Bilayers מישורי נתמכות עבור תצורת לימוד של סינפסות החיסונית Kinapse

היי, אני מייק דסטין ממכון ג'רל ובית הספר לרפואה של אוניברסיטת ניו יורק. היום אני אקח אותך בתהליך של יצירת ביוליי מישורי תומך לחקר הסינפסה החיסונית. אז בואו נתחיל.

כדי להפוך את שכבת השומנים הדו-שכבתית, אנו מכינים תמיסה של 20% ניקל, שומן כלאטי ו-80% פוספטידילכולין בכמויות המתאימות בצינור זכוכית עם מיליליטר עד שני מיליליטר של מתנול כלורופורם. השלב הראשון הוא אידוי הממס מתחת לזרם גז חנקן באמבט מים חם של 30 עד 37 מעלות צלזיוס. זה בדרך כלל לוקח בערך 15 דקות.

לאחר מכן הסר את כל הממס שנותר בוואקום גבוה באמצעות ליופילייזר למשך 90 דקות. לאחר מכן, ממיסים את השומנים במאגר מלח של חומר ניקוי גלוקוציד אוקטלי 2%N לריכוז סופי של 0.4 מילימולר. זה יוצר תמיסה של תאי פוספוליפיד מעורבבים ליצירת ליפוזומים.

אתה עושה דיאליזה לתמיסה זו כנגד שלושה שינויים של תמיסת מלח כדי להסיר חומר ניקוי וליצור ליפוזומים. בדרך כלל אנו עובדים עם נפחים בסדר גודל של מיליליטר אחד עם צינורות בקוטר שישה מילימטר עם חתך סביב 10 קילודלטון ומקפידים לא לכלול בועות אוויר בזמן הידוק הצינור. אנו מסננים תמיסה זו באופן סטרילי ומבצעים את הדיאליזה בתנאים נקיים ומטפלים בה באמצעות כפפות מעוקרות אתנול 70%.

תמיסה זו צריכה להיות צלולה ומאוחסנת תחת גז ארגון כדי למנוע חמצון. אם הפתרון עכור, אז יצרת שלפוחיות מרובות קירות ואתה צריך להתחיל מחדש. על מנת לבצע את הניסוי, עלינו לקבוע תחילה כמה ICAM אחד ו-MHC מופקדים על שטח פנים נתון של ניקל כלאט דו-שכבתי בריכוז נתון של חלבון מסיס.

לשם כך אנו מפקידים שכבות דו-שכבתיות על חמש מהירויות זכוכית בקוטר מיקרומטר. דגרו את חרוזי הזכוכית בתמיסות חלבון בתנאים הקרובים לאלה בתאי הזרימה המשמשים להדמיה, ולאחר מכן קראו את צפיפות החלבון הקשור על ידי בדיקה אימונו-פלואורומטרית זרימה. נוגדנים המסומנים ב-FSI עם מספרים ידועים של פלואורסצאין לכל מולקולה משמשים לאיתור החלבונים הקשורים לפני השטח וחרוזים סטנדרטיים של פלואורסצאין משמשים לכיול המיקרו-פלואורסצאין של הזרימה.

אנו נקבע תנאים הקרובים לאלה בתאים המציגים אנטיגן עם 200 מולקולות למיקרומטר רבוע של ICAM אחד ו-0.2 עד 20 מולקולות לריבוע. מיקרומטר של I-E-K-M-C-C 91 1 0 3, שכבות דו-שכבתיות מישוריות מורכבות נוצרות באופן ספונטני כאשר הליפוזומים מתמזגים לזכוכית, אך רק אם מנקים אותה כראוי לניקוי זכוכית. אנו משתמשים בתמיסת חומצה פיאנה, תערובת טרייה שהוכנה של חומצה גופרתית ומי חמצן 30%, ההורסת את כל החומר האורגני וגם משאירה את משטח הזכוכית הידרופילי מאוד.

בעבודה עם פיראנה, אנו לובשים ביגוד מגן מלא, כולל סינר חומצה וכפפות עמידות לחומצה כבדה. יש להפריד בזהירות את הפסולת מהפסולת האורגנית ולהשליך אותה כראוי. להכנת תמיסת פיראנה החומצה, הוסיפו 75 מיליליטר חומצה גופרתית מרוכזת לכוס יבשה ואז הוסיפו בזהירות 25 מיליליטר מי חמצן 30%.

התמיסה מתחממת במהירות ליותר מ -100 מעלות צלזיוס, ואז טובלים את החלקות הכיסוי היבש בתמיסה למשך 15 דקות. לאחר הדגירה הזו בפיראנה, טבלו את החלקות הכיסוי במים מטוהרים ולאחר מכן שטפו אותן במשך דקה מכל צד. לאחר מכן יבש את החלקות הכיסוי באמצעות מקור ואקום כדי לנקז את המים המטוהרים.

הניחו לתמיסת הפיראנה להתקרר והוסיפו למיכל פסולת הפיראנה, שנותר עם מכסה רופף, מסומן היטב במכסה האדים ליצירת הדו-שכבות. המעבדה שלנו משתמשת בשני תאים של bi FCS, שיש להם את היתרונות של חימום משולב. מערכת FCS two נמצאת על בסיס נירוסטה המחבר יחד סעפת מיקרופלואידית עם אטם עליון של 0.5 מילימטר, מגלשת מיקרו אמת מים מצופה תחמוצת פח אינדיום לחימום על משטח אחד ועם חריץ נוזלי בצד השני.

אטם נטול אבק של 0.25 מילימטר המגדיר את גובה תא הזרימה והחלקת כיסוי עגולה של 40 מילימטר שעליו נוצרת השכבה הדו-שכבתית להרכבת תא הזרימה ויצירת שכבות דו-שכבתיות מישוריות. הניחו את הסעפת כשהצינורות מכוונים כלפי מעלה על משטח ישר. לאחר מכן הנח את אטם ה-0.5 מילימטר עם חורים הממוקמים מעל צינורות הנוזל וודא שהוא יושב שטוח.

הנח בעדינות את מגלשת המיקרו אקוודוקט כשהתעלות הנוזליות פונות כלפי מעלה וודא שהיא יושבת שטוחה מבלי להפעיל לחץ כלפי מטה עד לוודא שהחורים במגלשה מיישרים את הצינורות המיקרופלואידיים. לאחר מכן הנח את האטם נטול האבק של 0.25 מילימטר עם חתך מלבני על גבי מגלשת המיקרו אמת המים כך שהתעלה מיושרת עם התעלות הנוזליות ואין חללי אוויר גדולים, הניחו עד חמש טיפות של מיקרוליטר אחד של תרחיף ליפוזום על פני מגלשת המיקרו אמת המים בתבנית כך שהמרחק ממרכז למרכז בין כל טיפה הוא 2.5 מילימטרים. לחמש טיפות הליפוזום עשויות להיות הרכבים שונים, אך במקרה זה ניצור רק שתי שכבות, אחת ללא שומנים כלאטיים של ניקל, ואחת עם שומנים של 10% ניקל.

לאחר שהטיפות הללו במקומן, הנח בזהירות את הכיסוי החליק על פני השטח בתנועה אחת, מהדק על הבסיס במהירות האפשרית. טיפות הליפוזום צריכות ליצור מגע עם החלקת הכיסוי. אין לשבור מגע זה מכיוון שככל הנראה הדו-שכבות כבר נוצרו וכל הפרעה עלולה לגרום לשכבות דו-שכבתיות פגומות.

בשלב זה, חשוב לזכור לסמן את מיקומי הדו-שכבות בכמה כתמי דיו קטנים על השקופית כדי לסייע במיקום החלקת הכיסוי במיקרוסקופ. המתן 20 דקות כדי לוודא שהמערכת מאוזנת להעביר את כל הפתרונות באמצעות מזרק של 20 מיליליטר המחובר לכ-20 סנטימטרים של צינורות גמישים וזין עצירה תלת-כיווני. לאחר מכן מחוברת יציאה נוספת של זין העצירה לתא הזרימה באורך קצר של צינור כדי למזער את הנפח המת בין תא העצירה לתא הזרימה.

מלאו את המזרק בתמיסת מלח מאוחדת המכילה מגנזיום כלוריד, גלוקוז סידן כלוריד ואלבומין בסרום אנושי. יש להניח את הצינור ולעצור את הזין כך שלא יהיו בועות אוויר. לאחר מכן חבר את זה לתאי הזרימה ודחף דרך חמישה מיליליטר בתנועה אחת תוך כדי צפייה כדי לוודא שלא עוברות בועות אוויר מעל השכבה הדו-שכבתית.

עכשיו יהיה לך את השכבות הדו-שכבתיות שלך להכניס את החלבונים המתויגים לתוך השכבה הדו-שכבתית. ראשית יש לחסום אותו עם קאסן ולהטעין אותו בניקל. מלאו מזרק של מיליליטר אחד בתמיסת יון ניקל קסן וחברו אותו ליציאת הצד מבלי ללכוד בועות אוויר.

לאחר הזרקת התמיסה, המתן 20 דקות כדי לאפשר חסימה מלאה. לאחר מכן שטפו את תמיסת החסימה עם H-B-S-H-S-A ממזרק 20 מיליליטר. כעת הזרקו 0.5 מיליליטר של תמיסת H-B-S-H-S-A המכילה את הפוליהיס המתויג ICAM ONE ו-IEK.

בניסוי זה, ה-ICAM מסומן ב-SCI 5. אז ניתן לעקוב אחר ה-LFA ICAM אחד אינטראקציות על ידי הדמיה של ה-ICAM סידור מחדש אחד בשכבה הדו-שכבתית לאפשר 30 דקות לחלבון לקשור את הדו-שכבתי הטעונה בניקל בזמן שהחלבון נצמד לשכבה הדו-שכבתית. אבטח את תא הזרימה למיקרוסקופ ההפוך באמצעות תוספת שלב מותאמת אישית.

לאחר מכן חבר את אלקטרוניקת החימום כדי לאפשר למערכת להתאזן ב -37 מעלות צלזיוס. השתמש בסימנים שנעשו קודם לכן כדי למקם את תא הזרימה כך שהמטרה מיושרת עם אחת השכבות הדו-שכבתיות והשתמש במיקרוסקופ השתקפות הפרעות כדי לאתר את מישור המוקד על ידי התמקדות בתמונת האור המוחזר של דיאפרגמת השדה. לבסוף, שטפו את ה-ICAM הלא קשור מתאי הזרימה.

רכוש תמונות פלואורסצנטיות של השכבה הדו-שכבתית בערוץ ICAM אחד במצבי דשא M ושדה רחב. זאת כדי לאשר ICAM כריכה אחת על השכבה הדו-שכבתית המצופה ניקל ביחס לשכבה הדו-שכבתית נטולת הניקל. תא הזרימה מוכן כעת לקלוט תאים.

לצורך הדגמה זו, נשתמש בתאי T טרנסגניים של קולטן תאי T ND שהומרו עם ציפוי ENC רטרו-וירוס GFPs P zap 70, נשטוף את התאים פעם אחת עם H-B-S-H-S-A ולאחר מכן נדגור את התאים עם Alexa 5 68 המסומן FAB לקולטן תאי T כדי שנוכל לעקוב אחר אשכולות המיקרו של TCR. לאחר 15 דקות, יש לדלל את התאים מאחד עד 10. זה מדלל את נוגדן H 57 מספיק כדי שלא יפריע להדמיית דשא M, אך שומר על הרוויה של קולטן תאי ה-T כאשר ה-fab הקשור בתחילה מתחיל להתנתק, ואז מזריק אותם לתא הזרימה.

אנו מדמים את הסינפסה האימונולוגית במצב M של שלושה צבעים. זה כולל את היווצרות ה-LFA אחד, אינטראקציה אחת של ICAM, היווצרות אשכולות TCR ו-C smac והיווצרות מתמשכת של מיקרו-אשכולות TCR, המגייסים GFP ZAP 70. חלק מהתוצאות הללו ברורות במהלך הרכישה, בעוד שאחרות ידרשו ניתוח לאחר עיבוד כדי להעריך במלואן.

אוקיי, זה עתה הראינו לכם כיצד להשתמש בשכבות דו-שכבתיות מישוריות נתמכות כדי לחקור את הסינפסה החיסונית. חשוב מאוד שהניסויים הללו יעבדו שתאי ה-T במצב טוב מאוד ותמיסת המלח המבודדת PPS אינה מתאימה במיוחד לתרבית תאי T לטווח ארוך. אז אתה רוצה להוציא את התאים מהתרבית, להכניס אותם למדיה הזו, ואז להשתמש בהם במהירות רבה.

אם אתה מגלה שאתה רוצה לעשות ניסויים לטווח ארוך יותר, יש כמה פורמולות טובות מאוד ללא חומר סרום שתוכל להחליף בתמיסת מלח חוצצת. זה ישמור על התאים בחיים הרבה יותר זמן אם אתה רוצה לעשות נקודת קצה ארוכה יותר, כגון ייצור ציטוקינים או התפשטות של תאי T. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.