ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית
April 1st, 2011
פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מנצלת את חיישן YFP מבוססי permutated מעגלית סידן עירור כפול ratiometric (ratiometric pericam-MT) הביע סלקטיבי במיטוכונדריה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב אחר שינויים בריכוז הסידן המיטוכונדריאלי בתאים חיים. זה מושג על ידי טרנסקטציה ראשונה של תאים עם פרם מטרי יחס חלבון אינדיקטור סידן, המכוון למטריצה המיטוכונדריאלית, יום או יומיים לאחר הטרנספקציה. המיקרוסקופ הקרינה והתוכנה מוגדרים להדמיית תאים חיים.
תמונות של תאים המבטאים פראם מטרי יחס נרכשות לאחר מכן עם תוספת של אגוניסט מגייס סידן. השלב האחרון בהליך הוא ניתוח כמותי של התמונות שנרכשו. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים דינמיים בריכוז הסידן המיטוכונדריאלי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים המבטאים חלבון אינדיקטור סידן מטרי.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון מדידת רמות סידן באמצעות מדדי סידן סינתטיים הוא שפרם מטרי יחס מקודד גנטית ולכן ניתן למקד אותו למיטוכונדריה או לכל איבר אחר מעניין. שלום, אני ד"ר אסקר, פוסט-דוקטורנט במעבדתו של ד"ר בנינג, ואני אדגים את ההליך היום כדי להתחיל את תאי ההלו של לוחית הפרוטוקול בלילה שלפני, טרנספקציה על החלקות כיסוי זכוכית סטריליות המונחות בצלחת תרבית סטנדרטית של שש בארות בצפיפות שתהיה בערך 70% שוטפת לטרנספקציה למחרת. למחרת הכינו קומפלקסים של כריתת שומן DNA 2000 לפי הוראות היצרן עם ארבעה מיקרוגרם של וקטור ביטוי מיטוכונדריאלי מטרי של פרם, ו-10 מיקרוליטר של כריתת שומן 2000 מדולל ב-0.5 מיליליטר של אופטימום עבור כל באר שתועבר.
לאחר מכן, החלף את אמצעי התרבית D-M-E-M-F-B-S HELOC בכל באר ב-1.5 מיליליטר של אותה מדיה ללא אנטיביוטיקה. מוסיפים את תמיסת LIPECTOMY לתמיסת ה-DNA ומערבבים בעדינות לאחר היווצרות הקומפלקסים. הוסף את תמיסת כריתת הליפקטומיה של ה-DNA טיפה לכל באר כדי לערבב אותה על ידי נדנוד עדין של הצלחת ולדגור במשך ארבע שעות בחממת תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני לאחר הדגירה.
החלף את המדיה באנטיביוטיקה המכילה D-M-E-M-F-B-S. אפשר לתאים לבטא פרם מטרי במשך יום עד יומיים לפני הדמיה באמצעות מלקחיים. הנח בעדינות פתק כיסוי עם תאי HELOC לתוך תא הדמיה מתאים עם תמיסת הדמיה.
התקן את תא ההדמיה בשלב מיקרוסקופ הפוך. לאחר מכן, השתמש ביעד טבילת שמן של פי 40 ומעלה ובאורך גל של 380 ננומטר. כדי למצוא אזור עניין המכיל תא אחד או יותר המבטא יחס מטרי, פראם 380 ננומטר משמש כאן לזיהוי התאים כמדד יחס.
פראם פחות עמיד בפני פוטוהלבנה באורך גל זה. לאחר שזוהה תחום עניין, הגדר את התוכנה לעירור כפול ב-495 ו-380 ננומטר. לאחר מכן, רכוש תמונות ברצף על ידי לחלופין מרגש ב-495 ו-380 ננומטר.
רכוש תמונות של רמות הסידן הבסיסיות לפחות 30 שניות לפני יישום האגוניסט. לאחר מכן יש למרוח את האגוניסט המגייס סידן באמצעות מנגנון שפע, תוך ציון זמן התוספת עבור כל אגוניסט זמני החשיפה ומרווחי הרכישה צריכים להיות אופטימליים כדי למנוע הלבנת פוטו תוך מתן רזולוציה זמנית מספקת. לאחר השלמת הניסוי, ניתן לנתח תמונות במצב לא מקוון.
כדי להתחיל בניתוח, בחר אזור עניין בתוך אזור ריק של השדה כדי להחסיר את הקרינה ברקע במידת הצורך. לאחר מכן, ייצא את מדידות היחס 4 95 3 80 מאזור העניין לאקסל או לתוכנת גרפים דומה. פאנל תמונות זה מציג את הלוקליזציה התת-תאית של פרם מטרי יחס ומיטוכונדריה.
משמאל תמונת תא חיה של תאי הלו המבטאים פראם מטרי יחס. באמצע יש צביעה פלואורסצנטית של המיטוכונדריה וצבע סלקטיבי של גשש MIT אדום CMX Ross. ולבסוף מימין, התמונה הממוזגת המוצגת כאן היא סדרה של תמונות פסאודו-צבע 4 95, 3 80 ננומטר של ארבעה תאי הלו המבטאים פרם מטרי יחס במיטוכונדריה שטופלו ב-10 מיקרו-מולרי A TP, וכימות השינויים ברמות הסידן המיטוכונדריאלי של ארבעת התאים הקודמים מוצג כאן בתמונה זו של תא הלה המבטא פרם מטרי יחס במיטוכונדריה.
הטרוגניות של תגובת הסידן במיטוכונדריה בודדת, כמו גם פיצול משמעותי של המיטוכונדריה, ניכרת על ידי 60 דקות של טיפול ב-0.5 מיקרו-מולארי של ספורין. לחלק מהמיטוכונדריה יש עלייה תנודתית בסידן המוצגת עם החץ הלבן, בעוד שאחרים אינם מראים שינויים משמעותיים ברמת הסידן המוצגת עם חץ צהוב. גרף זה חושף את השינוי ברמות הסידן המיטוכונדריאליות הגלובליות בתא הלו בודד לאחר השראת אפופטוזיס למשך 120 דקות עם 0.5 ספורין סטור מיקרו-מולרי.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד שינויים דינמיים ברמות הסידן המיטוכונדריאליות בתגובה ל-tli שונים באמצעות חלבון תרופתי סידן R פראם גיאומטרי, המכוון באופן סלקטיבי למטריצה המיטוכונדריאלית.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידה בזמן אמת של זרימות סידן מיטוכונדריות באמצעות מחוון סידן מקודד גנטית, pericam-mt יחס מטרי. טכניקה זו מאפשרת ניטור דינמי של רמות הסידן בתאים חיים, ומספקת תובנות לגבי תפקוד המיטוכונדריה.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- הדמיית פלואורסצנציה
רקע
- רמות סידן מיטוכונדריות הן חיוניות למטבוליזם ותקשורת תאית.
- שיטות מסורתיות למדידת רמות סידן מסתמכות לעתים קרובות על מחוונים סינתטיים.
- מחוונים מקודדים גנטית מציעים יתרונות בספציפיות ובמיקוד.
- מחקר זה משתמש ב-pericam-mt יחס מטרי לצורך הדמיה משופרת של דינמיקת סידן מיטוכונדרית.
מטרת המחקר
- להרחיב שינויים בריכוז הסידן המיטוכונדרי בתאים חיים.
- להדגים את השימוש במחוון סידן מקודד גנטית המכוון למיטוכונדריה.
- לספק פרוטוקול מפורט להדמיה וניתוח זרימות סידן מיטוכונדריות.
שיטות ששימשו
- טרנספקציה של תאים עם pericam-mt יחס מטרי.
- הדמיית תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- עירור רציף באורכי גל כפולים למדידת סידן.
- ניתוח כמותי של תמונות פלואורסצנטיות להערכת דינמיקת סידן.
תוצאות עיקריות
- שינויים דינמיים ברמות הסידן המיטוכונדריות נמדדו בהצלחה.
- נצפתה הטרוגניות בתגובות הסידן בין מיטוכונדריות בודדות.
- צוינו פיצול משמעותי של המיטוכונדריות תחת טיפולים מסוימים.
- התוצאות הדגימו את האפקטיביות של pericam-mt יחס מטרי להדמיה בזמן אמת.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה אמינה ללימוד דינמיקת סידן מיטוכונדרית.
- מחוונים מקודדים גנטית כמו pericam-mt יחס מטרי משפרים את יכולות ההדמיה.
- ניתן ליישם טכניקה זו לתנאים ניסויים שונים כדי לחקור את תפקוד המיטוכונדריה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Monitoring mitochondrial calcium dynamics provides critical mechanistic insights into apoptosis pathways, enabling target validation in cell death mechanisms. This genetically encoded sensor approach supports predictive confidence in preclinical models by quantifying organelle-specific calcium fluxes with temporal resolution. The method facilitates early de-risking of therapeutic hypotheses involving mitochondrial dysfunction in disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial calcium as a regulator of apoptotic pathways for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides organelle-specific readouts that reduce ambiguity in mechanistic studies of cell death.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets involved in calcium-mediated apoptosis through real-time flux measurements.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ratiometric data enabling dose-response analysis of compounds affecting mitochondrial calcium.
- Operational Value: Compatible with standard wide-field microscopy, allowing integration into existing imaging platforms without specialized equipment.
- Scalability Value: Enables longitudinal tracking of calcium dynamics and mitochondrial morphology in live cells over hours.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links mitochondrial calcium changes to apoptotic outcomes, supporting biomarker relevance in disease models.
- Operational Value: Demonstrates utility with both ATP (physiological agonist) and staurosporine (apoptosis inducer), broadening applicability across experimental conditions.
- Translational Continuity: Facilitates progression from mechanism discovery to preclinical validation by providing dynamic, physiologically relevant readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through mechanistic de-risking to preclinical assessment by providing dynamic, quantifiable data on mitochondrial function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of calcium-dependent apoptotic pathways through real-time mitochondrial flux measurements.
- Screening: Enables assay-ready systems with standardized, reproducible calcium readouts for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers quantitative ratiometric outputs (495nm/380nm excitation ratio) that allow statistical comparison of calcium dynamics across conditions.
- Translational Research: Connects mitochondrial calcium changes to apoptotic phenotypes, supporting continuity from mechanism to phenotypic outcome.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for studying mitochondrial dysfunction across multiple disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in apoptosis pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through genetically encoded, organelle-targeted indicators that avoid dye leakage and artifacts.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insights into mitochondrial mechanisms of compound action.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on mitochondrial calcium modulation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology for transfection and live-cell imaging.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-excitation capability (380nm and 495nm) and standard filter sets.
- Necessitates standardization of image acquisition protocols and region-of-interest analysis across teams.
- Adaptation considerations include mitochondrial targeting efficiency and potential overexpression artifacts in different cell models.
- Practical limitations include photobleaching risks during long-term imaging and need for optimization of agonist exposure intervals.
