Name: שבעה צעדים Stellate תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: למדו שיטה לאיסולציה של תאי כוכביים כבדיים מכבד עכברים באמצעות עיכול אנזימטי וסנטריפוגה בגרדיאנט צפיפות. הפרוטוקול מספק טוהר גבוה לתאים לשימוש במחקרי כבד ורפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי משפחת סמית פרס למצוינות מחקר ביו NIH RO1 AI083426-01 (FW). פטריק Maschmeyer ומלאני Flach נתמכים על ידי מלגות PhD מן Boehringer Ingelheim קרן.

C57BL עכברים / 6 יש להשתמש ב ~ 20 שבועות ומעלה. השימוש עכברים זכרים במשקל של 25-30G מומלץ. התשואה של תאים stellate יכולה להיות מוגברת על ידי האכלה לעכברים דיאטה מועשר בויטמין עבור 2 חודשים לפני stellate בידוד התא. כ 2x10 5 stellate תאים בכבד יכולה להיות מטוהרים מהכבד של העכבר C57BL / 6 אחת, בעוד התשואה של תאים stellate מ Balb / c עכברים גבוה במידה ניכרת. פרוטוקול הבאים מותאם 5 עכברים. טיפול בבעלי חיים ניסויים בוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים אישרה מוסדיים ועדת פרוטוקולים שימוש. 1. זלוף באתרו של כבדי עכבר עם אנזימי עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם החיץ sc1 ו זלוף פתרונות האנזים אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר עירוי מכונף להגדיר על צינור סיליקון של משאבה peristaltic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את המשאבה עם PBS להשיג תזרים למינרית של 6.5ml/min, המהווה את קצב הזרימה כי ישמש ב זלוף באתרו של הכבד. לאזן את צינור סיליקון עם פתרון sc1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal של קטמין (90 מ"ג / ק"ג) ו Xylazine (10 מ"ג / ק"ג) פתרון מבחן עבור אובדן הרפלקסים, כדי להבטיח הרדמה עמוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העכבר בעמדת פרקדן על בסיס מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מספריים מלקחיים לבצע חתך אורכי בעור הבטן ולחשוף את הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לפתוח את הצפק ולהעביר את המעיים מתוך חלל הבטן בצד שמאל של החיה על מנת לחשוף את וריד השער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צינורית של אינפוזיה לווריד להגדיר את הפורטל. במשך שלב זה, השימוש stereomicroscope מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את זלוף של הכבד עם פתרון sc1 30 מ"ל. פתח את הווריד הנבוב נחות מיד לאחר שיזם את הזרימה. שטיפה מוצלחת של הכבד הוא הצביע על ידי הפסד של צבע של רקמת הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse את הכבד עם פתרון Pronase 30 מ"ל E. לאחר עיכול מוצלח, האונות בכבד יהיה להתנפח, האוניות יופיע נפרדות באמצעות הקפסולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse את הכבד עם פתרון collagenase 30 מ"ל P. הכבד בשלב זה איבד את צורתו נראה טונוס אמורפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפריד את הכבד מן הסרעפת והאיברים המקיפים ולאחסן אותו פתרון 70ml SC2 על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עבור עכברים נוספים. </li></ol> 2. בשנת עיכול חוץ גופית של כבדי העכבר צעדים כל עובד נוסף צריך להתבצע בתנאים סטריליים במנדף זרימה למינרית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הכבדים לחתיכות של כ 3 2x2x2mm באמצעות מספריים חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את השעיית 70ml SC2 כולל חתיכות כבד עם 50 מ"ל של תמיסת E-collagenase Pronase P ולהוסיף 1ml של תמיסת אני DNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר את הכבדים עבור 20min ב 37 ° C תוך ערבוב. </li></ol> 3. שיפוע צפיפות צנטריפוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה התא דרך מסננות לתוך תא 70μm 6 צינורות פלקון 50 מ"ל ולהוסיף לה עד 50 מ"ל עם חיץ SC2. צנטריפוגה עבור 10min ב 600g ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בזהירות 40ml של supernatant, ולאחר מכן להוסיף 150μl פתרון DNase אני לצינור כל resuspend התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת השעיות התא לתוך 4 מבחנות פלקון 50 מ"ל ולשטוף עם GBSS-B, צנטריפוגה עבור 10min ב 600g ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב כמה שיותר supernatant ככל האפשר מבלי להפריע גלולה ולהוסיף 150μl DNase פתרון אני על צינור אחד. Resuspend את כדורי תא 10ml GBSS-B לכל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת התאים לתוך 50 מ"ל 2 צינורות פלקון ולהוסיף GBSS-B כדי בהיקף כולל של 36ml לכל צינור. הוסף פתרון 14ml Nycodenz אל צינור כל ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה של 10 מ"ל ההשעיה תא לאחת צינור 12ml צנטריפוגה שיפוע, וכתוצאה מכך 10 צינורות בסך הכל. בעדינות כיסוי על השעיית התא עם צינור 1.5ml לכל GBSS-B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדרגתיים עבור 15min ב 1500g ו - 4 ° C ללא בלם. לאחר מכן, hepatocytes יהיה pelleted בתחתית הצינור ואילו תאים stellate נמצאים שלבי הביניים כמו טבעת לבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות הקציר שלבי הביניים המכיל את התאים stellate לשטוף אותם עם GBSS-B; צנטריפוגות עבור 10min ב 600g ו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend התאים DMEM 20ml בתוספת חום מומת 10% FBS, HEPES 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 2mm L-גלוטמין, pyruvate 1mm נתרן 10mm. העברת התאים לתוך צלוחיות תרבות רקמות עם ריכוז של 2x10 4 תאים / 2 ס"מ. דגירה התאים ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את התקשורת ברגע stellate תאים בכבד הם חסיד (כ 2h לאחר ההכנה) כדי לשטוף תאים מתים ופסולת תאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, התא stellateזה צריך לפתח בצורת כוכב המורפולוגיה האופיינית שלהם עם perinuclear ויטמין A-אחסון שלפוחית ​​השומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים עוקבים, stellate תאים בכבד יכול בקלות להיות מנותקת מן הלא מצופה משטחי הפלסטיק באמצעות פתרונות אנזימטי מתון כגון Accutase, למשל </li></ol> 4. נציג תוצאות: בעקבות הכנת stellate תאים בכבד באמצעות פרוטוקול בתנאי, טוהר האוכלוסייה מבודדים ניתן לבדוק בהתחשב שלושת המאפיינים העיקריים של סוג זה התא, כגון צורת כוכב דמוי טיפות השומנים perinuclear, וביטוי של החלבון גליה חומצי fibrillary (GFAP ). התמונות נציג להופעת אופייני stellate 2h הכבד תאים לאחר בידוד התא, כמו גם ביום 1 ו -3 בתרבות במבחנה מתוארים באיור 1. איור 2 מראה מכתים immunofluorescence נציג GFAP ב stellate תאים בכבד, אשר היו בתרבית במשך 3 ימים לאחר בידוד התא. Stellate התאים להתמיין לתאי הכבד myofibroblastic במהלך בתרבות חוץ גופית. סימן ההיכר האופייני של תאים אלה מופעלים stellate היא הביטוי של אלפא חלקה השריר אקטין (αSMA). איור 3 מראה מכתים immunofluorescence עבור אסמא ו שרירן IIA בתאי stellate מופעל על יום של 7 בתרבות חוץ גופית. <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. מורפולוגיה אופיינית של תאים stellate הכבד. תאים Stellate נותקו מן הכבדים העכבר באמצעות פרוטוקול סיפק. התמונות מתארות stellate תאים 2h לאחר בידוד תא (a, b), כמו גם ביום 1 (ג) ו - יום 3 (ד) בתרבות חוץ גופית. Stellate תאים כבדית התערוכה כמויות גבוהות של שומנים בדם שלפוחית ​​באתרים perinuclear ולרכוש האסטרלי כמו מורפולוגיה ייחודית שלהם בימים הראשונים של תרבות חוץ גופית (הגדלה 200x). <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Stellate תאים כבדית במיוחד להביע GFAP בכבד. תאים Stellate בודדו ומוכתמת immunofluorescently עבור GFAP (אדום) ביום 3 של תרבות חוץ גופית. גרעין התא מתוארים כחול (Hoechst כתם). <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Stellate בתאי הכבד להתמיין myofibroblasts. Stellate כבדית תאים מבודדים מעכברים C57BL / 6 היו בתרבית למשך 7 ימים. לאחר מכן, הם הועברו שקופיות קאמרית מוכתם עבור אסמא (באדום) ו שרירן IIA (המתואר ירוק). גרעין התא היו counterstained עם Hoechst (כחול). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> Sc1 הצפת </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 190mg </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 900mg </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 מ"ל של תמיסת מניות 1M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8G </td></tr><tr><td> לאא 2 PO 4 x H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ממלאים עד 1 ליטר </td></tr><tr><td colspan="2"> SC2 הצפת </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 560mg </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 מ"ל של תמיסת מניות 1M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8G </td></tr><tr><td> לאא 2 PO 4 x H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ממלאים עד 1 ליטר </td></tr><tr><td colspan="2"> GBSS-Buffer </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 75 מ"ג </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ממלאים עד 1 ליטר </td></tr><tr><td colspan="2">GBSS B-Buffer </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 75 מ"ג </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8G </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ממלאים עד 1 ליטר </td></tr><tr><td colspan="2"> זלוף Pronase E פתרון </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> 100 מ"ג (4,000 PU / מ"ג דקות) </td></tr><tr><td> SC2 הצפת </td><td> 200 מ"ל </td></tr><tr><td colspan="2"> Collagenase P פתרון זלוף </td></tr><tr><td> Collagenase P </td><td> 85mg (1.78 U / מ"ג איו) </td></tr><tr><td> SC2 הצפת </td><td> 200 מ"ל </td></tr><tr><td colspan="2"> Pronase E-collagenase P פתרון </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> 50 מ"ג (4,000 PU / מ"ג דקות) </td></tr><tr><td> Collagenase P </td><td> 85mg (1.78 U / מ"ג איו) </td></tr><tr><td> SC2 הצפת </td><td> 50 מ"ל </td></tr><tr><td colspan="2"> DNase פתרון אני </td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> 6mg (2000U/mg בקירוב) </td></tr><tr><td> GBSS-B </td><td> 3ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Nycodenz פתרון </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> 8G </td></tr><tr><td> GBSS-A </td><td> 28ml </td></tr></tbody></table> טבלה 1. Buffers ופתרונות האנזים הדרוש בידוד של תאים stellate הכבד. ה-pH של חוצצי כל צריך להיות מותאם 7.3-7.4. יתר על כן, סינון סטרילי של חוצצי כל מומלץ. חשוב להתאים את כמות אנזים המשמש על פי הפעילות האנזימטית נתון.

<ol><li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+protean%2C+multifunctional%2C+and+enigmatic+cells+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).</li>
<li>Geerts, A. H. istory <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heterogeneity%2C+developmental+biology%2C+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).</li>
<li>Gressner, A. M. &amp, Weiskirchen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+pathogenetic+concepts+of+liver+fibrosis+suggest+stellate+cells+and+TGF-beta+as+major+players+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets.</a> J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).</li>
<li>Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+role+in+microcirculation+and+pathophysiology+of+portal+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension.</a> Gut. 50, 571-581 (2002).</li>
<li>Winau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ito+cells+are+liver-resident+antigen-presenting+cells+for+activating+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses.</a> Immunity. 26, 117-129 (2007).</li>
<li>Minicis, S. D. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+during+hepatic+stellate+cell+activation+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo.</a> Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).</li>
<li>Knittel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+liver+myofibroblasts+and+hepatic+stellate+cells+in+normal+and+diseased+rat+livers%3A+distinct+roles+of+%28myo-%29fibroblast+subpopulations+in+hepatic+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair.</a> Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Stellate תאים כבדית לווסת תהליכים פיזיולוגיים חיוניים pathophysiological בכבד. יתר על כן, תאים בעלי תכונות stellate הצגת אנטיגן, טיוח אותם מרכיב חשוב של התגובה החיסונית בכבד. למרות stellate תאים בכבד מהווים 10-15% ממספר תאים הכולל בכבד, בידוד של תאים אלה הוא מאתגר בשל לוקליזציה שלהן בחלל perisinusoidal של Disse. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד stellate הכבד תאים כבדי העכבר על ידי לעיכול באתרו צנטריפוגה ה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מס &#39;קטלוג </th></tr><tr><td> 70μm מסננת Cell </td><td> BD </td><td> 352350 </td></tr><tr><td> CaCL 2 x 2H 2 O </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> Collagenase P </td><td> רוש </td><td> 11249002001 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11960 </td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> רוש </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Fluka </td><td> 3777 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> G7528 </td></tr><tr><td> צנטריפוגה Gradient צינורות </td><td> גריינר Bio-One </td><td> 163160 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 שעות 2 O </td><td> Fluka </td><td> 63068 </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7H 2 O </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M2773 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 × 2H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71643 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S3014 </td></tr><tr><td> לאא 2 PO 4 x H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71507 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71628 </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> Accudenz AG </td><td> AN7050/BLK </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> Peristaltic משאבה </td><td> קול בן הזוג </td><td> HV-7523-70 </td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P4633 </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> Calbiochem </td><td> 7433-2 </td></tr><tr><td> סיליקון Tube </td><td> Masterflex </td><td> HV-96440-14 </td></tr><tr><td> נתרן Pyruvate </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> תרבות רקמות צפחת (25cm 2) </td><td> BD </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> עירוי מכונפת הגדר </td><td> Terumo </td><td> 1SV27EL </td></tr></tbody></table>

שבעה צעדים stellate תאים

Seven Steps to Stellate Cells

Stellate תאים כבדית הם הכבד תושב מורפולוגיה של תאים דמויי כוכב ממוקמים בחלל Disse בין תאים בכבד סינוסי האנדותל 1,2 hepatocytes. תאים Stellate נגזרות מבשרי מח עצם לאחסן עד 80% של ויטמין הגוף הכולל 1, 2. עם ההפעלה, stellate תאים להתמיין myofibroblasts לייצר תאי מטריקס, ובכך לתרום לייפת הכבד 3. בהתבסס על יכולתם החוזה, תאים stellate myofibroblastic יכול לווסת את הטון כלי הדם הקשורים ליתר לחץ דם הפורטל 4. לאחרונה, הראינו כי stellate תאים בכבד הם תאים אנטיגן חזק הצגת ויכול להפעיל תאים NKT וכן לימפוציטים מסוג T קונבנציונאלי 5. כאן אנו מציגים שיטה להכנת יעילה של תאים בכבד stellate מהכבד העכבר. בשל לוקליזציה perisinusoidal שלהם, בידוד של תאים stellate הכבד הוא תהליך רב שלבי. על מנת להבהיר תאים stellate נגיש במנותק מן החלל של Disse, כבדי העכבר הם perfused באתרו עם אנזימי עיכול Pronase E ו collagenase זלוף פ בעקבות, רקמת הכבד נתונה טיפול אנזימטי נוסף עם Pronase E ו-P ב collagenase במבחנה. כתוצאה מכך, השיטה מנצלת את כמות מסיבית של ויטמין A, אחסון טיפות השומנים בתאי stellate הכבד. תכונה זו מאפשרת הפרדה של תאים stellate של סוגי תאים אחרים הכבד על ידי צנטריפוגה על שיפוע Nycodenz 8%. פרוטוקול המתואר כאן התשואות אוכלוסייה טהור מאוד הומוגני של תאים stellate. טוהר ההכנות ניתן להעריך על ידי מכתים את מולקולת חלבון סמן גליה חומצי fibrillary (GFAP), לפני הניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי או cytometry הזרימה. יתר על כן, במיקרוסקופ אור חושף את המראה הייחודי של בצורת כוכב stellate בתאי הכבד כי הנמל כמויות גדולות של טיפות השומנים. יחדיו, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור בידוד יעיל של stellate בתאי הכבד, כולל תמונות של נציג המראה המורפולוגי שלהם ביטוי GFAP המסייעים להגדיר את הישות תא stellate.

כאן אנו מתארים שיטת הבידוד של stellate בתאי הכבד מהכבד העכבר. עבור טיהור תא stellate, כבדי עכבר מתעכלים<em&gt; באתרו</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי טיפול pronase-collagenase לפני צנטריפוגה שיפוע צפיפות. טכניקה זו התשואות טהור מאוד stellate תאים בכבד.

שבעה צעדים Stellate תאים

תאי כוכב כבדיים הם תאים השוכנים בכבד, בעלי מורפולוגיה דמוית כוכב, והם ממוקמים במרווח דיס (space of Disse) בין תאי אנדותל סינוסואידליים של הכבד...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי כוכב כבדיים (hepatic stellate cells) מכבד של עכבר. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע שני סבבי פרפוזיה של כבדי עכברים עם אנזימים מעכלים. לאחר הפרפוזיה, הכבדים נחתכים לחתיכות קטנות כדי להגביר את יעילות העיכול במבחנה (in vitro), המבוצע בשלב הבא.כשלב סופי, תאי הכוכב הכבדיים מופרדים מסוגי תאי כבד אחרים באמצעות סבב צנטריפוגה במעבר דחיסות. בסופו של דבר, מתקבלים תאי כוכב כבדיים ואת טהרתם ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופיה של אור ופלוורסצנציה אימונית. את הפרוצדורה ידגים פטריק מאייר, סטודנט לתואר מתקדם ממעבדה. כהכנה לביצוע פרפוזיה של כבדי עכברים בשיטת NC two, חמם תחילה את תמיסת הבאפר SC one ואת תמיסות הפרפוזיה של האנזימים באמבט מים של 37 °C.בשלב הבא, הגדירו את משאבת הפריסטלטיקה כך שתשיג זרימה למינרית של 6.5 milliliters per minute והשריגו את צינור הסיליקון של המשאבה עם תמיסת SC one. כעת, ודאו באמצעות בדיקת אובדן רפלקסים שהעכבר המורדם נמצא בסדציה עמוקה. לאחר מכן, קבעו את העכבר בתנוחת גב (supine) על בסיס מתאים.השתמשו במספריים ובפינצטה כדי לבצע חתךlongitudinal בעור הבטן ולחשוף את הפריטונאום. פתחו בזהירות את הפריטונאום והסיטו את המעיים אל מחוץ לחלל הבטן לצדו השמאלי של בעל החיים כדי לחשוף את הווריד הפורטלי. ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא פרפוזיית הזאטו של הכבדים עם אנזימים מעכלים, אשר תוצג בהמשך.בשלב הבא, חשוב להשתמש במיקרוסקופ סטריאוסקופי בעת החדרת הקנולה ולעקוב מקרוב אחר השינויים במבני הכבד במהלך הפרפוזיה. תוך עבודה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, יש להחדיר את הקנולה של ערכת ההזרקה לווריד הפורטלי. התחל את הפרפוזיה של הכבד עם 30 milliliters של תמיסת SC one. פתח את ה-Vena Cava inferior מיד לאחר תחילת הזרימה.שטיפה מוצלחת של הכבד תבטא באיבוד צבע של רקמת הכבד; לאחר מכן, בצעו פרפוזיה לכבד עם 30 milliliters של תמיסת Pronase E. אונויות הכבד ינפחו והסינונים (lobules) ייראו בבירור דרך הקפסולה לאחר ביצוע פרפוזיה עם תמיסת Pronase E, ולאחריה פרפוזיה עם 30 milliliters של תמיסת Collagenase P. עם השלמת הפרפוזיה עם Collagenase P, הוציאו את הכבד מהעכבר על ידי דיסקציה זהירה מהסרעפת ומהאיברים הסובבים, ואחסנו אותו ב-70 milliliters של תמיסת SC two על קרח.בשלב זה הכבד איבד את צורתו ונראה אטוני ואמורפי. את הליך עיכול כבדי עכברים יש לבצע בתנאים סטריליים, בתוך מ 빠르게-flow laminar (מCפה עם זרימה למינרית).השתמשו במספריים חדים כדי לחתוך את הכבדים לחתיכות של בערך שני על שני על שני מילימטרים קובים. לאחר מכן, ערבבו את תמיסת ה-SC two בנפח של 70 milliliters ואת חתיכות הכבד עם 50 milliliters של תמיסת protease E collagenase P. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת dna, one ועבדו את הכבדים באמצעות עיכול למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 °C תוך כדי ערבוב.לאחר עיכול אנזימטי של רקמת הכבד, מפרידים את התאים הכוכביים (stellate cells) מסוגי תאים Hepatic אחרים באמצעות סבוב צנטריפוגלי במדרג צפיפות. כדי להתחיל בהליך זה, סננו את תרחיף התאים דרך מסנני תאים של 70 micrometer לתוך שש מבחנות Falcon של 50 milliliter ושטפו את התאים עם באפר E two; סובבו בצנטריפוגה במשך 10 דקות ב-600 Gs ובטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius. לאחר הסבוב, שאבו בזהירות 40 milliliters מהנוזל העליון (supernatant) מכל מבחנה.לאחר מכן, הוסיפו 150 µL של תמיסת DNA's one לכל מבחנה וערבבו מחדש את התאים. איחדו את תרחיפי התאים לארבעה מבחנות Falcon בנפח 50 mL ושטפו באמצעות סבב צנטריפוגה של G-B-S-S-P למשך 10 דקות ב-600 Gs ובטמפרטורה של 4 °C. שאבו בזהירות כמה שיותר מהנוזל העליון מבלי להפריע למשקע, והוסיפו 150 µL של תמיסת DNAs one לכל מבחנה.אנו מרחפים את משקעי התאים ב-10 milliliters של G-B-S-S-B לכל מבחנה. מאחדים את התאים לשתי מבחנות פלקון של 50 milliliter ומוסיפים G-B-S-S-B עד לנפח כולל של 36 milliliters למבחנה. מוסיפים 14 milliliters של תמיסת den לכל מבחנה ומערבבים היטב.בשלב הבא, העבירו 10 מיליליטר של תרחיף התאים למבחנה אחת לסבב צנטריפוגה במדרג בנפח 12 מיליליטר, כך שיתקבלו בסך הכל 10 מבחנות. הניחו בעדינות מעל תרחיף התאים 1.5 מיליליטר של G-B-S-S-B לכל מבחנה. סובבו את המדרגים בצנטריפוגה במשך 15 דקות ב-1500 Gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ללא הפסקה.לאחר מכן, ההפטוציטים ישקעו לתחתית המבחנה, בעוד שתאי הכוכב יימצאו בממשק כטבעת לבנה. באמצעות פיפט של חמישה מיליליטר, אספו בזהירות את הממשק המכיל את תאי הכוכב והעבירו למבחנה של 50 מיליליטר. שטפו את התאים על ידי הוספת G-B-S-S-B וצנטריפוגציה למשך 10 דקות ב-600 Gs ובארבע מעלות צלזיוס.שאבו את הנוזל העליון (supernatant) והשעיקו מחדש את התאים ב-20 milliliters של DMEM עם תוספים. לאחר ספירת התאים, העבירו אותם לבקבוקי תרבית רקמה בריכוז של 2 × 10⁴ תאים לסמ"ר. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. כעתיים לאחר הכנתם, תאי הכבד הכוכביים (hepatic stellate cells) אמורים להיות דבקים; החליפו את המצע כדי לשטוף תאים מתים ושאריות תאים.החזירו את התאים לאינקובטור. תוצאות מייצגות של הכנת תאי כוכב של הכבד (hepatic stellate cells) מכבדים של עכברים באמצעות פרוטוקול זה מוצגות כאן. תאים ביום הראשון וביום השלישי של תרבית in vitro מראים את המורפולוגיה האופיינית לתאי כוכב של הכבד. הם בעלי צורה אסטרוציטית ומראים אגירה של שלפוחיות ליפידיות.באתרים גרעיניים, ניתן לאמת את טוהר תאי הכוכב הכבדיים המבודדים גם באמצעות ביטוי של חלבון חומצה גליאלי פיברילי או GFAP. תמונות אלו מציגות צביעה אימונופלואורסצנטית מייצגת עבור GFAP, המוצג בצבע אדום, בתאי כוכב כבדיים שגודלו במשך שלושה ימים לאחר בידוד התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לבודד תאי כוכב כבדיים מכבד של נוירון כדי להגיע לתפוקה מספקת של תאי כוכב טהורים.חשוב להבטיח עיכול יעיל לאחר פרפוזיה של הכבד. לבסוף, חיוני לקבוע את הזהות הנכונה של התאים המבודדים על ידי הערכת המורפולוגיה והפנוטיפ של תאי הכבד.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

גזירת מבשרי neuroepithelial מ עובריים (ES) בתאי גזע באמצעות פעילות סטרומה תא הנגזרות גרימת (SDIA).

ES Cell-נגזר תא תרבויות Neuroepithelial

סרטון זה מדגים פרוטוקול להבחנה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לאבות המוח הקטן. זה כרוך בהעברת מושבות תאי גזע ללוחית התקשרות נמוכה במיוחד ליצירת גופים עובריים, קידום התמיינות עם גורמי גדילה, ולאחר מכן העברת גופי העובר לצלחת מצופה מטריצה להידבקות. השלבים הבאים כוללים גרימת נדידת תאים והוספת מדיום הבשלה כדי להנחות את התפתחותם של מבשרי תאי עצב גלוטמטרגיים ו- GABAergic cerebellar ואבות תאי Purkinje.

טכניקה ליצירת מונושכבה דו-ממדית של תאי המוח הקטן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

הריסנית הענקית Stentor coeruleus היא מערכת קלאסית לחקר התחדשות וריפוי פצעים בתאים בודדים. על ידי הדמיית תאי סטנטור בו זמנית בהגדלה נמוכה וגבוהה ניתן למדוד זרימות ציטופלזמיות לפני, במהלך ואחרי פציעה.

הדמיה של זרימה ציטופלזמית במהלך ריפוי פצע של תא בודד ב-Stentor coeruleus

מאמר זה מספק מתודולוגיות מפורטות לשימוש במבחנים תלת ממדי (3D) לכמת פלישת תאי סרטן השד. באופן ספציפי, אנו דנים בהליכים הנדרשים להקמת מבחני כאלה, כימות, וניתוח נתונים, וכן שיטות לבדיקת ההפסד של שלמות קרום המתרחש כאשר תאים לפלוש.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

ניתן להגדיר את הטרוגניות השעתוק בתוך תאי סטרומה שמקורם בשומן אנושי ברמת התא הבודד באמצעות סמני פני התא וגנים אוסטאוגניים.  אנו מתארים פרוטוקול המשתמש בזרימה ציטומטרית לבידוד תת-אוכלוסיות תאים עם פוטנציאל אוסטאוגני מוגבר, אשר עשוי לשמש לשיפור שחזור השלד הגולגולתי.

בידוד וההעשרה של אדם שומן המופק מתאי סטרומה לOsteogenesis משופר

יש תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) את היכולת הפנימית להבדיל עצמי לארגן לתוך דפוסי רקמה ייחודיים; אם כי זה דורש ההצגה הדרגתית סביבה המרחבית. אנו מציגים סטנסיל micropatterning כשיטה פשוט חזקה כדי ליצור הדרגתי ביוכימיות מכאניות לשליטת דפוסי בידול hPSC.

סטנסיל micropatterning של תאי גזע האנושי pluripotent עבור גשוש הארגון המרחבי של גורל הבידול

אנו מציגים פרוטוקול להצפנה באמצעות מיקרוסקופ STED בו-זמנית תמונה אקטין מבנים, microtubules של microtubule פלוס-end מחייב חלבונים בתאי B שהופצו על coverslips מצופה נוגדנים לקולטן B-cell, מודל עבור השלב הראשוני היווצרות מערכת החיסון סינפסה.

להמחיש את אקטין ואת Microtubule Cytoskeletons על הסינפסה B-cell המערכת החיסונית באמצעות מיקרוסקופ דלדול (STED) פליטה מאולצת

פרוטוקול זה מציג מערכת תרבות חדשנית, חזקה וניתן לשחזור כדי ליצור ולגדל ספרואידים תלת מימדיים מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2. התוצאות מספקות את הוכחת הרעיון הראשונה לצורך ההתאמה של גישה זו לחקר ביולוגיה של תאי גזע סרטן, כולל התגובה לכימותרפיה.

מודל תלת מימדי של ספרואידים לחקר תאי גזע סרטניים המעי הגס

שינויים פתופיזיולוגיים במערכת העצבים האוטונומית הלבבית, במיוחד בענף הסימפטי שלה, תורמים לתחזוקה ולתחזוקה של הפרעות קצב חדריות. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מראים כיצד לאפיין גרעינים כוכביים מורין כדי לשפר את ההבנה של התהליכים המולקולריים והתאים הבסיסיים.

מיקום, ניתוח וניתוח של גנגליון מורין סטלה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד והכתמה של תאי מח עצם מורין לפנוטיפ תאי גזע המופויטיים ותאי אב יחד עם תאי גזע אנדותל ומזנכימליים תומכים. כמו כן נכללת שיטה להעשרת תאים הממוקמים באזורי אנדוסטל ומח עצם מרכזי.

ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, טיהור ותרבות של תאים שוליים ראשוניים מ-stria vascularis של העכבר, וכן להקמת מודלים במבחנה של לחץ חמצוני והזדקנות תאית לחקר הפרעות בדופן הצדדית של השבלול.

בידוד ותרבות של תאי שוליים ראשוניים של Stria Vascularis מעכברים יילודים

למדו שיטה לאיסולציה של תאי כוכביים כבדיים מכבד עכברים באמצעות עיכול אנזימטי וסנטריפוגה בגרדיאנט צפיפות. הפרוטוקול מספק טוהר גבוה לתאים לשימוש במחקרי כבד ורפואה רגנרטיבית.

שבעה צעדים Stellate תאים

גלה סרטונים נוספים