הסיליקון מיקרוצ'יפים עבור מניפולציה Cell-cell אינטראקציה

היי, אני אליוט הו.אני פוסט-דוקטורנט במעבדה של טיה כאן במכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס. היום אנחנו הולכים להכין תרביות תאים על שבבים מיקרו-מכניים מסיליקון. המכשירים נראים כמו מסרקים קטנים שננעלים יחד והם מאפשרים לנו לתמרן במדויק את האינטראקציות בין שתי אוכלוסיות שונות של תאים.

היום אנו הולכים לחקור את האינטראקציה בין הפטוציטים בכבד לתאי סטרומה תומכים. באופן ספציפי שלושה תאי T שלושה פיברובלסטים מתורבתים על המשטח העליון של המסרקים, כך שעל ידי הזזת אצבעות המסרק, אתה יכול להזיז את התאים ולשנות את הסידור המרחבי שלהם. כל מכשיר מחולק לשני חלקים הנצמדים יחד בשתי תצורות אפשריות.

הראשון מביא את שתי אוכלוסיות התאים למגע זו עם זו. השני מפריד מעט בין שתי האוכלוסיות כך שהתאים לא יכולים לגעת. כאן, אינטראקציות מגע נמנעות, אך אינטראקציות באמצעות גורמים מופרשים נשמרות.

נתחיל לדבר על איך לטפל בחלקים עם פינצטה. אני אוהב להשתמש גם בפינצטה טפלון גדולה יותר וגם בפינצטה מתכתית עגולה קטנה יותר. עם הפינצטה הגדולה יותר, אתה יכול להרים את החלקים בקצוות ככה עם החלקים הגדולים יותר עם הזרועות, אתה צריך להיזהר לא לשבור את הזרועות כי הן מאוד שבריריות.

אז אתה רוצה להרים אותם בחלק האחורי של החלק ככה. בעזרת פינצטת המתכת תוכלו להושיט יד לתוך החור ולהרים את הצ'יפס ישירות. החלקים הגדולים יותר יתאימו לקיר של צלחת 12 בארות, ואילו החלקים הקטנים יותר יתאימו לצלחת 24 בארות או שניתן לשלב אותם עם החלק הגדול יותר.

בצלחת 12 בארות, בדרך כלל אני משתמש בפינצטה המתכתית. כשאני מטפל בחלקים בצלחות כדי להצמיד שני חלקים יחד, בדרך כלל אני מכניס תחילה את החלק הגדול יותר לבאר ודוחף אותו עד הסוף לצד אחד. ואז אני לוקח את התיקון המשלים ומניח אותו בצד השני של הבאר, ודחפתי אותם יחד על ידי הכנסת שתי פינצטה אחת לכל חור.

אז עכשיו אני יכול פשוט לנעול את החלקים יחד, בתצורת הפער או בתצורת המגע. אם אני רוצה לפרק את החלקים, אני אוהב למשוך את החלקים לתצורת הפער ואז למשוך אנכית כדי להסיר את החלק. כעת המכשירים עשויים מסיליקון, ולכן הם צריכים להיות מצופים כדי לאפשר הידבקות תאים תקינה.

סביר להניח שתקבלו את המכשירים שכבר מצופים בפוליסטירן ופלזמה שטופלו, אז נניח שזו נקודת ההתחלה שלנו. קודם כל, נשתמש בקולגן כדי לצפות את פני השטח שאליו יתחברו הפטוציטים. אנחנו הולכים לשים את מסרקי ההפטוציטים בקולגן של 50 מיקרוגרם לטחנה, תמיסה אחת, ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.

מסרקי הפיברובלסטים לעומת זאת, אנחנו לא צריכים לצפות. לאחר הדגירה אנו שואבים את תמיסת הקולגן ושוטפים ומשקים. כעת אנו הולכים לנעול את ה- ES יחד במגע עם חלקים משלימים כך שניצור משטח שטוח לזריעת תאים.

ראשית, נמלא כמה בארות ב-70% אתנול. אני אשים זוג בכל באר ואז אנעל אותם יחד. אחרי שננעלו יחד, אנו רוצים להסתכל על החלקים שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שיש קו-מישוריים.

מדי פעם החלקים יכולים להינעל זה בצורה לא מיושרת. ובמיקרוסקופ תראו שהם נמצאים בשני מישורי מוקד שונים. במקרה זה, פשוט הפרד את החלקים ודחף אותם בחזרה לאחר שבדקנו שהיישור תקין, אנו נותנים לחלקים לשבת באתנול לזמן מה כדי לעקר.

לעתים קרובות אני ממהר, אז אני פשוט משרה במשך 10 דקות. לאחר העיקור, עלינו לשטוף. האתנול שואב היטב ושוטף במים, ואז שואף ושוטף שוב במים, ולבסוף שואב את המים ומחליף באמצעי התרבות שלך.

עכשיו בואו נזרע תאים על המכשירים. בדרך כלל, אנו משעים את התאים בריכוז של 500,000 תאים למיליליטר, ואנו מפזרים תרחיף מיליליטר אחד על כל זוג מסרק באמצעות צלחת של 12 בארות. אז זרענו את הפיברובלסטים ב-500,000 תאים למיליליטר בשתיים מהבארות.

באופן דומה, לקחנו תרחיף של 500,000 הפטוציטים לבאר וזרענו אותם בשתי הבארות האחרות. כעת, לפני הדגירה, אנו הולכים לנער את התאים ביסודיות כדי לוודא שהם מפוזרים באופן שווה. ואני אוהב לנער שלוש פעמים אנכית, שלוש פעמים אופקית, ואז לחזור על זה שלוש פעמים.

לאחר הטלטול, אנחנו הולכים למקם אותו באינקובטור ואנחנו הולכים לתת לתאים לשבת במשך 15 דקות, ואז אנחנו הולכים לנער אותם שוב. לאחר ניעור כל 15 דקות במשך שעה, אנו הולכים לשאוב ממתלה התא ולשחק על תרחיף חדש של תאים. ואנחנו נחזור על זה עד שתהיה לנו שכבת תאים מתכנסת.

בדרך כלל עם פיברובלסטים, זה דורש מושב אחד או שניים. ועם הפטוציטים זה יכול לקחת שניים עד ארבעה מושבים. כדי לקבל חד-שכבת קונפלונט, התאים יושבים בצפיפות גבוהה למדי, רועדים, מבטיחים שהתאים מופצים באופן שווה.

לאחר הישיבה הראשונה נוצרת שכבה דלילה של תאים. שימו לב שתאים נצמדים רק לאצבעות שצופו בפוליסטירן וקולגן. לאחר זריעת תאים טריים ודגירה במשך שעה נוספת, שוב עם ניעור כל 15 דקות, שכבת התא נעשית צפופה יותר.

לאחר הזריעה השלישית, יש לנו צפיפות תאים טובה, וכעת אנו יכולים לעצור לאחר שהתאים נזרעו על המסרקים. אנו רוצים לתמרן את התאים לתצורת הניסוי הרצויה. המכשירים מופרדים כעת מהחלקים המשלימים שלהם ומודגרים למשך 24 שעות.

לאחר 24 שעות, התאים התפשטו ליצירת שכבה חד-שכבתית על פני המסרקים. עכשיו אנחנו רוצים ליצור תרבות משותפת. מסרק הפטוציטים ומסרק פיברובלסטים מועברים כעת לאותה באר וננעלים יחד בתצורה הראשונית הרצויה.

אם תרצה. לאחר פרק זמן מסוים, תוכל לשנות את התצורה. לדוגמה, אנו יכולים לעבור לתצורת הפער לאחר 18 שעות, חלקים ממוקמים באותו הדבר, נדחפים היטב זה לזה עד שמגיעים לתצורת הפער ואז נדחפים למגע בחזרה לתצורת הפער.

ועכשיו אנחנו הולכים להסיר מסרק אחד. מה שאנחנו הולכים לעשות עכשיו זה לעבור את התהליך של הסרת הציפוי הישן של פוליסטירן, ניקוי השבבים, ואז ללבוש ציפוי פוליסטירן חדש ולהכין אותו לתרבית תאים. שוב, על ידי הסרת ציפוי הפוליסטירן הישן ולבישת שכבה חדשה, אנו מבטיחים שאף אחד מההיסטוריה של הניסוי הקודם לא יפריע לניסוי חדש.

אז אחרי שסיימתם את הניסוי שלכם, הדבר הראשון שאתם רוצים לעשות הוא להלבין את התאים שלכם ואז לשטוף את המסרקים והמים. אז לפני שאתה מכניס את הצ'יפס לבוהן, אתה רוצה לוודא שהם יבשים לחלוטין. אז הנה לנו כמה מסרקים שפשוט השארתי לייבוש באוויר לזמן מה ובודק שהוא יבש לחלוטין.

אז עכשיו אנחנו הולכים לקחת קצת אצבעות ולהכניס אותו לרמקול הזכוכית הזה. הולך להשתמש כאן בפיפטת זכוכית כדי שלא נמיס אותה. ליל כל הקדושים ממיס פלסטיק, כך שאיננו יכולים להשתמש בפיפטה פוליסטירן טיפוסית.

אוקיי, זה בערך מספיק. ועכשיו פשוט ניקח כמה מהחלקים האלה, נניח אותם בתוך הבוהן, ואני הולך להפעיל את השייקר כדי לעורר ונכסה אותו בנייר אלומיניום כדי למנוע מהטולואן להתאדות. אז אחרי שעתיים, הטולואן היה צריך להמיס את רוב הפוליסטירן על המסרקים, ואנחנו יכולים פשוט לשלוף אותם ולייבש את המסרקים באוויר.

לאחר שטיפת ליל כל הקדושים, החלקים צריכים להיות נקיים יחסית מפוליסטירן וצריכים להיות נקיים יחסית. עם זאת, אנו צריכים שהחלקים יהיו נקיים במיוחד כדי ששכבת הפוליסטירן החדשה תיצור הידבקות טובה אם הם לא נקיים במיוחד. הפוליטי נוטה להתקלף באמצע הניסוי כאשר התאים מתחילים למשוך אותו.

אז מה שאנחנו הולכים לעשות עכשיו זה ניקוי חומצת פיראנה. הכנסתי את החלקים לרמקול זכוכית ואנחנו הולכים לחמם את זה. אז אנחנו הולכים לשים פלטה חמה.

וכאן יש לנו חומצה גופרתית ומי חמצן. אני הולך לשפוך תחילה את החומצה הגופרתית וכאן, לוודא שכל הצ'יפס טובל מתחת לנוזל. לפעמים יש להם נטייה לצוף.

וגם עכשיו כשאנחנו עובדים עם כימיקלים קורוזיביים למדי, וודאו שאתם לובשים את ציוד המגן הנכון. הנה. אני לובש כפפות ניטריל. עכשיו אנחנו הולכים לשפוך את מי החמצן לתוך החומצה ופשוט להיזהר כאן כי זו תגובה אקסותרמית.

אז אתם יכולים לראות שהוא מעשן קצת כשהוא מגיב, אבל אנחנו רוצים להוסיף קצת אנרגיה למערכת כדי להפוך אותה לתגובתית עוד יותר. אז עכשיו אנחנו הולכים לחמם אותו עד 120 מעלות צלזיוס בערך ב-20 מעלות עכשיו, כך שאתה יכול להיות סמוך ובטוח שכל שאריות תרבית התאים שלך הולכות להיות מנוקות לחלוטין מהשבבים שלך. אז בנקודה זו, אתה רוצה פשוט לתת לתגובה להתנהל במלוא מהלכה עד שכל מי החמצן נצרך.

ובשלב זה, התערובת תפסיק לבעבע. אז התגובה לוקחת בערך חצי שעה כדי לסיים את שלה. ואחרי שתפסיקו לראות את הבועות, תוכלו פשוט לכבות את הפלטה החמה ולתת לה להתקרר.

ואנחנו הולכים להעביר אותם למים של עקומת BAK. ושוב, ודא שאתה משתמש כאן בפינצטה טפלון, לא מתכת, ואתה יכול פשוט להרים אותם, להעביר אותם. אז עכשיו אנחנו פשוט הולכים לשטוף אותו תחת זרם קבוע של DDH שני O.אני בדרך כלל לוקח אותו ישר מהמיין ונשאיר אותו פועל לפחות 10 דקות כאן.

ועל ידי כך, אנו הולכים לשטוף את כל עקבות החומצה לאחר טחינה מתחת לזרם מים במשך 10 דקות. יש להסיר את החומצה מחדש מהשבבים, ואנחנו פשוט נאחסן אותם מתחת למים עד לזמן שבו נהיה מוכנים לצפות את הפוליסטירן 45,000 פוליסטירן במשקל מולקולרי שקיבלנו מסיגמא. ואנחנו הולכים לשקול כמות קטנה מזה כאן.

יש לנו 400 מיליגרם ואנחנו הולכים להמיס אותו בטולואן ב-100 מיליגרם למיליליטר. אז צריך לטפל בטולואן במכסה המנוע. והדבר השני הוא שמכיוון שאנחנו הולכים להשתמש בטולואן כדי להמיס פוליסטירן, אנחנו רוצים לוודא שאנחנו לא משתמשים בשום בגדי מעבדה שעשויים מפוליסטירן.

אז כאן אנחנו משתמשים בפוליפרופילן, חרוטי ופיפטה מזכוכית. אז מכיוון שיש לי 400 מיליגרם של פוליסטירן, אני הולך להכניס ארבעה מיליליטר של אצבעות, ועכשיו אנחנו הולכים לערבב אותו במשך חצי שעה עד שהפולי סטירין יתמוסס. אז עכשיו אנחנו פשוט הולכים לסובב את הצינור במהירות הנמוכה ביותר למשך כ-20 דקות עד חצי שעה.

אז אני הולך לחבר את הצינור למערבולות. אני לא צריך להחזיק אותו שם כל הזמן. לאחר 20 עד 30 דקות, יש להמיס את הפוליסטירן ואנחנו מוכנים לצפות אותו.

עכשיו אנחנו הולכים לסובב את הפוליסטירן במתקן שלנו. מקודד הספין שלנו נמצא במתקן חדר נקי. אז כאן אנחנו צריכים ללבוש כובע, משקפי מגן, חלוק, מגפונים וכפפות, אבל זה לא יכול להיות אותו הדבר במתקן שלך.

לפני שנשתמש בצ'אק הזה, אני רוצה להגן עליו מפני הפוליסטירן. אז אנחנו הולכים לכסות אותו בנייר אלומיניום, ואנחנו רוצים לגרום לזה להיות שטוח ככל האפשר לפני השטח כדי שהשבב יוכל לשבת צמוד למשטח. אנחנו הולכים לתקוע חור קטן ממש במרכז כדי שנוכל לשמור על ואקום על השבב.

קודן הספין מוגדר ל-2, 400 סל"ד ו-30 שניות. עכשיו אנחנו יכולים לקחת אחד מהשבבים שלנו, למקם אותו כך שמרכז השבב יכסה את החור, ואני הולך לכבות את הוואקום בהתחלה כשאני שם את הפוליסטירן, מפעיל את הוואקום ואז מתחיל את הסיבוב. אז עבור החלקים הקטנים יותר, אנחנו יכולים לשים קצת פחות מ-10 טיפות.

ולחלקים הגדולים יותר, זה לוקח קצת יותר מ -10 טיפות פוליסטירן. ואנחנו הולכים לסובב אותו במשך 30 שניות ב-2,400 סל"ד. עכשיו ניקח את הצ'יפס המצופה פולי סטירן ונכניס אותם לתנור בחום של 120 מעלות צלזיוס.זה מעל נקודת מעבר הזכוכית של הפוליסטירן.

אז זה הולך להזרים מחדש את פני השטח כדי להחליק אותו מעט, וזה גם הולך להתעבות ולהקשיח את הפלסטיק. אז בדרך כלל אני משאיר אותו בתנור למשך הלילה. זה כנראה לוקח לפחות כמה שעות עד שהתהליך מסתיים.

אז לאחר אפייה של לילה, הצ'יפס מוכן לטיפול בפלזמה. עכשיו אנחנו הולכים לחשוף את הפוליסטירן לפלזמת חמצן, וזה הולך לשנות את אנרגיית פני השטח כך שחלבונים ותאים ידבקו אליה טוב יותר. אז אנחנו פשוט הולכים להעמיס את השבבים לתוך תא הפלזמה ולשאוב אותם למטה לתוך ואקום.

הגדרה טובה לשימוש היא 200 מיל, סיור בוואקום ו-200 וואט הספק למשך דקה אחת תחת זרימת גז חמצן. עכשיו כשהמערכת נשאבת למטה, אנחנו הולכים להכניס את החמצן. אוקיי, עכשיו אנחנו יכולים להפעיל את מתח ה-RF, להכות בפלזמה למשך דקה אחת.

אז כשהפלזמה פועלת, היא למעשה זוהרת. זה כמו נורת פלורסנט. לאחר דקה אחת של חשיפה לפלזמה, אנו הולכים להחזיר את הלחץ במעלה האטמוספירה ונוכל לשלוף את החלקים החוצה.

כעת החלקים מוכנים לציפוי חלבון והזנת תאים. המטרה בתכנון המכשיר הזה הייתה שנוכל לתפעל את המיקרו-ארכיטקטורה של הרקמה בצורה דינמית. לכן הארגון המיקרו של הרקמה בגוף, במיוחד היכן שהתאים ממוקמים זה ביחס לזה, חשוב מאוד בקביעת התפקוד של כל תא מסוים בתרבית מעבדה.

עד לאחרונה, לא הצלחנו לעשות עבודה טובה בשכפול זה, אבל במהלך חמש או עשר השנים האחרונות, אנשים התחילו להיות מסוגלים למיקרו תאי דפוס על מצע תרבית רקמה, ובכך לשים תאים בדיוק היכן שאנחנו רוצים שיהיו בצלחת תרבית רקמה. ובכך הצלחנו לגלות כמה היבטים חשובים של הביולוגיה הבסיסית של אינטראקציות בין תאים בקנה מידה מיקרו. עכשיו, מה שלא הצלחנו לעשות עד עכשיו זה לעשות את זה באופן דינמי.

כלומר, לשנות את הארגון של תרבית תאים באמצע הניסוי שלך. וזה חשוב מכיוון שבגוף, כך שהרקמה אינה למעשה סביבה סטטית. יש לנו תאים שנעים ומתארגנים מחדש, במיוחד בריפוי פצעים או בהתפתחותם.

אבל אפילו באיבר נורמלי בהומאוסטזיס, יש הרבה דברים שזזים. ההיבט הטכני הקשה ביותר ללמידה הוא רק איך לאכול פיזית את החלקים. ובהתחלה כשאתה מתחיל לעבוד עם המערכת, אתה עלול להיבהל מכמה שבריריים החלקים או כמה קטנים הרגשות שאתה צריך להביע.

אבל אני חושב שאם אתה רק מתאמן עם זה קצת זמן, לא אמורה להיות לך יותר מדי בעיות. חלק מהמקומות שבהם אנו רואים שלמכשיר זה יש תפקיד, למשל, בהתפתחות העוברית, תאים יבואו במגע עם סדרה של סביבות תאים שונות כאשר התאים נובטים דרך שכבות עובריות שונות. וידוע שהאינטראקציות עם כל אחת מהשכבות כשהן באות במגע ברצף, דוחפות את כולנו הלאה לאורך נתיב התמיינות מסוים.

ולכן אנו חושבים שסוג זה של מכשיר עשוי להיות טוב לניסיון לשכפל אירוע מסוג זה במעבדה. אחד ההיבטים של מיקרו-ארגון שרצינו במיוחד לבחון היה ההבדל בין תאים המתקשרים באמצעות אינטראקציות מגע שבהן קרומי התאים יכולים לגעת זה בזה, לעומת גורמים מסיסים המופרשים לתוך המדיה שמסביב ומתפזרים לתא שנמצא קצת יותר רחוק. והרבה פעמים כאשר תאים נמצאים בתרבית משותפת ויש להם השפעה אחד על השני, לא היה ברור אם אלה אינטראקציות מגע או גורמים מופרשים שממלאים את התפקיד.