בדיקת פעילות אנזימים מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה: טכניקה לקביעת פעילות פירופוספוקינאז במבחנה באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה

פירופוספוקינאז מזרז העברת דיפוספט או פירופוספט ממבשר נוקלאוטיד, כמו אדנוזין טריפוספט, ATP, למצע כמו גואנוזין דיפוספט, תמ"ג. זה יוצר גואנוזין טטרה-פוספט - מולקולת איתות חשובה.

כדי לקבוע את פעילות הפירופופוספוקינאז, הכינו תערובת תגובה הכוללת תמ"ג ו-ATPs מסומנים ברדיו במאגר מתאים בתוספת מגנזיום כלוריד. מוסיפים את הכמות הרצויה של פירופופוספוקינאז לתערובת התגובה ומדגרים.

עם הזמן, בנוכחות יוני מגנזיום, פירופופוספוקינאז מתחיל להעביר את חלק הפירוספט המסומן ברדיו מ-ATP לתמ"ג, ומייצר גואנוזין טטרה-פוספט רדיואקטיבי.

כעת, קח כרומטוגרפיה של שכבה דקה או TLC, צלחת מצופה מראש בפוליאתילנימין-תאית - שלב נייח מבוסס פולימר קטיוני. אתר את הנקודות של אנליטי תערובת התגובה ליד בסיס צלחת ה-TLC בנקודות זמן שונות כדי לעצור את התגובה ולהעריך את ההתקדמות.

טבלו את הצלחת בתא זכוכית המכיל אשלגן פוספט מונוביסי - ממס פאזה נייד. כאשר חזית הממס נעה כלפי מעלה, אנליטים טעונים שלילית מתחילים לנדוד על סמך זיקתם לפאזה הנייחת הטעונה חיובית.

ההבדלים במטענים השליליים ובמשקל של אנליטים זרחניים שונים קובעים את נדידתם היחסית על לוחית ה-TLC, ומאפשרים להם לשתק כרצועות נפרדות.

כאשר חזית הממס מגיעה למרחק הרצוי, הסר את הצלחת וייבש באוויר. מדוד את עוצמת האות הרדיואקטיבי, המתאימה לדלדול ATP המסומן רדיואקטיבית והצטברות גואנוזין טטרה-פו