שבעה צעדים Stellate תאים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי כוכב בכבד מכבד העכבר. זה מושג על ידי ביצוע ראשון ב-C שני זלוף של כבדי עכבר עם אנזימי עיכול. לאחר הזלוף, הכבדים נחתכים לחתיכות קטנות כדי להגביר את יעילות העיכול במבחנה, המתבצע לאחר מכן.

כשלב אחרון, תאי הכוכבים בכבד מופרדים מסוגי תאי כבד אחרים על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. בסופו של דבר, מתקבלים תאי כוכב בכבד וניתן להעריך את טוהרם על ידי מיקרוסקופ אור ואימונופלואורסצנטי מדגים את ההליך פטריק מאייר, סטודנט לתואר שני ממעבדה. כהכנה ל-NC שני זלוף של כבדי עכברים מחממים תחילה את ה-SC 1 buffer ותמיסות זלוף אנזים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הגדר את המשאבה הפריסטלטית כדי להשיג זרימה למינרית של 6.5 מיליליטר לדקה ולאזן את צינור הסיליקון של המשאבה עם תמיסת SC אחת. כעת ודא על ידי אובדן רפלקסים שהעכבר המורדם מורדם עמוק. ואז תקן את העכבר במצב שכיבה על בסיס מתאים.

השתמש במספריים ובמלקחיים כדי לבצע חתך אורכי בעור הבטן ולחשוף את הצפק. פתח בזהירות את הצפק והעבר את המעיים מחלל הבטן לצד שמאל של החיה על מנת לחשוף את וריד הפורטל. ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא זלוף זטו של הכבד עם אנזימי עיכול, אשר יודגמו.

לאחר מכן, חשוב להשתמש במיקרוסקופ סטריאו בעת החדרת הצינורית ולעקוב מקרוב אחר השינוי במבני הכבד במהלך הזלוף תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ סטריאו, הכנס את הצינורית של ערכת העירוי לווריד הפורטל. התחל את הזלוף של הכבד עם 30 מיליליטר של תמיסה אחת של SC. פתח את ה-Vanna Cava התחתון מיד לאחר התחלת הזרימה.

שטיפה מוצלחת של הכבד מסומנת על ידי אובדן צבע של רקמת הכבד לאחר מכן, עיין בכבד עם 30 מיליליטר של תמיסת Pronase E. אונות הכבד יתנפחו והאונות ייראו ברורות דרך הקפסולה לאחר שפע עם תמיסת פרונאז E עם 30 מיליליטר של תמיסת קולגנאז P. כאשר השפע עם קולגנאז P הושלם, קצרו את הכבד מהעכבר על ידי ניתוחו בזהירות מהסרעפת והאיברים שמסביב ואחסנו ב-70 מיליליטר של תמיסת SC 2 על קרח.

הכבד בשלב זה איבד את צורתו ונראה אטוני ואמורפי. הליך העיכול של כבדי עכבר צריך להתבצע בתנאים סטריליים. במכסה מנוע זרימה למינרית.

השתמש במספריים חדים כדי לחתוך את הכבדים לחתיכות של בערך שניים על שני מילימטרים מעוקבים. לאחר מכן שלבו את ההשעיה של 70 מיליליטר SC שתיים ואת חתיכות הכבד עם 50 מיליליטר תמיסת פרוטאז E קולגנאז P. מוסיפים מיליליטר אחד של DNA, תמיסה אחת מעכלים את הכבדים במשך 20 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי ערבוב.

לאחר עיכול אנזימטי של רקמת הכבד, תאי הכוכבים מופרדים מסוגי תאי כבד אחרים על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. כדי להתחיל בהליך זה, סנן את תרחיף התאים דרך מסננות תאים של 70 מיקרומטר לתוך שישה צינורות בז של 50 מיליליטר ושטוף את התאים עם צנטריפוגת חיץ E 2 למשך 10 דקות ב-600 G וארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה יש לשאוב בזהירות 40 מיליליטר של הסופרנטנט מכל צינור.

לאחר מכן הוסיפו 150 מיקרוליטר של DNA, תמיסה אחת לכל צינור והשעו מחדש את התאים. אחסנו את מתלי התאים לארבעה צינורות פלקון של 50 מיליליטר ושטפו עם צנטריפוגה G-B-S-S-P למשך 10 דקות ב-600 גרם וארבע מעלות צלזיוס. שאפו בזהירות כמה שיותר מהסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה והוסיפו 150 מיקרוליטר DNA תמיסה אחת לכל צינור.

אנו משעים את כדורי התא ב-10 מיליליטר של G-B-S-S-B לכל צינור. אחסנו את התאים לשני צינורות בז של 50 מיליליטר והוסיפו G-B-S-S-B לנפח כולל של 36 מיליליטר לשפופרת. מוסיפים 14 מיליליטר תמיסת מאורה לכל צינור ומערבבים היטב.

לאחר מכן, העבירו 10 מיליליטר ממתלה התא לצינור צנטריפוגה שיפוע אחד של 12 מיליליטר וכתוצאה מכך בסך הכל 10 צינורות. שכבו בעדינות את מתלה התא עם 1.5 מיליליטר G-B-S-S-B לכל צינור. צנטריפוגה את השיפועים למשך 15 דקות ב-1500 Gs וארבע מעלות צלזיוס ללא הפסקה.

לאחר מכן, הפטוציטים יושלכו בתחתית הצינור, ואילו תאי כוכב נמצאים בממשק כטבעת לבנה. בעזרת פיפטה של חמישה מיליליטר, קצרו בזהירות את הממשק המכיל את תאי הכוכבים והעבירו לצינור של 50 מיליליטר. שטפו את התאים על ידי הוספת G-B-S-S-B וצנטריפוזיה למשך 10 דקות בחום של 600 גרם וארבע מעלות צלזיוס.

שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב -20 מיליליטר של DMEM עם תוספי מזון. לאחר ספירת התאים, העבירו אותם לצלוחיות תרבית רקמה בריכוז של פי שניים 10 מהתאים הרביעיים לסנטימטר רבוע דוגרים על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כשעתיים לאחר הכנתם יש להיצמד לתאי הכוכב בכבד, לשנות את המדיה כדי לשטוף תאים מתים ופסולת תאים.

החזרת התאים לאינקובטור תוצאות מייצגות של הכנת תאי כוכב כבד מכבדי עכברים באמצעות פרוטוקול זה מוצגות כאן. תאים ביום הראשון וביום השלישי של תרבית חוץ גופית מראים את המורפולוגיה האופיינית של תאי כוכב בכבד. הם בצורת חזזית אסטרונומית ומציגים אחסון של שלפוחיות שומנים.

בכל אתרים גרעיניים, ניתן לאמת את טוהר תאי הכוכבים המבודדים בכבד גם על ידי ביטוי של חלבון חומצי סיבי גליה או GFAP. תמונות אלה מראות צביעה אימונו-פלואורסצנטית מייצגת עבור GFAP המוצגת באדום בתאי כוכב כבד, שעברו תרבית במשך שלושה ימים לאחר בידוד התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי כוכב כבד מכבד הנוירונים לתשואה נאותה של תאי כוכב טהורים.

חשוב להקפיד על עיכול יעיל עם זלוף כבד. לבסוף, חיוני לקבוע את הישות הנכונה של תאים מבודדים על ידי הערכת המורפולוגיה והפנוטיפ של תאי דאל בכבד.