הקיבוע ושטפו את מושבות ה-agri פעמיים, תוך שימוש בכ-1.5 milliliters של sodium citrate 0.15 molar ב-pH 7.2, והדגירו על קרח לאחר כל שטיפה למשך 15 דקות ללא ערבוב. לאחר מכן, חזרו על השטיפה פעמיים נוספות.השתמשו ב-1.5 milliliters של OS buffer בריכוז one X, המורכב מ-100 millimolar mono potassium phosphate ו-10 millimolar magnesium chloride ב-pH 6.0, והדגירו על קרח למשך חמש דקות לאחר כל שטיפה. לאחר מכן, באותה מבחנה, בצעו את טיפול האוסמיום ואת השטיפות המפורטים כאן ובחלק הכתוב של פרוטוקול זה. לאחר מכן, שוב באותה מבחנה, בצעו את שלבי ההתייבשות המפורטים כאן ובפרוטוקול הכתוב המצורף, מוקדם למחרת בבוקר.הכינו את רכיב ה-spurs כפי שמוצג כאן ובפרוטוקול הכתוב המצורף. שטפו מיד את בלוקי ה-agri חמש פעמים למשך 10 דקות כל פעם עם 1.5 milliliters של ethanol 100% בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת ה-ethanol האחרונה, הסירו כמות ethanol מצומצמת בלבד, כך שבלוק ה-agri יישאר מכוסה.באמצעות פיפטת פסטור, העבירו כ-0.5 milliliters של spurs reagent אל תוך הבקבוק וסובבו אותו על גלגל במהירות נמוכה למשך 15 דקות. לאחר הסיבוב, הניחו לבקבוק לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסירו את התמיסה לחלוטין.לאחר מכן, הוסיפו 1.5 milliliters של spurs reagent כדי לכסות את ה-agri block. שוב, סובבו את המבחנה על גלגל למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר והניחו לה לעמוד למשך 30 דקות. חזרו על שטיפה זו.חזרו על השלב שלוש פעמים נוספות. לאחר 30 הדקות האחרונות, הסירו את ריאגנט ה-spurs והוסיפו ריאגנט spurs טרי כדי לכסות את הבלוקים. השאירו את בלוקי ה-agri בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות.החליפו את ריאגנט ה-spurs והסובבו למשך הלילה. למחרת בבוקר, החליפו שוב את ריאגנט ה-spurs והשאירו את המבחנות בסיבוב עד למחרת. בבוקר של היום הבא, העבירו את ריאגנט ה-spurs לתבניות סיליקון ממוספרות עד לכיסוי קל של תחתית התבניות.כעת הניחו את בלוקי ה-agri לתוך התבניות והדגרירו בטמפרטורה של 60 °C למשך ארבע שעות. לאחר ארבע שעות, מלאו את התבניות עד הסוף בעוד ספורס (spurs) ובריאגנט, והדגרירו בטמפרטורה של 60 °C למשך הלילה. הוציאו את הבלוקים מהתבנית לצורך חיתוך (sectioning).מוצגת כאן דוגמה למיקרוגרף של חיתוך דרך מרכזה של מושבה של שמרים מסוג Wild S Visia. שמרים אלה הם זן פרא שבודד מהפרשות של עצים. המושבה הודגרה במשך שישה ימים על מצע YNA לפני ביצוע החיתוך.בתמונה זו, ניתן להבחין בקלות בין asai, pseudo hyphy ושמרים בצורה סביבית (ovoid), וגם האזור של המושבה הפולשת לאגר שמתחתיה נראה בבירור. חצים פתוחים מצביעים על asai מייצגים, חצים מלאים מצביעים על תאי צמיחה (vegetative cells) סביביים מייצגים, וראשי חצים מלאים מצביעים על שרשראות של תאים מוארכים ו-si. תמונה זו היא דוגמה למיקרוגרף אלקטרוני של חיתוך דק מזן מעבדה של שמרים SH 1 0 2 0 ו-W 3 0 3.רקע.המושבה גודלה במשך שישה ימים במצע YNA לפני החתך. התמונה מראה אזור במושבה המכיל תדירות גבוהה של תאים עם נבגים. חץ מצביע על המבנה הדו-שכבתי של דופן הנבג.בחלק A, אנו מציגים חתך של מושבה בת ארבעה ימים עם רשת המורכבת מ-15 מלבנים המוטבעת על התמונה בחלק B. תדירות התאים הקשורים לנבגים בכל מלבן מוצגת באמצעות 15 העמודות המתאימות ל-15 המלבנים המוצגים בחלק A. הנתונים הם הממוצע והטעות התקנית של ארבע מושבות עצמאיות בנות ארבעה ימים. בחלק C, מוצגים הממוצעים והטעויות התקניות עבור ארבע מושבות עצמאיות בנות שמונה ימים. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשבועיים, הכוללים יום מלא אחד ומספר ימים של שעה עד שלוש שעות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להוסיף את התמיסות באופן מיידי כדי שהבלוקים לא יתייבשו בעקבות הליך זה.שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונו-היסטוכימית, עשויות לשמש לקביעת התפלגותן של תאים המבטאים חלבונים ספציפיים לאחר התפתחותם. טכניקה זו אפשרה לנו לבחון לא רק את דפוסי ההתבססות של תאים ספורולטיביים, אלא גם את דפוסי ההתבססות של תאי פסאודו-היפות במושבות croce CCI. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן הטמיעה של מושבות שמרים לצורך חיתוך.אל תשכחו כי רבים מהריאגנטים למיקרוסקופיה המשמשים בפרוטוקול זה עלולים להיות מסוכנים ביותר. אנא זכרו להשתמש במנדף, ללבוש ביגוד מגן ולהשליך את הריאגנטים באופן 적절. אוקיי, זה הכל.תודה לצפייה. בהצלחה בניסויים שלכם.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקה מהירה להדמיה של גידול בתאי שמרים משותקת, מיושם כאן לכתבים פלורסנט בבית לוקוסים שקט ההזדווגות HML ו...

טכניקה מהירה עבור ויזואליזציה של תאים חיים שמרים ללא יכולת לזוז

סרטון זה מתאר שיטה לגידול וניתוח איכותי של ביופילמים חיידקיים על קורים פטרייתיים באמצעות מיקרוסקופיה. ביופילמים חיידקיים נוצרים לעתים קרובות על משטחים פטרייתיים וכוללים תהליכי אינטראקציה חיידקיים-פטרייתיים רבים, כגון שיתוף פעולה מטבולי, תחרות או טריפה.

שיטה להכנת דגימות כדי לדמיין חיידקים יוצרי ביופילם על קורים פטרייתיים

אנו מציגים פרוטוקול להקפאה וcryosectioning קהילות שמרים להתבונן דפוסים הפנימיים של תאי ניאון. השיטה מסתמכת על מתנול, תיקון ואוקטובר הטבעה-לשמר את הפיזור המרחבי של תאים ללא inactivating חלבוני ניאון בתוך קהילה.

Cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי

מוצגת שיטה לכרומוזומים המתפשטים על פני השטח משמרים ניצנים. שיטה זו נגזרת משיטה שתוארה בעבר על ידי לוידל וקליין. בנוסף, אנו מדגימים הליך לצביעה חיסונית של כרומוזומים מפוזרים.

משטח הפצת וImmunostaining של כרומוזומים שמרים

ניצני שמרים הוא מודל יתרון לחקר הדינמיקה microtubule in vivo עקב גנטיקה חזקה שלה ואת הפשטות של שלד התא microtubule שלה. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להפוך ותאי שמרי התרבות, לרכוש תמונות מיקרוסקופיה confocal, וגם כמותית לנתח דינמיקת microtubule בתאים חיים שמרים.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

אנו מתארים קיבעון, פרפין הטבעה וטכניקות דק אופטים עבור biofilms מושבת חיידקים. בדגימות מוכן, דפוסי ביטוי בתיוג וכתבת biofilm ניתן לאבחן באמצעות מיקרוסקופ.

פרפין הטבעה ואת חלוקתה דק של מושבת חיידקים Biofilms לבדיקה מיקרוסקופית

כאן, אנו מציגים יישום MATLAB של זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ביקוע ותאי שמרים.

ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית

צוואר בקבוק במחזור ' עיצוב-לבנות בדיקה ' של הנדסת חיידקים היא המהירות שבה אנחנו יכולים לבצע מסכי פונקציונלי של זנים. אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה לסינון המתח המוחל על מאות אלפי תאים שמרים לכל ניסוי העושה שיטה ברצף RNA מבוסס droplet.

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

פנוטיפים של צמיחת שמרים נמדדים במדויק באמצעות הדמיה מקבילה מאוד של תאים משותקים הגדלים למיקרוקולוניות. במקביל, ניתן לעקוב אחר עמידות ללחץ, ביטוי חלבון ולוקליזציה של חלבונים, וליצור ערכות נתונים משולבות כדי לחקור כיצד הבדלים סביבתיים וגנטיים, כמו גם הטרוגניות של ביטוי גנים בקרב תאים איסוגניים, מווסתים את הצמיחה.

הדמיה חיה בעלת תפוקה גבוהה של מיקרוקולוניות למדידת הטרוגניות בצמיחה ובביטוי גנים

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה ומהירה של culturing שמרים ואת התבנית Aspergillus fumigatus מקבוצות גדולות של דגימות קרקע תוך 7 ימים בלבד. ניתן לשנות את השיטות בקלות כך שיתאימו למגוון של מדיות דגירה וטמפרטורות לפי הצורך לניסויים.

בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית

למד שיטת הטבעה למושבות שמרים לצורך ניתוח מיקרוסקופי של תאים ספורולטיים ופסאודוהיפליים. פרוטוקול זה מאפשר חקר ארגון תאים בקהילות פטרייתיות.

במושבה שמרים והטבעה שיטה

גלה סרטונים נוספים