בדיקת דו-שכבתית ליפידית נתמכת מישורית: טכניקת מבחנה מבוססת מיקרוסקופיה לחקר הרכבת ספטין על חיקויי קרום ביולוגי

ספטינים הם חלבונים ציטוסקלטליים המהווים תחום קשירת GTP המוקף בתחומי אמינו וקרבוקסיל סופיים, עם יכולת טבועה להרכיב את עצמם לחוטים ומבנים מסדר גבוה יותר בקרום הפלזמה הפנימי לפונקציות תאיות מגוונות.

כדי לחקור אינטראקציות בין ממברנת ספטין במבחנה באמצעות חיקוי ממברנה ביולוגית, השג צינור מיקרו-צנטריפוגה חתוך. מרחו דבק אולטרה סגול על השפה השטוחה והלא חתוכה ומקמו אותו על כיסוי זכוכית שעבר טיפול בפלזמה. עם חשיפה לאור אולטרה סגול, הדבק מתרפא ויוצר תא תגובה פתוח.

העבירו לתוך החדר שלפוחיות ליפידים חד-פיטריוניות חד-פיזוריות בהרכב השומנים הרצוי, בתוספת חיץ המכיל קטיון חד-וערכי. קטיונים מקלים על שלפוחיות השומנים לספוג ולהצטבר על הכיסוי. יש לנער בעדינות את החדר, ליזום קרע בשלפוחית ולדגור.

השלפוחיות הקרועות נפרשות ומתמזגות לכיסוי דרך קבוצות הראש ההידרופיליות שלהן, ויוצרות כתמי שומנים דו-שכבתיים. שולי המדבקות גורמים לשלפוחיות הנותרות להיקרע, ויוצרים שכבת שומנים דו-שכבתית רציפה הנתמכת במישורית, SLB. הסר עודפי שלפוחיות לא נספגות עם חיץ מתאים.

לאחר מכן, הוסף תרחיף ספטין עם תווית פלואורסצנטית עם מאגר המכיל חומר צפיפות ודגירה. חומרי צפיפות מאפשרים לספטין להפקיד על הכיסוי המצופה SLB. בתנאים אופטימליים, ספטינים עשויים להתחבר לליפידים ב-SLB, ולהרכיב למבנים מאורגנים.

האירו באופן סלקטיבי את הכיסוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת כדי לעורר מחיצות עם תווית פלואורסצנטית דבוקה על ה-SLB כדי לצפות במכלול ספטין.

כדי להתחיל בניקוי פלזמה של המגלשות, נקה את מנקה הפלזמה למשך 5 דקות עם חמצן כדי להוציא אוויר מהקווים והתא. מסדרים שקופיות זכוכית לכיסוי יבש לעריסת קרמיקה. בזמן הטיהור, הזרם גז אינרטי על מגלשות זכוכית כיסוי המיקרו כדי להסיר אבק וחלקיקים.

הנח את העריסה בחלק האחורי של תא הפלזמה כך שהכיסויים יהיו מקבילים לקצה הארוך של החדר. הפעל את שואב הפלזמה למשך 15 דקות עם חמצן בעוצמה מרבית.

להכנת החדר, חתכו את המכסה ממש מתחת לחלק החלבי של צינור PCR בנפח 0.2 מיליליטר. צבעו את שפת צינור ה-PCR בדבק המופעל על ידי UV, הימנעו מהחלק הפנימי של הצינור. הנח בעדינות את צינור ה-PCR המודבק במרכז כיסוי מנוקה בפלזמה, ולאחר מכן, הנח את התא תחת אור UV באורך גל ארוך למשך 5 עד 7 דקות כדי לרפא את הדבק.

ליצירת שכבה דו-שכבתית, הוסף את הריאגנטים לבאר. נער בעדינות את התאים מצד לצד כדי לשבש את רכבי השטח, ולאחר מכן, דגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר הדגירה יש לשטוף את השכבה הדו-שכבתית 6 פעמים עם 150 מיקרוליטר SLBB, על ידי פיפטינג כדי לשטוף עודפי שומנים. לאחר מכן, שטפו את השכבה הדו-שכבתית 6 פעמים עם 150 מיקרוליטר של מאגר תגובה, לפני הדגירה עם הספטין.

בשלב הכביסה האחרון, הסר את מאגר התגובה והשאיר 75 מיקרוליטר בבאר. הוסף 25 מיקרוליטר של ספטין מדולל ב-SSB, ותמונה על ידי מיקרוסקופ TIRF.