Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הליך פשוט להערכת השפע היחסי של שינויים לאחר תרגום היסטון, הממלאים תפקידים חיוניים בביולוגיה של כרומטין, כגון ויסות ביטוי גנים ועיבוי כרומוזומים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הכרומטינים. כגון, אילו שינויים בהיסטון משנים את השפע היחסי שלהם בגירוי או טיפול בתאים או ברקמות נתונות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שעל ידי שימוש בפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה, אנו יכולים לכמת בו זמנית את רוב ה-PTMs הידועים על חלבונים ידועים בניתוח יחיד. לניתוח שינויים בהיסטון יש יישומים רבים, כולל הערכת שינויים אפיגנטיים ופעולת כרומטין של אנשים או מערכת מודל בעת טיפול תרופתי או לחץ. בנוסף לסימון, שני חברים נוספים במעבדה שלי ידגימו את הנהלים של פרוטוקול זה.

נטרג'אן בהאנו, מומחה מחקר, וקלי קארץ', סטודנטית לתואר שני. כפי שמוצג בזרימת עבודה זו, זהו פרוטוקול בן 10 שלבים הכולל טיהור היסטון מתרביות תאים או רקמות, נגזרת היסטון, עיכול והתפלה, וניתוח ספקטרומטריית מסה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ננו-זרימה. רק נהלים נבחרים יודגמו בסרטון זה.

כדי להתחיל בהליך בידוד גרעינים מתאים שלמים, יש להפשיר על קרח, תאים שנקטפו בעבר ואוחסנו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. והכינו את מאגר הבידוד הגרעיני, או NIB, כמתואר בטקסט הפרוטוקול. הסר נפח חמישי של NIB והוסף NP-40 חלופה לריכוז סופי של 0.2%הנפח הנותר ישמש לשטיפות.

שטפו את גלולת התא עם NIB ללא חלופת NP-40, תוך שימוש ביחס של 1:10 בין נפח גלולת התא לנפח המאגר. צנטריפוגה ב 700 RCF למשך חמש דקות והסר את הסופרנטנט. יש להניח את כדור התא על ידי הנחתו על קרח והוספת NIB עם חלופה של 0.2% NP-40 ביחס של 1:10 בין נפח כדור התא לנפח המאגר.

הומוגניזציה של התאים על ידי פיפטינג עדין. דגרו את התאים ההומוגניים על הקרח למשך חמש עד 10 דקות כדי שהתאים יעשו ליזה וישחררו את הגרעינים. צנטריפוגה ב-1000 RCF למשך חמש עד 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הגלולה תכיל בעיקר גרעיני תאים, בעוד שהסופרנטנט יכיל בעיקר רכיבים ציטופלזמיים. שמור את השבר הציטופלזמי אם תרצה. שטפו את גלולת הגרעינים על ידי השעיה מחדש בעדינות של NIB ללא חלופת NP-40, תוך שימוש ביחס של 1:10 בין נפח הגלולה לנפח המאגר.

צנטריפוגה ב-1000 RCF למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, והסר את הסופרנטנט. לאחר שהחלופה NP-40 הוסרה לחלוטין מגלולת הגרעין, הוסף חומצה גופרתית מולרית 0.2 קרה כקרח ביחס של 1:5 בין נפח הגרעינים לנפח החומצה הגופרתית. השעו מחדש את הגרעינים בחומצה הגופרתית על ידי פיפטינג עדין.

דגרו את הדגימה בסיבוב קבוע, או ניעור עדין במשך שעתיים עד ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה של הדגימה ב-3400 RCF בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. שוב צנטריפוגה והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש כדי להסיר כל חומר בלתי מסיס.

כדי לזרז את ההיסטונים, הוסף חומצה טריכלורואצטית צוננת, 100%, או TCA, לסופרנטנט שנאסף ביחס נפח של 1:3. נוכחותם של היסטונים מסומנת על ידי הדגימה שהופכת מעוננת. מערבבים על ידי היפוך הצינור כמה פעמים.

דגרו את התערובת על קרח למשך שעה לפחות. צנטריפוגה ב-3400 RCF למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, ההיסטונים יצפו את דפנות הצינור וגם ישקעו בתחתית.

כדור לבן ובלתי מסיס ייווצר גם בתחתית הצינור, המכיל בעיקר חלבונים שאינם היסטונים ומולקולות ביולוגיות אחרות. הסר בזהירות את הסופרנטנט על ידי שאיפה, מבלי לגרד את דפנות הצינור, או את הגלולה בתחתית הצינור. על ידי שימוש בפיפטה פסטר מזכוכית, שטפו את הצינור ב-100% אצטון קר כקרח בתוספת 0.1% חומצה הידרוכלורית, כדי לכסות את החלבונים המשקעים המצפים את הדפנות והתחתית.

צנטריפוגה ב 3400 RCF למשך שתי דקות. שאפו את הסופרנטנט בזהירות, מבלי לגרד את הדפנות או את הגלולה. שוטפים את הצינור עם אצטון קר כקרח, צנטריפוגה שוב ומסירים את הסופרנטנט מבלי לגרד את הדפנות או את הגלולה.

לאחר מכן, כימות היסטון וניתוח טוהר מתבצעים כמתואר בטקסט הפרוטוקול. ניתן לבצע פיצול אופציונלי של גרסאות היסטון על ידי HPLC בשלב הפוך לפני נגזרת היסטון. התחל הליך זה על ידי המסת דגימות ההיסטון ב-40 מיקרוליטר של אמוניום ביקרבונט 50 מילי-מולרי, pH 8.0.

בדוק את ה-pH על ידי הכנסת קצה פיפטה P10 לתוך הדגימה ללא שאיפה, ונגיעה בקצה הפיפטה ברצועת מחוון pH. השתמש באמוניום הידרוקסיד וחומצה פורמית כדי להתאים את ה-pH ל-8.0. מכאן ואילך, כל השלבים הכרוכים בשימוש באנהידריד פרופיוני חייבים להתבצע במכסה אדים.

עבד מקסימום שלוש עד ארבע דגימות בכל פעם, על מנת לשמור על תגובת אנהידריד פרופיונית. הכן מגיב פרופיונילציה טרי על ידי ערבוב אנהידריד פרופיוני עם אצטוניטריל במנת נפח של 1:3. הוסף את מגיב הפרופיונילציה לכל דגימה ביחס נפח של 1:4.

הוסף במהירות אמוניום הידרוקסיד כדי לבסס מחדש pH 8.0 לתמיסה. בדרך כלל, הוספת אמוניום הידרוקסיד לדגימה עם יחס נפח של 1:5 מתאימה כדי לבסס מחדש pH 8.0. מערבבים מיד על ידי מערבולת.

בדוק את ה-pH. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר שכל הדגימות עברו פרופיונילציה, יבש את הדגימות עד 10 עד 20 מיקרוליטר ברכז ואקום.

השעו מחדש או דללו דגימות עם ddH20 עד להשגת 40 מיקרוליטר של נפח סופי. מכיוון שמלחים מעכבים כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה, יש להתפלם את הדגימות לפני הניתוח. למטרות סרטון זה תוצג רק בניית קצות הבמה.

השתמש בקצה פיפטה P1000 כדי לנקב דיסק של חומר C18 מדיסק חילוץ פאזה מוצק. השתמש בנימי סיליקה התמזגו כדי לדחוף את המיני-דיסק החוצה מקצה ה-P1000 לתחתית קצה הפיפטה P100 או P200. ודא שהדיסק תקוע היטב בתחתית הקצה.

אם מתפללים מעל 25 מיקרוגרם של דגימה, השתמש בשני מיני-דיסקים C18 באותו קצה P100 או P200. השתמש במתאם צנטריפוגה כדי להחזיק את קצות הבמה במקומם בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 או שניים מיליליטר. שטוף את השרף על ידי סיבוב עם 50 מיקרוליטר של 100% אצטוניטריל כדי להפעיל את חומר C18 ולהסיר מזהמים פוטנציאליים.

לאחר מכן מתבצעת התפלת דגימה כמתואר בטקסט הפרוטוקול. פפטידים של היסטון קיימים במגוון צורות איזובריות. מוצגות שתי דוגמאות הנפוצות בדרך כלל בניתוח היסטונים.

כרומטוגרמת היונים שחולצה של מסת המבשר והאיזוטופים היחסיים שלהם, המוצגת לעיל, זהה. עם זאת, כרומטוגרמת היונים המופקת של יוני המוצר, המוצגת להלן, מאפשרת אפליה של שתי הצורות האיזובריות. יש להשתמש רק ביוני שברים ייחודיים, המודגשים באדום, כדי להעריך את השפע היחסי של שני המינים.

היסטונים שהופקו מתאי גזע עובריים אנושיים, עם ובלי גירוי חומצה רטינואית, נותחו. כימות יחסי של שני פפטידים של היסטון H3 חשף הפחתה ברורה של אצטילציה בתאי גזע עובריים אנושיים, מגורה להתמיינות. זה עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים על אצטילציה גבוהה יותר בתאי גזע עובריים, בהשוואה לתאים מתמיינים .

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים אם היא מבוצעת כראוי. יום אחד למיצוי היסטון, היום השני לגזירת חלבון ועיכול והיום השלישי לגזירת פפטידים, הטיית שלב וניתוח LC-MS. ניתן לנצל את טיהור ההיסטון למטרות אחרות מלבד ניתוח פפטידים, כולל פרוטאומיקה מאמצע למטה ומלמעלה למטה, שם ניתן ליצור שרקטריות של שינויים בהיסטון קומבינטורי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות ולכמת שינוי פוסט-תרגומי של היסטון באמצעות פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה.