שבעה צעדים Stellate תאים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי כוכב כבדיים (hepatic stellate cells) מכבד של עכבר. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע שני סבבי פרפוזיה של כבדי עכברים עם אנזימים מעכלים. לאחר הפרפוזיה, הכבדים נחתכים לחתיכות קטנות כדי להגביר את יעילות העיכול במבחנה (in vitro), המבוצע בשלב הבא.

כשלב סופי, תאי הכוכב הכבדיים מופרדים מסוגי תאי כבד אחרים באמצעות סבב צנטריפוגה במעבר דחיסות. בסופו של דבר, מתקבלים תאי כוכב כבדיים ואת טהרתם ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופיה של אור ופלוורסצנציה אימונית. את הפרוצדורה ידגים פטריק מאייר, סטודנט לתואר מתקדם ממעבדה. כהכנה לביצוע פרפוזיה של כבדי עכברים בשיטת NC two, חמם תחילה את תמיסת הבאפר SC one ואת תמיסות הפרפוזיה של האנזימים באמבט מים של 37 °C.

בשלב הבא, הגדירו את משאבת הפריסטלטיקה כך שתשיג זרימה למינרית של 6.5 milliliters per minute והשריגו את צינור הסיליקון של המשאבה עם תמיסת SC one. כעת, ודאו באמצעות בדיקת אובדן רפלקסים שהעכבר המורדם נמצא בסדציה עמוקה. לאחר מכן, קבעו את העכבר בתנוחת גב (supine) על בסיס מתאים.

השתמשו במספריים ובפינצטה כדי לבצע חתךlongitudinal בעור הבטן ולחשוף את הפריטונאום. פתחו בזהירות את הפריטונאום והסיטו את המעיים אל מחוץ לחלל הבטן לצדו השמאלי של בעל החיים כדי לחשוף את הווריד הפורטלי. ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא פרפוזיית הזאטו של הכבדים עם אנזימים מעכלים, אשר תוצג בהמשך.

בשלב הבא, חשוב להשתמש במיקרוסקופ סטריאוסקופי בעת החדרת הקנולה ולעקוב מקרוב אחר השינויים במבני הכבד במהלך הפרפוזיה. תוך עבודה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, יש להחדיר את הקנולה של ערכת ההזרקה לווריד הפורטלי. התחל את הפרפוזיה של הכבד עם 30 milliliters של תמיסת SC one. פתח את ה-Vena Cava inferior מיד לאחר תחילת הזרימה.

שטיפה מוצלחת של הכבד תבטא באיבוד צבע של רקמת הכבד; לאחר מכן, בצעו פרפוזיה לכבד עם 30 milliliters של תמיסת Pronase E. אונויות הכבד ינפחו והסינונים (lobules) ייראו בבירור דרך הקפסולה לאחר ביצוע פרפוזיה עם תמיסת Pronase E, ולאחריה פרפוזיה עם 30 milliliters של תמיסת Collagenase P. עם השלמת הפרפוזיה עם Collagenase P, הוציאו את הכבד מהעכבר על ידי דיסקציה זהירה מהסרעפת ומהאיברים הסובבים, ואחסנו אותו ב-70 milliliters של תמיסת SC two על קרח.

בשלב זה הכבד איבד את צורתו ונראה אטוני ואמורפי. את הליך עיכול כבדי עכברים יש לבצע בתנאים סטריליים, בתוך מ 빠르게-flow laminar (מCפה עם זרימה למינרית).

השתמשו במספריים חדים כדי לחתוך את הכבדים לחתיכות של בערך שני על שני על שני מילימטרים קובים. לאחר מכן, ערבבו את תמיסת ה-SC two בנפח של 70 milliliters ואת חתיכות הכבד עם 50 milliliters של תמיסת protease E collagenase P. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת dna, one ועבדו את הכבדים באמצעות עיכול למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 °C תוך כדי ערבוב.

לאחר עיכול אנזימטי של רקמת הכבד, מפרידים את התאים הכוכביים (stellate cells) מסוגי תאים Hepatic אחרים באמצעות סבוב צנטריפוגלי במדרג צפיפות. כדי להתחיל בהליך זה, סננו את תרחיף התאים דרך מסנני תאים של 70 micrometer לתוך שש מבחנות Falcon של 50 milliliter ושטפו את התאים עם באפר E two; סובבו בצנטריפוגה במשך 10 דקות ב-600 Gs ובטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius. לאחר הסבוב, שאבו בזהירות 40 milliliters מהנוזל העליון (supernatant) מכל מבחנה.

לאחר מכן, הוסיפו 150 µL של תמיסת DNA's one לכל מבחנה וערבבו מחדש את התאים. איחדו את תרחיפי התאים לארבעה מבחנות Falcon בנפח 50 mL ושטפו באמצעות סבב צנטריפוגה של G-B-S-S-P למשך 10 דקות ב-600 Gs ובטמפרטורה של 4 °C. שאבו בזהירות כמה שיותר מהנוזל העליון מבלי להפריע למשקע, והוסיפו 150 µL של תמיסת DNAs one לכל מבחנה.

אנו מרחפים את משקעי התאים ב-10 milliliters של G-B-S-S-B לכל מבחנה. מאחדים את התאים לשתי מבחנות פלקון של 50 milliliter ומוסיפים G-B-S-S-B עד לנפח כולל של 36 milliliters למבחנה. מוסיפים 14 milliliters של תמיסת den לכל מבחנה ומערבבים היטב.

בשלב הבא, העבירו 10 מיליליטר של תרחיף התאים למבחנה אחת לסבב צנטריפוגה במדרג בנפח 12 מיליליטר, כך שיתקבלו בסך הכל 10 מבחנות. הניחו בעדינות מעל תרחיף התאים 1.5 מיליליטר של G-B-S-S-B לכל מבחנה. סובבו את המדרגים בצנטריפוגה במשך 15 דקות ב-1500 Gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ללא הפסקה.

לאחר מכן, ההפטוציטים ישקעו לתחתית המבחנה, בעוד שתאי הכוכב יימצאו בממשק כטבעת לבנה. באמצעות פיפט של חמישה מיליליטר, אספו בזהירות את הממשק המכיל את תאי הכוכב והעבירו למבחנה של 50 מיליליטר. שטפו את התאים על ידי הוספת G-B-S-S-B וצנטריפוגציה למשך 10 דקות ב-600 Gs ובארבע מעלות צלזיוס.

שאבו את הנוזל העליון (supernatant) והשעיקו מחדש את התאים ב-20 milliliters של DMEM עם תוספים. לאחר ספירת התאים, העבירו אותם לבקבוקי תרבית רקמה בריכוז של 2 × 10⁴ תאים לסמ"ר. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. כעתיים לאחר הכנתם, תאי הכבד הכוכביים (hepatic stellate cells) אמורים להיות דבקים; החליפו את המצע כדי לשטוף תאים מתים ושאריות תאים.

החזירו את התאים לאינקובטור. תוצאות מייצגות של הכנת תאי כוכב של הכבד (hepatic stellate cells) מכבדים של עכברים באמצעות פרוטוקול זה מוצגות כאן. תאים ביום הראשון וביום השלישי של תרבית in vitro מראים את המורפולוגיה האופיינית לתאי כוכב של הכבד. הם בעלי צורה אסטרוציטית ומראים אגירה של שלפוחיות ליפידיות.

באתרים גרעיניים, ניתן לאמת את טוהר תאי הכוכב הכבדיים המבודדים גם באמצעות ביטוי של חלבון חומצה גליאלי פיברילי או GFAP. תמונות אלו מציגות צביעה אימונופלואורסצנטית מייצגת עבור GFAP, המוצג בצבע אדום, בתאי כוכב כבדיים שגודלו במשך שלושה ימים לאחר בידוד התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לבודד תאי כוכב כבדיים מכבד של נוירון כדי להגיע לתפוקה מספקת של תאי כוכב טהורים.

חשוב להבטיח עיכול יעיל לאחר פרפוזיה של הכבד. לבסוף, חיוני לקבוע את הזהות הנכונה של התאים המבודדים על ידי הערכת המורפולוגיה והפנוטיפ של תאי הכבד.