Name: ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: למדו לנטר שינויים דינמיים ברמות הסידן המיטוכונדריאלי בתאים חיים באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית ratiometric pericam-mt. שיטה זו מאפשרת מדידה בזמן אמת של תהליכי סידן מיטוכונדריאלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות Atsushi מיאווקי לספק לנו לבנות ratiometric-pericam-MT הביטוי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק GM081685 מן המכונים הלאומיים לבריאות (DB).

1. Pericam-MT transfection הכנה Cell. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים הלה אמש transfection על coverslips זכוכית סטרילית להציב צלחת 6-טוב תקן תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA / Lipofectamine 2000 מתחמי כפי שהוצע על ידי היצרן (Invitrogen). אנו משתמשים 4 מיקרוגרם של וקטור ratiometric-pericam-MT הביטוי 10 μL של 2000 Lipofectamine מדולל 0.5 מ"ל של Opti-ממ טוב עבור כל אחד. התאים צריכים להיות ~ ומחוברות 70% לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף הלה תרבות המדיה (שונה Dulbecco של נשרים בינוני, 10% FBS, פניצילין / סטרפטומיצין) בכל טוב עם 1.5 מ"ל של התקשורת אותו ללא אנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ה-DNA / Lipofectamine מתחמי זה טוב להיות transfected. מערבבים בעדינות עם נדנדה דגירה של 4 שעות תרבית תאים החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף אנטיביוטי ללא מדיה עם התקשורת בתרבות עם אנטיביוטיקה. אפשר תאים להביע pericam ratiometric עבור 1-2 ימים לפני הדמיה. </li></ol> 2. מיקרוסקופ התקנה רכישת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip עם תאים הלה לתא הדמיה המתאים פתרון הדמיה: 107 מ"מ NaCl, KCl 7.2mM, 1.2 מ"מ MgCl 2, 1mm CaCl 2, 11.5mM גלוקוז, 0.1% אלבומין בסרום שור, ו HEPES 20mm 7.2. המעבדה שלנו משתמשת תא תא Attofluor מן Invitrogen. הר קאמרית הדמיה בשלב מיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא שטח של עניין המכיל אחד או יותר תאים להביע pericam ratiometric באמצעות טבילה 40X (או יותר) המטרה שמן. מצאנו כי pericam ratiometric הוא עמיד פחות photobleaching ב 380 ננומטר, ולכן אנו משתמשים באורך גל מתאים כדי לזהות תאים. לתמונות רכשה באיור 1, מטרה Superfluor ניקון 40X עם צמצם 1.3 מספרית היה בשימוש. מטרות בהגדלה גבוהה גם יהיה מתאים (60-100x). מסננים עירור שננקטו Chroma מסננים טכנולוגיה D380/30x (380 + / - 30 ננומטר) D495/10 (495 + / - 5 ננומטר), היה beamsplitter 505DCXR (505nm longpass), ואת פליטת לסנן היה HQ535/50m (535 + / - 25nm). מיקרוסקופ שלנו נהגו לרכוש את התמונות באיור 1 מורכב מיקרוסקופ Nikon TE2000 הפוך מצויד מדעי רופר Coolsnap HQ מקורר מצלמת CCD, Ludl MAC6000 מהיר גלגל לסנן מחליף, וכן רכישת נתונים MetaFluor ותוכנה ניתוח. פרוטוקול זה ניתן להתאים כל מיקרוסקופ רחב בתחום סטנדרטי עם מסננים מתאימים התוכנה מסוגלת ללכוד ועיבוד תמונות ratiometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תוכנה עבור עירור כפול באמצעות 495 ו - 380 מסנני ננומטר. סידן מחייב pericam ratiometric מגביר ספיגת ב 495 ננומטר, ולכן היחס צריך להיות מוגדר להיות 495 nm/380 ננומטר. Ratiometric pericam יש סידן ללא עירור שיא ב 415 ננומטר 4. בפרוטוקול זה אנו ממליצים להשתמש ננומטר 380 לסנן רק משום שהוא נמצא בכל מקום במעבדות הדמיה ביותר לסידן. אם מסנן 410 ננומטר זמין, עדיף כדי לסנן את 380 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תמונות ברצף על ידי מרגש לחילופין ב 495 ו 380 ננומטר. לרכוש תמונות של רמות הסידן הבסיסית במשך לפחות 30 שניות לפני היישום של אגוניסט באמצעות מנגנון זלוף. סמן את הזמן בנוסף עבור כל אגוניסט. פעמים חשיפה מרווחי הרכישה צריך להיות מותאם למנוע photobleaching תוך מתן resolution.For מספקת דוגמה הזמני, עבור חצי מהיר הדינמיקה סידן פיקוח בתגובה לגירוי אגוניסט, תמונות נרכשו כל שתי שניות ב 1B דמויות ו-C הרבה יותר מהר שיעורי הרכישה גם אפשרי 6. לטווח ארוך הדמיה לאחר מתן staurosporine נרכשה עם מרווח יותר (ה -30) בין רכישות (איורים 1 D ו-E). </li></ol> 3. עיבוד תמונה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניסוי הושלם, תמונות שהושגו ניתן לנתח במצב לא מקוון. הגדרת אזורים של עניין (ROI) שבו אתם רוצים לעקוב אחר השינויים ברמות הסידן. השתמש ROI נבחרים בתוך שטח ריק של השדה כדי לחסר הרקע במידת הצורך. יצוין כי המיטוכונדריה הם ניעתי די דינמי, ואירועים וחיוץ ב mitochondrion אחת על פני תקופות המורחבת לא תמיד אפשרי. לפיכך, בהתחשב תנועתיות גבוהה של אברון זה בכמה סוגי תאים, מבחר של ההחזר על ההשקעה צריכה להיות במעקב צמוד. יתר על כן, כפי שעולה איור 1, בתגובה המיטוכונדריה הטרוגני לגירויים שונים. לכן חשוב לנתח נתונים מקוון לפקח RO1 השמה על בסיס מסגרת לפי מסגרת. תיאור מפורט של מדידת סידן המיטוכונדריה מאוד המיטוכונדריה ניעתי תוארה במקומות אחרים 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידות יחס המתקבל ROI יכול להיות מיובאים לתוך Excel או graphingsoftware דומה. נתונים ניתן להציג שמץ המייצג שינויים ברמות הסידן המיטוכונדריה בתא בודד או mitochondrion בודד, או בממוצע flאותות uorescence מ ROI מספר. יש לנו גם השתמשו בטכניקה זו כדי למדוד את רמות הסידן הממוצעת המיטוכונדריה אוכלוסייה של לימפוציטים שעברו אפופטוזיס המושרה על ידי Fas ליגנד 8. </li></ol> 4. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2579/2579fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. (א) לוקליזציה subcellular של ratiometric-pericam-Mt. זו התמונה הראשונה מציגה לחיות תא הלה הביע ratiometric-pericam-Mt. התמונה השנייה מציגה מכתים ניאון עם mitochondrion סלקטיבית MitoTracker CMXRos צבען האדום. פלואורסצנטי צהוב בתמונה הממוזג מדגים שיתוף לוקליזציה של ratiometric-pericam-MT ו - פלואורסצנציה MitoTracker. (B) סדרה של יחס pseudocolor (495:380 ננומטר) תמונות של 4 תאים הלה הביע MT-ratiometric pericam שטופלו 10 mM ATP . (C) כימות של השינויים ברמות הסידן המיטוכונדריה באזור של עניין (ROI) המצוין סדרה (ב) (ד) שטופלו עם 10 mM ATP. יחס pseudocolor (495:380 ננומטר) תמונות של תא הלה הביע הר -ratiometric pericam שטופלו staurosporine 0.5 מיקרומטר. הטרוגניות בתגובה הסידן במיטוכונדריה הפרט בא לידי ביטוי, כמו גם פיצול משמעותי של המיטוכונדריה של 60 דקות. המיטוכונדריה יש עליות oscillatory בסידן (ראש חץ לבן), ואילו אחרים אינם מראים שינויים משמעותיים ברמת הסידן (ראש חץ צהוב). (E) כימות עליות גלובלי רמות הסידן המיטוכונדריה בתא הלה יחיד לאחר אינדוקציה של אפופטוזיס עם 0.5 מיקרומטר staurosporine.

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+signalling+and+cell+death%3A+approaches+for+assessing+the+role+of+mitochondrial+Ca2%2B+uptake+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis.</a> Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).</li>
<li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).</li>
<li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2%2B+revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li>
<li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li>
<li>Shimozono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+of+subcellular+Ca2%2B+concentrations+using+a+dual-excitation+ratiometric+indicator+based+on+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein.</a> Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).</li>
<li>Wozniak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+biphasic+calcium+release+from+the+endoplasmic+reticulum+for+Fas-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis.</a> J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).</li>
<li>Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+binds+to+inositol+%281%2C4%2C5%29+trisphosphate+receptors%2C+amplifying+calcium-dependent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).</li>
<li>Csordas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li>
<li>Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+intramitochondrial+and+cytosolic+pH%3A+early+events+that+modulate+caspase+activation+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).</li>
<li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כאן אנו מציגים שיטה מאוד פשוטה למדידת סידן המיטוכונדריה באמצעות המיטוכונדריה במיקוד pericam ratiometric. כפי שניתן לראות בתרשים 1 א &#39;, באמצעות תקן widefield אופטיקה עם deconvolution לא ניתן להציג בקלות את המיטוכונדריה בתאים בודדים הלה עם יחס אות לרעש מקובל. הסיבה לכך היא כי תאים הלה, כמו רוב התאים בתרבית, מחוץ לשטח באופן משמעותי כאשר חסיד obviating את הצורך מיקרוסקופיה confocal או ציוד מיוחד אחר. מצאנו תוצאות דומות בתאים Jurkat דבק poly-ליזין coverslips מצופה 8. בניגוד מתודולוגיות באמצעות צבעים, אותו ניתן גם הלא פולשני לעקוב אחר רמות סידן המיטוכונדריה שעות באינדיקטורים סידן מקודדים גנטית כגון pericam ratiometric (איור 1E). זה חשוב במיוחד בעת ניתוח סידן המיטוכונדריה במהלך מוות של תאים. יתר על כן, אפשר גם לדמיין ביקוע / פיצול של המיטוכונדריה במהלך תהליך אפופטוטיים. כפי שמוצג 1D דמויות ו-E, טיפול staurosporine גורמת לעלייה איטית סידן subpopulations לבחור מתוכם פסגות המיטוכונדריה ב 20 דקות. רמות סידן לרדת שוב במקביל עם פיצול המיטוכונדריה לפני הולך שוב 2 שעות לאחר הטיפול. זה עולה בקנה אחד עם גלים איטיים בסידן cytosolic המושרה על ידי טיפול staurosporine שנמדדו באמצעות Fura-2 9. לפיכך, מידע חשוב הקינטית ניתן להשיג דבר שאינו אפשרי עם שיטות העסקת מדידות סטטי. למרות הצגנו יחסי ולא ריכוזי הסידן באיור 1, ניתן לכייל את החיישן באתרו לחשב רמות הסידן מוחלט 4, 10. אזהרה אחת חשובה שיש לקחת בחשבון הוא כי pericam ratiometric רגיש pH 4, 10. כמו גם רמות ה-pH cytosolic ואת המיטוכונדריה יכולה להשתנות באופן דרמטי במהלך 11 אפופטוזיס, זה שיקול חשוב. טיטרציה של pH ב pericam מבודד להביע המיטוכונדריה להוכיח כי הגדלת [H +] מגדיל פליטת pericam כאשר נרגש ב 495 ננומטר, עם השפעה מועטה על פליטה מאולצת על ידי עירור ב 410 ננומטר, מאפיין אשר נוצל למדוד בו זמנית הן סידן המיטוכונדריה ו pH 12. לכן, באופן סלקטיבי ניטור פליטה עם עירור 410 ננומטר מספק אמצעי סידן שאינם ratiometrically לפקח המיטוכונדריה בדאגה מופחת עבור ה-pH. לבסוף, את הפרוטוקול המוצגים כאן רק מחייב גישה מיקרוסקופ epifluorescent סטנדרטי עם מסנני זמינים באופן נרחב, ובכך טכניקה זו נגישה ביותר במעבדות.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנציה רחב-שדה הפוך לדימוי סידן</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53310</td><td>ניתן להתאים בקלות כל מיקרוסקופ הפוך רחב-שדה המצויד במסנני עירור של 380 nm/495 nm ובמסנני מעבר ארוך ופליטה מתאימים לשימוש בפרוטוקול זה.</td></tr><tr><td>תוכנת דימוי</td><td>Molecular Devices</td><td>Metafluor</td><td></td></tr><tr><td>תא תאים Attofluor</td><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td>כל תא דימוי למיקרוסקופ הפוך המאפשר פרפוזיה יהיה מספיק.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>רוב ריאגנטים/פרוטוקולי טרנספקציה יהיו מתאימים למחקרים אלו</td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr></tbody></table>

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

שינויים דינאמיים בריכוז סידן תוך תאי בתגובה לגירויים שונים מווסת תהליכים תאיים רבים, כגון ריבוי, התמיינות, אפופטוזיס ו 1. במהלך הצטברות סידן, אפופטוזיס במיטוכונדריה מקדמת את שחרורו של תומכי אפופטוטיים גורמים מן המיטוכונדריה לתוך 2 cytosol. לכן זה עניין למדוד ישירות סידן המיטוכונדריה בתאים חיים באתרו במהלך אפופטוזיס. ברזולוציה גבוהה דימות פלואורסצנטי של תאים עמוסה עירור כפול ratiometric ולא ratiometric צבעים אינדיקטור סינתטי סידן הוכח להיות כלי אמין צדדי ללמוד היבטים שונים של סידן איתות תאיים. מדידת והנתיבים סידן cytosolic באמצעות טכניקות אלה היא פשוטה יחסית. עם זאת, מדידת רמות סידן intramitochondrial בתאים שלמים באינדיקטורים סידן סינטטי כגון rhod-2 ו-FF rhod הוא יותר מאתגר. האינדיקטורים סינתטי ממוקד המיטוכונדריה הקהו התגובות מגביר חוזרות בסידן המיטוכונדריה, ולשבש מורפולוגיה המיטוכונדריה 3. בנוסף, האינדיקטורים סינתטיים נוטים לדלוף החוצה של המיטוכונדריה על כמה שעות מה שהופך אותם מתאימים לטווח ארוך ניסויים. לכן, האינדיקטורים סידן מקודדים גנטית מבוססת על הפלואורסצנט הירוק (GFP) חלבון 4 או 5 aequorin ממוקד המיטוכונדריה הקלו מאוד מדידת דינמיקה סידן המיטוכונדריה. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה בתגובה לגירויים שונים. השיטה מבוססת על מיקרוסקופ פלואורסצנטי של &quot;ratiometric-pericam&quot; אשר מיועד סלקטיבי המיטוכונדריה. Pericam Ratiometric הוא אינדיקטור סידן על בסיס היתוך של חלבון permuted מעגלית ניאון צהוב calmodulin 4. עקידת סידן pericam ratiometric גורמת לשינוי של שיא עירור שלה nm 415-494 ננומטר, בעוד ספקטרום פליטה, אשר פסגות סביב 515 ננומטר, נשאר ללא שינוי. Ratiometric pericam נקשר יון סידן אחד עם ניתוק קבוע במבחנה של 1.7 מיקרומטר ~ 4. אלה המאפיינים של pericam ratiometric לאפשר כימות של שינויים מהירים לטווח ארוך בריכוז הסידן המיטוכונדריה. יתר על כן, אנו מתארים הסתגלות של מתודולוגיה זו מיקרוסקופ סידן תקן רחב בתחום ההדמיה עם מערכות הסינון זמין בדרך כלל. השימוש בשתי אגוניסטים ברורים, אגוניסט ATP purinergic ו אפופטוזיס וישכנע staurosporine התרופה, אנו מוכיחים כי שיטה זו היא המתאימה לניטור שינויים בריכוז הסידן המיטוכונדריה עם רזולוציה הזמני של שניות שעות. יתר על כן, אנחנו גם מראים כי pericam ratiometric שימושית גם עבור ביקוע מדידת הפיצול המיטוכונדריה / במהלך אפופטוזיס. לפיכך, pericam ratiometric הוא גם מתאים במיוחד למדידת לטווח ארוך מתמשך של הדינמיקה סידן המיטוכונדריה במהלך אפופטוזיס.

פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מנצלת את חיישן YFP מבוססי permutated מעגלית סידן עירור כפול ratiometric (ratiometric pericam-MT) הביע סלקטיבי במיטוכונדריה.

שינויים דינמיים בריכוז הסידן התו-תאי בתגובה לגירויים שונים מווסתים תהליכים תאיים רבים, כגון שגשוג, ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לנטר שינויים בריכוז הסידן המיטוכונדריאלי בתאים חיים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי טרנספקציית תאים עם חלבון מדעי (ratiometric) של אינדיקטור לסידן, peram, המכוון למטריקס המיטוכונדריאלי, יום או יומיים לאחר הטרנספקציה. מיקרוסקופ הפלואורסצנציה והתוכנה מוגדרים לדימות תאים חיים.לאחר מכן, נרכשות תמונות של תאים המבטאים חלבון PERAM רציומטרי עם הוספה של אגוניסט המגייס סידן. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ניתוח כמותי של התמונות שנרכשו. לבסוף, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים דינמיים בריכוז הסידן במיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים המבטאים חלבון אינדיקטור רציומטרי לסידן.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מדידת רמות סידן באמצעות אינדיקטורים סינתטיים לסידן, הוא ש-ratio metric peram מקודד גנטית ולכן ניתן לכוון אותו למיטוכונדריה או לכל אברון אחר בעל עניין. שלום, אני ד"ר Ascar, פוסט-דוקטורנט במעבדתו של ד"ר Benning, והיום אדגים את הפרוצדורה. כדי להתחיל בפרוטוקול, יש לזרוע תאי HeLa בערב שלפני כן, לצורך טרנספקציה על לבישי זכוכית סטריליים המונחים בתוך פלטת תרבית סטנדרטית של שש בארות, בצפיפות שתהיה כ-70% confluent במועד הטרנספקציה למחרת. למחרת, הכינו קומפלקסים של DNA Lipofectamine 2000 לפי הוראות היצרן, עם 4 µg של וקטור ביטוי מיטוכונדריאלי של metric peram, ו-10 µL של Lipofectamine 2000 המדוללים ב-0.5 mL של Opti-MEM עבור כל בארה המיועדת לטרנספקציה.בשלב הבא, החליפו את מצע התרבית D-M-E-M-F-B-S HELOC בכל באר ב-1.5 milliliters של אותו מצע ללא אנטיביוטיקה. הוסיפו את תמיסת ה-LIPECTOMY לתמיסת ה-DNA וערבבו בעדינות לאחר שנוצרו הקומפלקסים. הוסיפו את תמיסת ה-DNA Lipectomy בטיפות לכל באר המיועדת לטרנספקציה, ערבבו על ידי נעירוה עדינה של הפלטה והדגרימו למשך ארבע שעות באינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide לאחר ההדגירה.החליפו את המצע ב-D-M-E-M-F-B-S המכיל אנטיביוטיקה. אפשרו לתאים לבטא את metric peram למשך יום עד יומיים לפני הדמיה באמצעות פינצטה. הניחו בעדינות זכוכית כיסוי עם תאי HELOC לתוך תא הדמיה מתאים עם תמיסת הדמיה.התקינו את תא הדמיה על במה של מיקרוסקופ הפוך. לאחר מכן, השתמשו בעדשת שימור בשמן (oil immersion objective) בהגדלה של 40 x או יותר ובאורך גל של 380 nanometers. כדי למצוא אזור עניין המכיל תא אחד או יותר המבטאים PERCAM ratio metric, נעשה שימוש כאן ב-380 nanometers לצורך זיהוי התאים כ-ratio metric.Peram פחות עמיד להבהרה פוטו-כימית (photobleaching) באורך גל זה. לאחר זיהוי האזור המבוקש, הגדירו את התוכנה לעירור כפול ב-495 וב-380 ננומטר. לאחר מכן, רכשו תמונות באופן סדרתי על ידי עירור לסירוגין ב-495 וב-380 ננומטר.רכשו תמונות של רמות הסידן הבסיסי למשך 30 שניות לפחות לפני יישום האגוניסט. לאחר מכן, יישמו את האגוניסט המגייס סידן באמצעות מכשיר פרופוזיה (profusion apparatus), תוך רישום זמן ההוספה עבור כל חשיפה לאגוניסט; יש לאופטימיזציה של זמני החשיפה ומרווחי הרכישה כדי למנוע פוטו-بلیצ'ינג (photo bleaching) ועדיין לאפשר רזולוציה זמנית מספיקה. עם השלמת הניסוי, ניתן לנתח את התמונות באופן לא מקוון.כדי להתחיל בניתוח, בחר אזור עניין (ROI) בתוך שטח ריק בשדה כדי להפחית פלואורסצנציית רקע במידת הצורך. לאחר מכן, ייצא את מדידות היחס 4 95 3 80 מאזור העניין ל-Excel או לתוכנת גרפים דומה. פאנל תמונות זה מציג את הלוקליזציה התת-תאית של peram ומיטוכונדריה בשיטה רציומטרית.משמאל מוצגת תמונת תא חי של תאי hela המבטאים ratio metric peram. במרכז מוצגת צביעה פלואורסצנטית של המיטוכונדריה באמצעות הצבע הסלקטיבי MIT tracker red CMX Ross. ולבסוף מימין, התמונה המאוחדת המוצגת כאן היא סדרה של תמונות ratio בצבעי פסאודו של 495, 380 nanometer של ארבעה תאי hela המבטאים ratio metric peram במיטוכונדריה שטופלו ב-10 micromolar ATP, והכמות של השינויים ברמות הסידן המיטוכונדריאליות של ארבעת התאים הללו מוצגת כאן בתמונה זו של תא hela המבטא ratio metric peram במיטוכונדריה.הטרוגניות בתגובת הסידן במיטוכונדריה בודדות, כמו כן פרגמנטציה משמעותית של המיטוכונדריה, ניכרת לאחר 60 דקות של טיפול ב-0.5 µM staurosporine. חלק מהמיטוכונדריה מראות עליות תנודתיות בסידן, כפי שמוצג באמצעות החץ הלבן, בעוד שאחרות אינן מראות שינויים משמעותיים ברמת הסידן, כפי שמוצג באמצעות החץ הצהוב. גרף זה חושף את השינוי ברמות הסידן המיטוכונדריאליות הגלובליות בתא HeLa בודד לאחר השראת אפופטוזה למשך 120 דקות עם 0.5 µM staurosporine.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למדוד שינויים דינמיים ברמות הסידן המיטוכונדריאליות בתגובה לגירויים שונים, באמצעות חלבון R geometric peram המתווך סידן, המכוון באופן סלקטיבי למטריקס המיטוכונדריאלי.

monitoring-dynamic-changes-mitochondrial-calcium-levels-during

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Live-תא הדמיה של אפופטוזיס caspase-3 בתיווך ב-N19 oligodendrocyte תרבויות הנציח התא...

ביקע ניטור caspase-3 פעילות אפופטוזיס של תאים Oligodendroglial הונצח באמצעות Live-תא הדמיה Cleaveable Fluorogenic-צבע מצעים בעקבות שלילת קוטביות אשלגן-Induced ממברנה

סרטון זה מתאר בדיקה מבוססת הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי למדידת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי בתאים בתרבית. הבדיקה משתמשת בצבע פלואורסצנטי רגיש לסידן Rhod-2/AM כדי למדוד את הסידן המיטוכונדריאלי בתאים בתרבית חדירה.

בדיקת זרימת סידן למדידת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי בתאים בתרבית

השוואה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בין דגימות מניבה מידע רב ערך על מצב התא. מתוארים שלבים מפורטים לבידוד מיטוכונדריה והערכת תגובה למעכבים ומנתקים באמצעות פלואורסצנטיות. השיטה והתועלת של פרוטוקול זה מומחשות על ידי שימוש בתרבית תאים ומודל בעלי חיים של מתח תאי.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

הומאוסטזיס סידן ברטיקולום אנדופלזמי מופרע בפתולוגיות מגוונות.  ניתן להשתמש במדווח חלבון ניטור סידן מופרש (SERCaMP) כדי לזהות שיבושים במאגר הסידן של ER.   פרוטוקול זה מתאר את השימוש ב-Gaussia luciferase SERCaMP לבחינת הומאוסטזיס סידן ER במבחנה וב-vivo.

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש<em&gt; Gaussia</em&gt; לוציפראז SERCaMP

המיטוכונדריה יכול לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (Δ Ψm) כדי לעקל סידן (Ca 2 +), המאפשר להם לעצב Ca cytosolic 2+ איתות בתוך התא. אנו מתארים שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca 2 + ו ΔΨ מ בתאים חיים באמצעות צבעי ניאון ו מיקרוסקופיה confocal.

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

פרוטוקול זה שואפת לתאר שיטה לבחון על Ca2 + שמירה קיבולת ו2 +Ca - עוררה מיטוכונדריאלי נפיחות של המיטוכונדריה מבודד של SH-SY5Y תאים צעד אחר צעד.

Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת Assay ו- Ca2 +-עוררה Assay נפיחות מיטוכונדריאלי

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט של יישום rhodamine 123 לזהות את מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית (MMP) וללמוד CLIC4 נוקאאוט-induced HN4 תא אפופטוזיס בתוך חוץ גופית. תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות נפוצות לייזר קונפוקלי סריקה קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, נרשם השינוי בזמן אמת של MMP.

זיהוי של המיטוכונדריה פוטנציאל ממברנה לימודים CLIC4 נוקאאוט-induced HN4 תא אפופטוזיס במבחנה

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים עבור המידה של Ca2 + זרם מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית. עבור המיטוכונדריה מבודד, אנחנו פירוט של צלחת המבוסס על הקורא Ca2 + ייבוא assay באמצעות של Ca2 + רגיש לצבוע סידן ירוק-5N. עבור תאים בתרבית, אנו מתארים שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות Ca2 + לצבוע רוד-2/AM.

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

פרוקטוקול זה נועד לספק שיטה במבחנה ובהדמיה של ויוו מיטוכונדריאלי Ca2+ באסטרוציטים ונוירונים.

הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2 + ספיגה אסטרוציטים ונוירונים באמצעות אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECIs)

פרוטוקול זה מתאר גישה לביצוע הדמיית סידן באורגנואידים של מעיים אנושיים נגועים בנגיף, ומציע גישה לניתוח.

הדמיית סידן חיה של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית

למדו לנטר שינויים דינמיים ברמות הסידן המיטוכונדריאלי בתאים חיים באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית ratiometric pericam-mt. שיטה זו מאפשרת מדידה בזמן אמת של תהליכי סידן מיטוכונדריאלי.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

גלה סרטונים נוספים