שבעה צעדים Stellate תאים

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד תאי כוכב של הכבד (hepatic stellate cells) מכבד של עכבר. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע שני סבבים של פרפוזיה לכבדי העכברים עם אנזימי עיכול. לאחר הפרפוזיה, הכבדים נחתכים לחתיכות קטנות כדי להגביר את יעילות העיכול במבחנה (in vitro), המבוצע בשלב הבא.

כשלב סופי, תאי הכוכב הכבדיים מופרדים מסוגי תאי כבד אחרים באמצעות סבוב צנטריפוגי במדרג צפיפות. בסופו של דבר, מתקבלים תאי כוכב כבדיים שניתן להעריך את טוהרם באמצעות מיקרוסקופיה של אור ופלואורסצנציה אימונוגנית. את הפרוצדורה ידגים פטריק מאייר, סטודנט לתארים מתקדמים מהמעבדה. כהכנה לביצוע ה-NC two perfusion של כבדי עכברים, חמם תחילה את תמיסות ה-SC one buffer והאנזימים לפרפוזיה באמבט מים של 37 °C.

בשלב הבא, הגדירו את המשאבה הפריסטלטית כך שתשיג זרימה למינרית של 6.5 milliliters per minute והשריגו את צינור הסיליקון של המשאבה עם תמיסת SC one. כעת, ודאו באמצעות אובדן רפלקסים שהעכבר המורדם נמצא תחת סדציה עמוקה. לאחר מכן, קבעו את העכבר בתנוחה גבית (supine) על בסיס מתאים.

השתמשו במספריים ובפינצטה כדי לבצע חתך אורכי בעור הבטן ולחשוף את הפריטונאום. פתחו בזהירות את הפריטונאום והזיזו את המעיים אל מחוץ לחלל הבטן לצדו השמאלי של בעל החיים כדי לחשוף את הווריד הפורטלי. ההיבט המורכב ביותר של הליך זה הוא הפרפוזיה של הכבדים באנזימים מעכלים, אשר תודגם בהמשך.

בשלב הבא, חשוב להשתמש במיקרוסקופ סטריאוסקופית בעת החדרת הקנולה ולעקוב מקרוב אחר השינויים במבני הכבד במהלך הפרפוזיה. תוך עבודה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופית, הכניסו את הקנולה של מערכת העירוי לווריד הפורטלי. התחילו את הפרפוזיה של הכבד באמצעות 30 milliliters של תמיסת SC one. פתחו את ה-Vanna Cava inferior מיד לאחר תחילת הזרימה.

שטיפה מוצלחת של הכבד תתבטא באובדן הצבע של רקמת הכבד. לאחר מכן, בצעו פרפוזיה לכבד עם 30 milliliters של תמיסת Pronase E. אונוני הכבד ינפחו והמבנה הלוביולרי ייראה בבירור דרך הקפסולה לאחר פרפוזיה עם תמיסת Pronase E, ולאחר מכן פרפוזיה עם 30 milliliters של תמיסת collagenase P. עם השלמת הפרפוזיה עם collagenase P, הוציאו את הכבד מהעכבר על ידי דיסקציה זהירה מהסרעפת ומהאיברים הסובבים, ואחסנו אותו ב-70 milliliters של תמיסת SC two על קרח.

בשלב זה הכבד איבד את צורתו ונראה אטוני ואמורפי. יש לבצע את תהליך העיכול של כבדי עכברים בתנאים סטריליים, במנדף זרימה למינרית.

השתמשו במספריים חדים כדי לחתוך את הכבדים לחתיכות של כ-2 על 2 על 2 מילימטרים מעוקב. לאחר מכן, שלבו את תמיחת ה-SC two בנפח של 70 milliliters ואת חתיכות הכבד עם 50 milliliters של תמיסת protease E collagenase P. הוסיפו מיליליטר אחד של dna, one solution ועבדו את הכבדים במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius תוך כדי ערבוב.

לאחר עיכול אנזימטי של רקמת הכבד, מפרידים את התאי הכוכביים מסוגי תאי כבד אחרים באמצעות סבוב בגרדיאנט צפיפות. כדי להתחיל בהליך זה, סננו את תרחיף התאים דרך מסנני תאים של 70 מיקרומטר לשש מבחנות פלקון של 50 מיליליטר ושטפו את התאים בבופר E two; סובבו בצנטריפוגה במשך 10 דקות ב-600 Gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסבוב, שאבו בזהירות 40 מיליליטר מהנוזל העליון מכל מבחנה.

לאחר מכן, הוסיפו 150 µL של תמיסת DNA's one לכל מבחנה ותלו את התאים. איחדו את תליי התאים לארבעה מבחנות Falcon בנפח 50 mL ושטפו באמצעות G-B-S-S-P בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-600 Gs ובטמפרטורה של 4 °C. שאבו בזהירות כמה שיותר מהנוזל העליון מבלי להפריע למשקע, והוסיפו 150 µL של תמיסת DNAs one לכל מבחנה.

אנו מרחפים את משקעי התאים ב-10 milliliters של G-B-S-S-B לכל מבחנה. מאחדים את התאים לשתי מבחנות פלקון של 50 milliliter ומוסיפים G-B-S-S-B עד לנפח כולל של 36 milliliters לכל מבחנה. מוסיפים 14 milliliters של תמיסת den לכל מבחנה ומערבבים היטב.

לאחר מכן, העבירו 10 milliliters של תרחיף התאים למבחנה אחת של סבב צנטריפוגת עם מדרג (gradient centrifugation tube) בנפח 12 milliliters, כך שיתקבלו בסך הכל 10 מבחנות. הניחו בעדינות מעל תרחיף התאים 1.5 milliliters של G-B-S-S-B לכל מבחנה. צנטריפגו את המדרגים למשך 15 דקות ב-1500 Gs ובטמפרטורה של ארבע degrees Celsius ללא בלימה.

בשלב הבא, ההפטוציטים ישקעו לתחתית המבחנה, בעוד שתאי הכוכב (stellate cells) יימצאו בממשק כטבעת לבנה. באמצעות פיפטה של five milliliter, אספו בזהירות את הממשק המכיל את תאי הכוכב והעבירו אותו למבחנה של 50 milliliter. שטפו את התאים על ידי הוספת G-B-S-S-B וסבב צנטריפוגה למשך 10 minutes במהירות של 600 Gs ובטמפרטורה של four degrees Celsius.

שאבו את העליון (supernatant) והשעיקו מחדש את התאים ב-20 milliliters של DMEM עם תוספים. לאחר ספירת התאים, העבירו אותם לבקבוקי תרבית רקמות בריכוז של 2 × 10⁴ תאים לסנטימטר רבוע. דגרו את התאים ב-37 °C וב-5% carbon dioxide. כשעתיים לאחר הכנתם, התאי הכוכב הכבדיים (hepatic stellate cells) אמורים להיות דבוקים; החליפו את המצע כדי לשטוף תאים מתים ושאריות תאים.

החזירו את התאים לאינקובטור. תוצאות מייצגות של הכנת תאי כוכב כבדיים (hepatic stellate cells) מכבדי עכברים באמצעות פרוטוקול זה מוצגות כאן. תאים ביום הראשון וביום השלישי של תרבית in vitro מראים את המורפולוגיה האופיינית של תאי כוכב כבדיים. הם בעלי צורה אסטרוציטית ומראים אגירה של שלפוחיות ליפידיות.

באתרים גרעיניים, ניתן לאמת את טוהר התאים הכבדיים הכוכביים (hepatic stellate cells) המבודדים גם באמצעות ביטוי של חלבון חומצה גליאלית פיברילרית, או GFAP. תמונות אלו מציגות צביעה אימונופלורסצנטית מייצגת של GFAP, המוצג בצבע אדום בתאים כבדיים כוכביים שגודלו במשך שלושה ימים לאחר בידוד התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים תאים כבדיים כוכביים מכבד של עכבר כדי להשיג תפוקה מספקת של תאים כוכביים טהורים.

חשוב להבטיח עיכול יעיל לאחר פרפוזיה של הכבד. לבסוף, חיוני לקבוע את זהותם המדויקת של התאים המבודדים על ידי הערכת המורפולוגיה והפנוטיפ של תאי הכבד.