בדיקת פעילות אנזימים מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה: טכניקה לקביעת פעילות פירופוספוקינאז במבחנה באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה

פירופוספוקינאז מזרז העברת דיפוספט או פירופוספט ממבשר נוקלאוטיד, כמו אדנוזין טריפוספט, ATP, למצע כמו גואנוזין דיפוספט, תמ"ג. זה יוצר גואנוזין טטרה-פוספט - מולקולת איתות חשובה.

כדי לקבוע את פעילות הפירופופוספוקינאז, הכינו תערובת תגובה הכוללת תמ"ג ו-ATPs מסומנים ברדיו במאגר מתאים בתוספת מגנזיום כלוריד. מוסיפים את הכמות הרצויה של פירופופוספוקינאז לתערובת התגובה ומדגרים.

עם הזמן, בנוכחות יוני מגנזיום, פירופופוספוקינאז מתחיל להעביר את חלק הפירוספט המסומן ברדיו מ-ATP לתמ"ג, ומייצר גואנוזין טטרה-פוספט רדיואקטיבי.

כעת, קח כרומטוגרפיה של שכבה דקה או TLC, צלחת מצופה מראש בפוליאתילנימין-תאית - שלב נייח מבוסס פולימר קטיוני. אתר את הנקודות של אנליטי תערובת התגובה ליד בסיס צלחת ה-TLC בנקודות זמן שונות כדי לעצור את התגובה ולהעריך את ההתקדמות.

טבלו את הצלחת בתא זכוכית המכיל אשלגן פוספט מונוביסי - ממס פאזה נייד. כאשר חזית הממס נעה כלפי מעלה, אנליטים טעונים שלילית מתחילים לנדוד על סמך זיקתם לפאזה הנייחת הטעונה חיובית.

ההבדלים במטענים השליליים ובמשקל של אנליטים זרחניים שונים קובעים את נדידתם היחסית על לוחית ה-TLC, ומאפשרים להם לשתק כרצועות נפרדות.

כאשר חזית הממס מגיעה למרחק הרצוי, הסר את הצלחת וייבש באוויר. מדוד את עוצמת האות הרדיואקטיבי, המתאימה לדלדול ATP המסומן רדיואקטיבית והצטברות גואנוזין טטרה-פוספט כדי לנתח את פעילות הפירופופוספוקינאז.

לפני ביצוע התגובה, הכינו לוחות כרומטוגרפיה בשכבה דקה של PEI-Cellulose על ידי שטיפתם במים נטולי יונים. מניחים את הצלחות בתא זכוכית עם מים מזוקקים כפולים, לעומק של כ- 0.5 סנטימטרים. לאחר שאפשרתם למים לנדוד לחלק העליון של הצלחת, הוציאו את הצלחות מתא הזכוכית והשאירו על מתלה ספסל לייבוש למשך הלילה.

סמן את הלוחות היבשים 2 סנטימטרים מקצה אחד בעזרת עיפרון רך, כדי לציין היכן יוחלו הדגימות עבור TLC. עבור 2 דגימות מיקרוליטר, יש למרוח דגימות במרחק של לא פחות מסנטימטר אחד זה מזה. בעת תכנון ניסויים, השאירו תמיד נקודה אחת בכל צלחת ללא שימוש, כדי לשמש נתיב ריק לכימות הדגימה.

כדי לבצע את בדיקת פעילות האנזים, הכן תגובות בודדות באמצעות ^γ-32P-ATP, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף את ה-RSH לאחר ערבוב הרכיבים האחרים, מכיוון שהוספת RSH לתערובת המכילה נוקלאוטידים יוזמת את בדיקת הפעילות האנזימטית.

כדי לשלוט בהידרוליזה של ATP מפעילות נוקלאז מזהמת, הרכיבו תגובה של 10 מיקרוליטר שאינה מכילה חלבון, ודגרו אותה במקביל. דגימות מיקרוליטר נקודתיות ב-t = 0, ובסוף הניסוי כדי לוודא שה-ATP לא עבר הידרוליזה בהיעדר חלבון.

מיד עם הוספת RSH, הסר 2 מיקרוליטר ואתר אותו על צלחת PEI-תאית המסומנת כדגימה t = 0 דקות.

דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, והסירו 2 מיקרוליטר בנקודות זמן רצויות. לאחר איסוף כל האליקוטים, בצע כרומטוגרפיה בשכבה דקה על ידי מילוי תא הכרומטוגרפיה ב-1.5 אשלגן פוספט מונו-בסיסי מולארי לעומק של 0.5 סנטימטרים. טבלו את הקצה התחתון של הצלחת בממס, ואפשרו לממס לנדוד לחלק העליון של הצלחת במשך כ-90 דקות.

הסר את הצלחת ממיכל הכרומטוגרפיה, והנח אותה על מתלה ייבוש ספסל לייבוש באוויר למשך הלילה. לאחר שהצלחת יבשה, עטפו את הצלחת בניילון פלסטיק כדי למנוע העברת חומר רדיואקטיבי לקלטת ההדמיה, ונתחו באמצעות אוטורדיוגרפיה.

חשוף את צלחת PEI-תאית המכילה תגובות מופרדות לקלטת זרחן למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. לאחר החשיפה, צלם את הקסטה על מצלמת זרחן.

באמצעות תוכנת הדמיה עם ממשק משתמש גרפי, צייר אזורי עניין, או החזר על ההשקעה, על-ידי בחירה תחילה באפשרות "צייר מלבן". לאחר מכן, השתמש בעכבר כדי לצייר החזר ROI מלבני סביב נתיב שלם אחד, ונקודות ה-ATP והגואנוסין טטרה-פוספט הכלולות בנתיב זה.

השתמש בפקודות "בחר, העתק והדבק" כדי לצייר החזר ROI זהה בתוך הנתיבים האחרים, כדי להבטיח שהחזר ה-ROI מודד אותות באזורים זהים בכל נתיב. כלול החזר ROI מנתיב שאינו בשימוש שישמש כריקים.

שימוש באפשרות "ניתוח | כלים | מנהל החזר השקעה | הוסף" פקודות של תוכנת ההדמיה, בחר את כל החזר ה-ROI המצויר על לוחית PEI-תאית. כעת, השתמש ב"ניתוח | הגדרת מידות | למדוד" כדי לכמת את עוצמת האות בתוך כל החזר ROI, ולייצא את המדידות כגיליון אלקטרוני. בגיליון האלקטרוני, הפחיתו ערכי החזר ROI ריקים מאותות ניסיוניים.