איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע במדויק את הרמות היחסיות של שינויים לאחר תרגום בתוך הכנות של נוקלאוזומים תאיים כוללים המתקבלים ממיליון תאים. זה מושג על ידי הכנת תרביות הומוגניות באיכות גבוהה של תאי יונקים. ואז מבודדים גרעינים מהתאים באמצעות שיבוש מכני עם דאונס, הומוגנייזר וצנטריפוגה.

השלב הבא הוא השגת נוקלאוזומים שלמים על ידי עיכול הכרומטין הקיים בתוך הגרעינים וביצוע סדרה של מיצוי היפוטוני. לבסוף, הנוקלאוזומים נחקרים באמצעות בדיקת ELIZA עם הבקרות המתאימות לזיהוי שינויים ספציפיים לאחר התרגום. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את הרמות היחסיות של שינויים ספציפיים הקיימים בדגימות נוקלאוזום.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו Western Blotting ו-Chromatin immunoprecipitation הוא שניתן לקבוע בקלות תמונה גלובלית של מספר מצבי שינוי נוקלאוזומים. השיטה הרבה יותר רגישה ומדויקת מהכתמים המערביים וניתן לבצע אותה ברוב המעבדות המצוידות לניסויים כלליים בביולוגיה מולקולרית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי הגזע והאפיגנטיקה, כגון מה קורה כאשר מתרחשים אירועי התמיינות ותכנות מחדש גדולים.

כדי להתחיל בהליך, ראשית מנסים להחזיר את התאים עם שלושה מיליליטר טריפסין לצלחת של 15 סנטימטר לתאים טריים. הוסף 20 מיליליטר בוטיראט PBS קר כקרח. העבירו את התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר וצנטריפוגה את הצינור כדי לאסוף את התאים ב-1000 סל"ד למשך חמש דקות, שאפו את הסופרנטנט והוסיפו 10 מיליליטר PBS בוטיראט קר כקרח כדי לשטוף את תרחיף התא שוב ב-1000 סל"ד למשך חמש דקות.

הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא בארבעה מיליליטר של מאגר ליזה עם מעכבי פרוטאז כמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, פיפטה את התאים להומוגניזטור מסוג A מסוג B על קרח למטה הומוגניזציה עם 20 פעימות. לאחר מכן העבירו את ההומוגנאט לצינור צנטריפוגה על קרח.

צנטריפוגה את הדגימה ב -2000 גרם למשך 10 דקות. בארבע מעלות צלזיוס. הסר את שם העל, המכיל את החומר הציטופלזמי והחייאה.

השעו את הגלולה בשני מיליליטר של מאגר כביסה קרה כקרח C עם מעכבי פרוטאז, שכבו בעדינות את החומר המרחף על כרית של חמישה מיליליטר, 30% סוכרוז בצינור צנטריפוגה קרה. כדי לבודד את צנטריפוגת הגרעינים ב-2,400 G למשך חמש דקות בדלי מתנדנד, גרעיני הרוטור ינדדו דרך הכרית ופסולת תאית תישאר בממשק. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את כל נפח הנוזל והשהה מחדש את הגרעינים ב -250 מיקרוליטר של מאגר שטיפה קרה כקרח C עם מעכבי פרוטאז, העביר את הגרעינים לצינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

כדי להתחיל בבידוד של נוקלאוזומים, הוסף שלושה מיקרוליטרים של 0.1 סידן כלורי מולרי לגרעינים והניח בגוש חום של 37 מעלות צלזיוס עד שהטמפרטורה מאוזנת. לאחר מכן מוסיפים שתי יחידות של מיקרו נוקלאז ב-10 מיקרוליטר של מיקרו-קוקל נוקלאז, חוצצים ודוגרים למשך 12 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. מערבבים לעתים קרובות עם קצה פיפטה.

לאחר הדגירה, עצרו את התגובה עם שישה מיקרוליטרים של 0.5 נתרן מולארי E-D-T-A-P-H שמונה, והניחו על קרח להתקרר. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב-2000 גרם למשך ארבע דקות לאחר צנטריפוגה, השליכו את החטיפה והשעו מחדש את הגלולה. ב-300 מיקרוליטר של 0.2 מילימול או נתרן EDTA, דגרו את הדגימה על קרח למשך שעה אחת עם פיפטינג עדין מדי פעם לערבוב.

לאחר צנטריפוגה ב -3000 גרם למשך ארבע דקות. בארבע מעלות צלזיוס, אספו את הסופרנטנט, המכיל את הנוקלאוזומים החופשיים בצינור פוגה חדש ואחסנו על קרח נוקלאוזומים נוספים מכוונים. השעו את הגלולה ב-300 מיקרוליטר של 0.2 מילימול או נתרן EDT כמו קודם ודגרו על קרח למשך שעה עם ערבוב עדין מדי פעם.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימה. שוב, שלב את החטיפה המתקבלת עם הדגימה שנותרה בצינור המיקרו פוגה על הקרח. כדי להתחיל את בדיקת הנוקלאוזום אלייזה טען צלחת אלייזה של 96 בארות עם סדרה יורדת של חמישה דילול סדרתי כפול של נוקלאוזומים ומאגר ציפוי, החל מ-0.1 מיקרוגרם לכל 50 מיקרוליטר בבאר העליונה יש לטעון את כל סדרות הדילול בשלוש עותקים.

זכור לכלול בארות עם מאגר ציפוי רק כבקרות. דגרו את הצלחת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת. השתמש במכונת כביסה כדי לשטוף את הצלחות עם 200 מיקרוליטר לבאר של 0.5%בין 20 ב-PBS בטמפרטורת החדר ארבע פעמים למשך 10 דקות בסך הכל

כעת הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של תמיסת חסימה ודגר למשך שעה בטמפרטורת החדר על מסובב. לאחר הדגירה, הסר את המאגר החוסם על ידי ניעור הצלחת ההפוכה במהירות מעל כיור. לאחר מכן, הוסף את הנוגדן הראשוני המדולל בנפח של 50 מיקרוליטר לבאר בתמיסה של 5% PSA ב-0.05% בין 20 ב-PBS דגרו את התמיסה למשך שעה אחת על מסובב בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה הראשונית של הנוגדנים, שטפו את הצלחות כמו לפני השימוש במכונת הכביסה של הצלחות. לאחר השלמת הליך השטיפה, הוסף 50 מיקרוליטר לבאר של נוגדן משני מצומד חזרת פרוקסידאז מדולל ב-PBS עם 5% BS, A ו-0.5%20 בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת על מסובב לאחר דגירה משנית של נוגדנים. שוטפים את הצלחות כמו קודם.

שימוש במכונת הכביסה לפיתוח הצלחת. מוסיפים 50 מיקרוליטר של מצע TMB Eliza לכל באר ודוגרים למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, הבארות של לוח ELIZA יהפכו לכחולות והעוצמה פרופורציונלית לכמות השינויים בנוקלאוזומים הקיימים בכל אחד מהם.

ובכן, אז תפסיקו את התגובה. על ידי הוספת 50 מיקרוליטר לבאר של שתי חומצות גופרתית רגילות. הצבע ישתנה לצנטריפוגה חומה של הצלחת ב-1500 סל"ד למשך שתי דקות כדי לפזר בועות אוויר.

הלוח מוכן כעת לכימות בקורא לוחות מטרי צבעוני. לבסוף, קרא את הלוח ב-450 ננומטר וייצא את התוצאות לניתוח. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי לאחר פיתוחה.

טכניקה זו פתחה את הדלת לחוקרים בתחום חקר תאי הגזע לחקור תגובות אפיגנטיות להתמיינות ותכנות מחדש של אירועים ברמת האפי פרוטאום כולו.