Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים
17 במאי 2016
פרוטוקול זה מתאר עבודה משולבת במלואם לאפיון היסטון שלאחר translational שינויים באמצעות ספקטרומטריית מסה (MS). זרימת העבודה כוללת טיהור היסטון מן בתרביות תאים או רקמות, היסטון derivatization ועיכול, ניתוח MS באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ננו זרימה והוראות לניתוח נתונים. הפרוטוקול מיועד להשלמה בתוך 2 - 3 ימים.
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק הליך פשוט להערכת השפעיות היחסיות של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות של היסטונים, הממלאות תפקידים חיוניים בביולוגיה של הכרומטין, כגון ויסות ביטוי גנים ועיבוי כרומוזומים. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הכרומטין, כגון אילו מודיפיקציות של היסטונים משנות את השפעיות היחסיות שלהן בעקבות גרייה או טיפול בתאים או ברקמות נתונים.
היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שבאמצעות פרוטאומיקה המבוססת על ספקטרומטריית מסות, אנו יכולים לכמת בו-זמנית את מרבית ה-PTMs המוכרים על חלבונים ידועים בניתוח אחד. לניתוח מודיפיקציות של היסטונים ישנם יישומים רבים, כולל הערכת שינויים אפיגנטיים ותפקוד הכרומטין של פרטים או מערכות מודל בעקבות טיפול תרופתי או סטרס. בנוסף לסימון (Simone), שני חברים נוספים מהמעבדה שלי ידגימו את הפרוצדורות של פרוטוקול זה.
נטאראג'ן בהנו, מומחה מחקר, וקלי קארץ', סטודנטית לתואר שני. כפי שמוצג בזרימה זו, זהו פרוטוקול בן 10 שלבים הכולל ניקוי היסטונים מתרביות תאים או מרקמות, נגזרת של היסטונים, עיכול והסרת מלחים, ואנליזה באמצעות ספקטרומטריית מסה תוך שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית בזרימה ננומטרית. רק הליכים נבחרים יודגמו בסרטון זה.
כדי להתחיל בהליך בידוד הגרעינים מתאים שלמים, הפשיר על קרח תאים שנאספו ואוחסנו בעבר בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. הכן את באפר בידוד הגרעינים (nuclear isolation buffer), או NIB, כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול. הסר חמישית מנפח ה-NIB והוסף NP-40 Alternative עד לריכוז סופי של 0.2%. ארבע חמישית מהנפח שנותר ישמש לשטיפות.
שטפו את משקע התאים ב-NIB ללא NP-40 Alternative, ביחס של 1:10 בין נפח משקע התאים לנפח התמיסר (buffer). סבבו במרכז centrifuge ב-700 RCF למשך חמש דקות והסירו את הנוזל העליון (supernatant). פתחו (Lyse) את משקע התאים על ידי הנחתו על קרח והוספת NIB עם 0.2% NP-40 Alternative ביחס של 1:10 בין נפח משקע התאים לנפח התמיסר.
הומוגנז את התאים על ידי פיפטינג עדין. דגרי את התאים ההומוגנזיים על קרח למשך חמש עד 10 דקות כדי לאפשר לתאים להתפרק ולשחרר את הגרעינים. סבב במרכזפוגה ב-1000 RCF למשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
המשקע יכיל בעיקר גרעיני תאים, בעוד שהנוזל העליון יכיל בעיקר רכיבים ציטופלזמיים. שמרו את הפראקציה הציטופלזמית במידת הצורך. שטפו את משקע הגרעינים על ידי ריסוף עדין ב-NIB ללא NP-40 Alternative, תוך שימוש ביחס של 1:10 בין נפח המשקע לנפח הבופר.
סנטריפוגה ב-1000 RCF למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, והסר את העלייה (supernatant). לאחר הסרה מלאה של NP-40 Alternative ממשקע הגרעינים, הוסף חומצה גופרית 0.2 molar קרה מאוד, ביחס של 1:5 בין נפח הגרעינים לנפח חומצה הגופרית. השהה מחדש את הגרעינים בחומצה הגופרית באמצעות פיפוט עדין.
דגרו את הדגימה בסבוב קבוע, או בניעור עדין, למשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-3400 RCF בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות והעבירו את תסמיכי העל (supernatant) למבחנה חדשה. סובבו שוב בצנטריפוגה והעבירו את תסמיכי העל למבחנה חדשה כדי להסיר חומרים בלתי מסיסים.
כדי להשקיע את ההיסטונים, הוסיפו חומצה טריכלורואצטית (trichloroacetic acid), או TCA, בריכוז 100% ומקוררת, לנוזל העל (supernatent) שנאסף ביחס נפחי של 1:3. נוכחותם של היסטונים תתבטא בעקירויות של הדגימה. ערבבו על ידי היפוך הפרונטה מספר פעמים.
דגרו את התערובת על קרח למשך שעה אחת לפחות. סבבו בצנטריפוגה ב-3400 RCF למשך חמש דקות. לאחר הסבוב בצנטריפוגה, ההיסטונים יצפו את דפנות המבחנה וישקעו גם בתחתיתה.
משקע לבן שאינו מסיס ייווצר גם בתחתית השפופית, המכיל בעיקר חלבוני non-histone ומולקולות ביולוגיות אחרות. הסר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות שאיבה, ללא גירוד של דפנות השפופית או של המשקע בתחתיתה. באמצעות פיפט פסטור מזכוכית, שטוף את השפופית עם 100% acetone קר מאוד בתוספת 0.1% hydrochloric acid, באופן שיכסה את החלבונים שהשקיעו על הדפנות ובתחתית.
סובב במערך צנטריפוגה ב-3400 RCF למשך שתי דקות. שאב את הנוזל העליון (supernatant) בזהירות, מבלי לגרד את הדפנות או את המשקע (pellet). שטוף את המבחנה ב-100% אצטון קר במיוחד, סובב שוב בצנטריפוגה, והסר את הנוזל העליון מבלי לגרד את הדפנות או את המשקע.
בהמשך, בוצעו כימות ההיסטונים ואנליזה של הטוהר כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול. ניתן לבצע גם הפרדה אופציונלית של וריאנטים של היסטונים באמצעות HPLC פאזה הפוכה לפני נגזרת ההיסטונים. התחילו הליך זה על ידי המסה של דגימות ההיסטון ב-40 µL של 50 mM ammonium bicarbonate, pH 8.0.
בדוק את ה-pH על ידי הכנסת טיפ של פיפט P10 אל תוך הדגימה ללא שאיבה, ומגע של טיפ הפיפט בפס רמת pH. השתמש באמוניום הידרוקסיד ובחומצה פורמית כדי לכוון את ה-pH ל-8.0. מהשלב הזה והלאה, כל השלבים הכוללים שימוש ב-propionic anhydride חייבים להתבצע במנדף כימיים.
עבדו מקסימום שלושה עד ארבעה דגימות בבת אחת, כדי לשמור על הריאקטיביות של האנהידריד פרופיוני. הכינו ריאגנט פרופיונילאציה טרי על ידי ערבוב של אנהידריד פרופיוני עם אצטוניטריל ביחס נפחים של 1:3. הוסיפו את ריאגנט הפרופיונילאציה לכל דגימה ביחס נפחים של 1:4.
הוסיפו במהירות 암מוניום הידרוקסיד כדי להחזיר את ה-pH של התמיסה ל-8.0. בדרך כלל, הוספה של 암מוניום הידרוקסיד לדגימה ביחס נפחים של 1:5 היא מתאימה להחזרת ה-pH ל-8.0. ערבבו מיד באמצעות וורטקס (vortexing).
בדקו את ה-pH. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר שכל הדגימות עברו פרופיוניליציה (propionylation), ייבשו את הדגימות לנפח של 10 עד 20 microliters במרכז רכוז בוואקום.
יש להחזיר לסביבה נוזלית או לדלל את הדגימות ב-ddH20 עד להגעה לנפח סופי של 40 microliters. מכיוון שמלחים מעכבים כרומטוגרפיה נוזלית ומספקטרומטריית מסות, יש להסיר מלחים מהדגימות לפני הניתוח. לצורך סרטון זה, יודגם רק תהליך בניית ה-stage-tips.
השתמשו בטיפ פ pipette מסוג P1000 כדי להוציא דיסק של חומר C18 מדיסק לסמיכה במצב מוצק (solid phase extraction disk). השתמשו בנימים של סיליקה מותכת (fused silica capillary) כדי לדחוף את המיני-דיסק מתוך טיפ ה-P1000 ואל תוך תחתיתו של טיפ pipette מסוג P100 או P200. ודאו שהדיסק תקוע בצורה מאובטחת בתחתית הטיפ.
במידה ומבצעים הסמכה (desalting) ליותר מ-25 micrograms של דגימה, השתמשו בשתי דיסקיות C18 מיני באותו טיפ P100 או P200. השתמשו במתאם לצנטריפוגה כדי להחזיק את ה-stage-tips במקומם בתוך מבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 או 2 milliliter. שטפו את הסורבן על ידי סבב עם 50 microliters של 100% acetonitrile כדי להפעיל את חומר ה-C18 ולהסיר מזהמים פוטנציאליים.
בשלב הבא מבוצע התפסלה של הדגימה כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול. פפטידים של היסטון מופיעים במגוון של צורות איזובריות. מוצגות כאן שתי דוגמאות הנפוצות בדרך כלל בניתוח היסטונים.
כרומטוגרמת היונים המופקת של המסה המקדימה (precursor mass) והאיזוטופים היחסיים שלהם, המוצגת למעלה, היא זהה. עם זאת, כרומטוגרמת היונים המופקת של יוני התוצר, המוצגת למטה, מאפשרת הבחנה בין שתי הצורות האיזובאריות. יש להשתמש רק ביוני שבירה ייחודיים, המסומנים באדום, כדי להעריך את השפע היחסי של שני המינים.
בוצע ניתוח של היסטונים שחולצו מתאי גזע עובריים אנושיים, עם ובלי גרייה בחומצה רטינואית. כימות יחסי של שני פפטידים של היסטון H3 העלה הפחתה ברורה של האצטילציה בתאי גזע עובריים אנושיים שעברו גרייה להבדלה. ממצא זה עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים על רמות אצטילציה גבוהות יותר בתאי גזע עובריים, בהשוואה לתאים בתהליך הבדלה.
לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים אותה בתוך שלושה ימים בביצוע נכון. יום אחד להפקת היסטונים, היום השני לדרביטציה ועיכול של חלבונים, והיום השלישי לדרביטציה של פפטידים, stage-tipping ואנליזה באמצעות LC-MS. ניתן להשתמש בטיהור היסטונים למטרות אחרות מעבר לאנליזה של פפטידים, כולל פרוטאומיקה מסוג middle-down ו-top-down, שבהן ניתן לאפיין מודיפיקציות קומבינטוריים של היסטונים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות ולכמת מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות של היסטונים באמצעות פרוטאומיקה המבוססת על ספקטרומטריית מסות.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה מקיפה לאפיון מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות של היסטונים באמצעות ספקטרומטריית מסות. הוא כולל שלבים לניקוי היסטונים, דריבטיזציה, עיכול ואנליזה, שנועדו להסתיים תוך 2-3 ימים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של כרומטין
- מודיפיקציות של היסטונים
- ספקטרומטריה של מסות
רקע
- מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות של היסטונים הן קריטיות לוויסות ביטוי גנים.
- הבנת מודיפיקציות אלו יכולה לחשוף תובנות לגבי דינמיקת הכרומטין.
- שיטה זו מאפשרת כימות סימולטני של מספר PTMs.
- היישומים כוללים חקר שינויים אפיגנטיים בתגובה לטיפולים.
מטרת המחקר
- להערכת השפעיות היחסיות של מודיפיקציות היסטונוים.
- לבחינת שינויים במודיפיקציות היסטונוים בעקבות גרייה תאית.
- לספק שיטה מהימנה לניתוח היסטונוים בהקשרים ביולוגיים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טיהור היסטונים מתרביות תאים או מרקמות.
- נגזרת ועיכול של היסטונים.
- ניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסות תוך שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית בזרימה ננומטרית.
- ניתוח נתונים לכימות מודיפיקציות של היסטונים.
תוצאות עיקריות
- בידוד וכמתו של מודיפיקציות היסטון באופן מוצלח.
- הדגמת זרימת העבודה על ידי חברי המעבדה.
- תובנות לגבי הדינמיקה של מודיפיקציות היסטון תחת תנאים שונים.
- יישומים פוטנציאליים במחקרי ביולוגיה של כרומטין ואפיגנטיקה.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה חסונה לניתוח מודיפיקציות של היסטונים.
- ספקטרומטריית מסות מאפשרת פרופיל מקיף של PTMs.
- ניתן להתאים את זרימת העבודה לתנאים ניסיוניים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח כמותי של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות (PTMs) של היסטונים באמצעות ספקטרומטריית מסות בגישת bottom-up נותן מענה לצורך קריטי באפיון אפיגנטי בלתי מוטה ובעוצמה גבוהה בשלבי הגילוי של מחקר ופיתוח בביופארמה. זרימה זו של עבודה מאפשרת מדידה סימולטנית של PTMs ווריאנטים מגוונים של היסטונים, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים ובהגברת הביטחון החזוי בתוכניות טיפוליות המכוונות לכרומטין. שילוב של גישה זו משפר את קבלת ההחלטות לגבי תיקי הפיתוח על ידי אספקת נתונים חסונים וניתנים להרחבה על שינויים במצב הכרומטין בתגובה להתערבויות של מועמדים תרופתיים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מקיפה של מנגנוני בקרה של כרומטין באמצעות כימות Multiplexed של PTM.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי חשיפת הדינמיקה של PTM בעקבות גרייה תאית או טיפול בתרכובות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין השפעות אפיגנטיות ישירות לבין שינויים משניים.
- משפר את רמת הביטחון החיזויית בבחירה וסריקה של מטרות למודולציה של כרומטין.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק קריאות כמותיות ומאומתות של שכיחות PTM של היסטונים תחת תנאים מרובים.
- מאפשר סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה על ידי מזעור הטיות מבוססות נוגדנים ומסוות אפיתופים.
- תומך במוכנות לסריקה בהספק גבוה עבור ספריות של מודולטורים אפיגנטיים.
- מספק נתונים ניתנים להרחבה ותואמי פלטפורמה להערכת תרכובות בשלבים הבאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים את הכימות של סמנים אפיגנטיים למצבים של כרומטין הרלוונטיים למחלה במודלים פרה-קליניים.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אפשור מדידה ישירה של שינויי PTM בתגובה לטיפול.
- תומך בקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון על בסיס פרופילים כמותיים של מודיפיקציות בכרומטין.
- מספק תובנה מכניסטית לגבי עיצוב מחדש של הכרומטין המושרה על ידי תרופות, הרלוונטי להתקדמות המחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
סבב עבודה זה, המבוסס על ספקטרומטריית מסות, משלב שלבים החל מגילוי ראשוני, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד למחקר פרה-קליני, ובכך מאפשר ביצוע פרופיל אפיגנטי רב-עוצמה בנקודות תפנית מרכזיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי כימות שינויים ב-PTM תחת הפרעות מוגדרות.
- סריקה: מספקת מדידות PTM כמותיות וניתנות לשחזור, המתאימות לפיתוח בדיקות ולסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת פלטי נתונים רב-ערוציים (multiplexed) ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מאפשרת התאמה של סמנים ביולוגיים למצב הכרומטין עם מודלים של מחלות ותגובה טיפולית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה למחקרי אפיגנטיקה שוטפים לאורך תוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בגילוי המכוון לכרומטין.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של כימות PTM, שיפור השחזוריות ותמיכה ביכולת הרחבה לסריקות רב-דגימתיות (high-throughput).
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות "המשך/עצור" (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים אפיגנטיים חסונים בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים וקידום של מועמדים תרפויטיים למודולציה של כרומטין.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות ובביולוגיה של כרומטין.
- מחייב גישה למכשור nano-LC-MS ותשתית מתקדמת לניתוח נתונים.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת דגימות ופירוש נתונים.
- ניתן להתאמה לסוגי תאים ורקמות שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור מערכות ביולוגיות ספציפיות.
- ספיקת הדגימות ומורכבות הנתונים עלולות להגביל שימוש שגרתי בסביבות עם משאבים מוגבלים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Isolation of Nuclei from Intact Cells
3:18
Extraction and Purification of Histones from Nuclei
5:53
Chemical Derivatization of Histones Using Propionic Anhydride for Bottom-up Analysis
7:43
Sample Desalting with Stage-tips
8:59
Results: Characterization of Histone Post-translational Modifications
10:10
Conclusion
