שבעה צעדים Stellate תאים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי כוכב כבדיים (hepatic stellate cells) מכבד של עכבר. הדבר מושג תחילה על ידי ביצוע שני סבבי פרפוזיה של כבדי עכברים עם אנזימי עיכול. לאחר הפרפוזיה, הכבדים נחתכים לחתיכות קטנות כדי להגביר את יעילות העיכול in vitro, המבוצע בשלב הבא.

כשלב סופי, תאי הכוכב הכבדיים מופרדים מסוגי תאי כבד אחרים באמצעות סבוב בגרדיאנט צפיפות. בסופו של דבר, מתקבלים תאי כוכב כבדיים וניתן להעריך את טוהרותם באמצעות מיקרוסקופיית אור ופלוורסצנציה אימונית. את הפרוצדורה ידגים פטריק מאייר, סטודנט לתארים מתקדמים ממעבדה. כהכנה לביצוע NC two של כבדי עכברים, חמם תחילה את תמיסת ה-SC one ואת תמיסות הפרפוזיה של האנזימים באמבט מים של 37 °C.

בשלב הבא, הגדירו את משאבת הפריסטלטיקה כך שתשיג זרימה למינרית של 6.5 milliliters per minute והשרו שיווי משקל בצינור הסיליקון של המשאבה באמצעות תמיסת SC one. כעת, ודאו באמצעות אובדן רפלקסים כי העכבר המורדם נמצא בסדציה עמוקה. לאחר מכן, קבעו את העכבר בתנוחה גבהית (supine) על בסיס מתאים.

השתמשו במספריים ובפינצטה כדי לבצע חתך אורכי בעור הבטן ולחשוף את הפריטונאום (peritoneum). פתחו בזהירות את הפריטונאום והזיזו את המעיים אל מחוץ לחלל הבטן לכיוון הצד השמאלי של החיה כדי לחשוף את הווריד הפורטלי. ההיבט המאתגר ביותר של הליך זה הוא פרפוזיית ה-zeto של הכבדים באמצעות אנזימי עיכול, אשר יודגם בהמשך.

בשלב הבא, חשוב להשתמש במיקרוסקופ סטריאו בעת החדרת הקנולה ולעקוב מקרוב אחר השינויים במבני הכבד במהלך הפרפוזיה. תוך עבודה תחת מיקרוסקופ סטריאו, הכניסו את קנולת מערכת ההזרקה לווריד הפורטלי. התחילו את פרפוזיית הכבד עם 30 milliliters של תמיסת SC one. פתחו את ה-Vena Cava inferior מיד לאחר תחילת הזרימה.

שטיפה מוצלחת של הכבד תתבטא באובדן הצבע של רקמת הכבד; לאחר מכן, בצעו פרפוזיה לכבד עם 30 milliliters של תמיסת Pronase E. אונוני הכבד ינפחו והסינונים ייראו ברורים דרך הקפסולה לאחר הזרמה של תמיסת pronase E, ולאחריה פרפוזיה של 30 milliliters של תמיסת collagenase P. עם השלמת הפרפוזיה ב-collagenase P, הוציאו את הכבד מהעכבר על ידי ניתוח זהיר מהסרעפת ומהאיברים הסובבים, ואחסנו אותו ב-70 milliliters של תמיסת SC two על קרח.

בשלב זה הכבד איבד את צורתו ונראה רפוי ואמורפי. יש לבצע את הליך עיכול כבדי העכברים בתנאים סטריליים, בתוך מכן זרימה למינרית.

השתמשו במספריים חדים כדי לחתוך את הכבדים לחתיכות של בערך שני על שני על שני מילימטרים מעוקב. לאחר מכן, ערבבו את תגלי העלקה של 70 milliliters של SC two ואת חתיכות הכבד עם 50 milliliters של תמיסת protease E collagenase P. הוסיפו one milliliter של dna, one solution ועובדו את הכבדים במשך 20 דקות ב-37 degrees Celsius תוך כדי ערבוב.

לאחר עיכול אנזימטי של רקמת הכבד, מפרידים את התאים הכוכביים (stellate cells) מסוגים אחרים של תאי כבד באמצעות סנטריפוגציה במעבר מדרג צפיפות. כדי להתחיל בהליך זה, סננו את תרחיף התאים דרך מסנני תאים של 70 micrometer לתוך שש מבחנות פלקון של 50 milliliter ושטפו את התאים עם באפר E two; סנטריפוגו למשך 10 דקות ב-600 Gs ובטמפרטורה של ארבע degrees Celsius. לאחר הסנטריפוגציה, שאבו בזהירות 40 milliliters מהנוזל העליון (supernatant) מכל מבחנה.

לאחר מכן, הוסף 150 µl של תמיסת DNA's one לכל מבחנה וערבב מחדש את התאים. רכז את תליי התאים לארבעה מבחנות Falcon בנפח 50 ml ושטוף באמצעות G-B-S-S-P בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-600 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. שאב בזהירות כמה שיותר מהנוזל העליון מבלי להפריע למשקע, והוסף 150 µl של תמיסת DNAs one לכל מבחנה.

אנו מרחפים את משקעי התאים ב-10 milliliters של G-B-S-S-B לכל מבחנה. מאחדים את התאים לשתי מבחנות פלקון בנפח 50 milliliter ומוסיפים G-B-S-S-B עד לנפח כולל של 36 milliliters למבחנה. מוסיפים 14 milliliters של תמיסת den לכל מבחנה ומערבבים היטב.

בשלב הבא, העבירו 10 מיליליטר של תגלהי התאים למספר מבחנות צנטריפוגה למדריג (בנפח 12 מיליליטר למבחנה), כך שיתקבלו בסך הכל 10 מבחנות. הניחו בעדינות מעל תגלהי התאים 1.5 מיליליטר של G-B-S-S-B לכל מבחנה. צנטריפוגו את המדריגים למשך 15 דקות ב-1500 Gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, ללא בלימה.

בשלב הבא, ההפטוציטים ישקעו בתחתית המבחנה, בעוד שתאי הכוכב יימצאו בממשק כטבעת לבנה. באמצעות פיפטה של 5 mL, אספו בזהירות את הממשק המכיל את תאי הכוכב והעבירו אותו למבחנה של 50 mL. שטפו את התאים על ידי הוספת G-B-S-S-B וסבב צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-600 Gs ובטמפרטורה של 4 °C.

שאבו את העליון (supernatant) ותלו את התאים מחדש ב-20 milliliters של DMEM עם תוספים. לאחר ספירת התאים, העבירו אותם לבקבוקי תרבית רקמה בריכוז של 2 × 10⁴ תאים לסנטימטר רבוע. דגרו את התאים ב-37 °C וב-5% carbon dioxide. כשעתיים לאחר הכנתם, תאי הכוכב הכבדיים (hepatic stellate cells) אמורים להיות דבקים; החליפו את המצע כדי לשטוף תאים מתים ושיירי תאים.

החזירו את התאים לאינקובטור. תוצאות מייצגות של הכנת תאי כוכב כבדיים (hepatic stellate cells) מכבדי עכברים באמצעות פרוטוקול זה מוצגות כאן. תאים ביום הראשון וביום השלישי של תרבית in vitro מראים את המורפולוגיה האופיינית של תאי כוכב כבדיים. הם בעלי צורה דמוית אסטרוציט ומציגים אגירה של וסיקולות ליפידיות.

באתרים גרעיניים, ניתן לאמת את טוהר התאים הכוכביים הכבדיים המבודדים גם באמצעות ביטוי של חלבון חומצה גליאלית פיברילרית או GFAP. תמונות אלו מציגות צביעה אימונופלואורסצנטית מייצגת של GFAP המוצג בצבע אדום בתאים כוכביים כבדיים, אשר תורבעו במשך שלושה ימים לאחר בידוד התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן בידוד תאים כוכביים כבדיים מכבד של נוירון כדי להשיג תפוקה מספקת של תאים כוכביים טהורים.

חשוב להבטיח עיכול יעיל בעת פרפוזיה של הכבד. לבסוף, חיוני לקבוע את הזהות הנכונה של התאים המבודדים על ידי הערכת המורפולוגיה והפנוטיפ של תאי ה-dal הכבדיים.