Bilayers מישורי נתמכות עבור תצורת לימוד של סינפסות החיסונית Kinapse
15 בספטמבר 2008
Bilayers מישוריים נתמכים הם כלים רבי עוצמה שיכולים לשמש מודל אינטראקציות מולקולריות בסינפסה האימונולוגית. כאן, אנו מציגים שיטות לעיגון הידבקות התא חלבונים ידועים לווסת היווצרות הסינפסה לעלון העליון של bilyer השומנים ולדמיין היווצרות הסינפסה באמצעות מיקרוסקופ TIRF.
שלום, אני מייק דסטין מהמכון ג'ראל ומבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ניו יורק. היום אדריך אתכם בתהליך היצירה של שכבה ביולוגית מישורית תומכת (supportive planar Biolay) למחקר של הסינפסה האימונולוגית. אז בואו נתחיל.
כדי להכין את השכבה הליפידית הד双לית, נכין תמיסה של 20% nickel chelating lipid ו-80% phosphatidylcholine בכמויות המתאימות בתוך מבחנה מזכוכית עם 1 עד 2 מיליליטר של chloroform methanol. השלב הראשון הוא אידוי הממס תחת זרם של גז חנקן באמבט מים חם בטמפרטורה של 30 עד 37 °C. תהליך זה אורך בדרך כלל כ-15 דקות.
לאחר מכן, הסירו כל שארית של ממס תחת ואקום גבוה באמצעות ליופיליזטור למשך 90 דקות. לאחר מכן, המיסו את הליפידים בבופר סליין עם דטרגנט octyl glucoside בריכוז 2%N עד לריכוז סופי של 0.4 millimolar. פעולה זו יוצרת תמיסה של מיצלים מעורבים של דטרגנט ופוספוליפידים ליצירת ליפוזומים.
יש לבצע דיאליזה לתמיסה זו אל מול שלושה החלפות של tris saline כדי להסיר את הדטרגנט ולהגבש ליפוזומים. בדרך כלל אנו עובדים עם נפחים בסדר גודל של מיליליטר אחד, תוך שימוש בצינורית בקוטר שש מילימטרים עם סף חיתוך (cutoff) של כ-10 kilodaltons, תוך הקפדה למנוע היווצרות בועות אוויר בעת סגירת הצינורית. אנו מסננים את התמיסה בסינון סטרילי, מבצעים את הדיאליזה בתנאים נקיים ומטפלים בה באמצעות כפפות שעברו עיקור ב-70% ethanol.
תמיסה זו צריכה להיות צלולה כבדולח ומאוחסנת תחת גז ארגון כדי למנוע חמצון. אם התמיסה עכורה, סימן שנוצרו שלפוחיות רב-דופניות ויש להתחיל מחדש. כדי להגדיר את הניסוי, עלינו לקבוע תחילה כמה ICAM 1 ו-MHC שוקעים על שטח פנים נתון של שכבה כפולה בעלת קיליציה של ניקל בריכוז נתון של חלבון מסיס.
כדי לעשות זאת, אנו ממיצעים שכבות כפולות על חרוזי זכוכית בעובי חמישה מיקרומטרים. נדגיר את חרוזי הזכוכית עם תמיסות חלבון בתנאים המקרבים את התנאים בתאי הזרימה המשמשים לדימוי, ולאחר מכן נמדוד את צפיפות החלבון הקשור באמצעות בדיקת אימונו-פלואורימטריה בזרימה. נוגדנים מסומני FSI עם מספרים ידועים של פלואורסצאין למולקולה משמשים לזיהוי החלבונים הקשורים לפני השטח, וחרוזי סטנדרט של פלואורסצאין משמשים לכיול המיקרו-פלואורימטר של הזרימה.
נקבע תנאים המדמים את אלה של תאים מציגי אנטיגן, עם 200 מולקולות למיקרומטר רבוע של ICAM-1 ו-0.2 עד 20 מולקולות למיקרומטר רבוע של קומפלקס I-E-K-M-C-C 91 1 0 3. שכבות דו-שכביות מישוריות נוצרות באופן ספונטני כאשר הליפוזומים מתמזגים עם זכוכית, אך זאת רק אם הזכוכית נוקתה כראוי. אנו משתמשים בתמיסת Piranha חומצית, תערובת שהוכנה טרי מהחומצה הגופרית ו-30% מימן פראוקסיד, אשר משמידה את כל החומר האורגני וגורמת לפני השטח של הזכוכית להיות הידרופיליים מאוד.
בעת עבודה עם תמיסת פיראנה (piranha), אנו לובשים ביגוד מגן מלא, הכולל סינר עמיד לחומצה וכפפות עבודה כבדות עמידות לחומצה. יש להפריד את הפסולת בזהירות מפסולת אורגנית ולהשליכה באופן מותאם. להכנת תמיסת חומצת הפיראנה, הוסיפו 75 milliliters של חומצה גופרית רכז לכלי שיקוף יבש, ולאחר מכן הוסיפו בזהירות 25 milliliters של 30% hydrogen peroxide.
התמיסה מתחממת במהירות לטמפרטורה הגבוהה מ-100 °C, לאחר מכן טבול את כיסוי הזכוכית היבש בתמיסה למשך 15 דקות. בעקבות דגירה זו בפיראנה (piranha), טבול את כיסויי הזכוכית במים מזוקקים ולאחר מכן שטוף אותם במשך דקה מכל צד. לאחר מכן יבש את כיסויי הזכוכית באמצעות מקור ואקום כדי לנקז את המים המזוקקים.
יש להמתין שפתרון הפיראנה יתקרר ולהעבירו למכל פסולת הפיראנה, שנותר עם מכסה רפוי ומסומן בבירור במנדף, כדי להכין את השכבות הכפולות. המעבדה שלנו משתמשת בשני תאי bi FCS, הבעליים את יתרונות החימום המשולב. מערכת ה-FCS two מונחת על בסיס פלדת אל חלון המהדק יחד끔 סבב מיקרופלואידי עם אטם עליון בעובי 0.5 millimeter, ושקופית מיקרו-אקוודוקט מצופה אינדיום-בדיל-תחמוצת לחימום בצד אחד, ובעלת חריץ זרימה בצד השני.
אטם נקי מאבק בעובי 0.25 מילימטר המגדיר את גובה תא הזרימה, וזכוכית כיסוי עגולה בקוטר 40 מילימטר שננקתה בתמיסת פיראנה ועליה נוצר השכבה הכפולה (bilayer), להרכבת תא הזרימה ויצירת שכבות כפולות מישוריות. הנח את המניפולד כאשר הצינורות מופנים כלפי מעלה על משטח שטוח. לאחר מכן, הנח את האטם בעובי 0.5 מילימטר כך שהחורים ממוקמים מעל צינורות הנוזלים, וודא שהוא מונח בצורה שטוחה.
הניחו בעדינות את שקופית המיקרו-אקוודוקט (micro aqueduct slide) כאשר התעלות הפלואידיות פונות כלפי מעלה, וודאו שהיא מונחת בצורה שטוחה מבלי להפעיל לחץ כלפי מטה, עד לווידוא שחורי השקופית מיושרים עם הצינורות המיקרופלואידיים. לאחר מכן, הניחו את האטם נטול האבק בעובי 0.25 millimeter עם החיתוך המלבני על גבי שקופית המיקרו-אקוודוקט, כך שהתעלה מיושרת עם התעלות הפלואידיות ושאין חללי אוויר משמעותיים. הניחו עד חמש טיפות של 1 µL של תמיסת ליפוזומים על פני שקופית המיקרו-אקוודוקט, בתבנית שבה המרחק ממרכז למרכז בין כל טיפה הוא 2.5 millimeters. חמש טיפות הליפוזומים עשויות להיות בעלות הרכבים שונים, אך במקרה זה נבנה רק שני דו-שכבות (bilayers), אחת ללא ליפידים קשרי-ניקל (nickel chelating lipids), ואחת עם 10% ליפידים קשרי-ניקל.
לאחר שטיפות אלו במקומן, הנח בזהירות את מכסית הזכוכית על פני השטח בתנועה אחת, והצמד אותה לבסיס במהירות האפשרית. טיפות הליפוזומים חייבות לבוא במגע עם מכסית הזכוכית. אין להפריע למגע זה מכיוון ששכבות הדו-שכבה (bilayers) כנראה כבר נוצרו, וכל הפרעה עלולה להוביל ליצירת דו-שכבות פגומות.
בשלב זה, חשוב לזכור לסמן את מיקומי השכבות הכפולות באמצעות מספר נקודות קטנות של דיו על השקופית, כדי לסייע במיקום של זכוכית הכיסוי על המיקרוסקופ. המתינו 20 דקות כדי לוודא שהמערכת הגיעה לשיווי משקל; העבירו את כל התמיסות באמצעות מזרק של 20 milliliter המחובר לכ-20 centimeters של צינור גמיש וברז Three-way. פתח נוסף של הברז מחובר לאחר מכן לתא הזרימה באמצעות קטע צינור קצר, כדי למזער את הנפח המת ברווח שבין הברז לתא הזרימה.
מלאו את המזרק בתמיסת saline חוצבת (buffered saline) המכילה מגנזיום כלוריד, סידן כלוריד, גלוקוז ואלבומין של סרום אנושי. רססו (Prime) את הצינורית ואת הברז כדי להבטיח שאין בועות אוויר. לאחר מכן, חברו זאת לתאי הזרימה ודחפו חמישה מיליליטרים בתנועה אחת, תוך מעקב כדי לוודא ששום בועת אוויר אינה עוברת מעל השכבה הכפולה (bilayer).
כעת, כאשר השכבות הכפולות מוכנות, ניתן להחדיר אליהן את החלבונים בעלי תג His. ראשית, יש לחסום אותן באמצעות קזאין ולהטעין אותן בניקל. מלאו מזרק של 1 mL בתמיסתו של קזאין-יוני ניקל, וחברו אותו לפתח הצדדי תוך הקפדה על אי-כליאת בועות אוויר.
לאחר הזרקת התמיסה, המתן 20 דקות כדי לאפשר חסימה מלאה. לאחר מכן, שטוף את תמיסת החסימה באמצעות H-B-S-H-S-A מהמזרק של 20 מיליליטר. כעת, הזרק 0.5 מיליליטר של תמיסת H-B-S-H-S-A המכילה ICAM one ו-IEK המסומנים ב-polyhis.
בניסוי זה, ICAM one מסומן באמצעות SCI five. לפיכך, ניתן לעקוב אחר האינטראקציות בין LFA one ל-ICAM one על ידי דימוי של ארגון מחדש של ICAM one בשכבה הדו-שכבתית. המתן 30 דקות כדי שהחלבון ייקשר לשכבה הדו-שכבתית הטעונה בניקל, בזמן שהחלבון נצמד לשכבה.יצב את תא הזרימה למיקרוסקופ ההפוך באמצעות רכיב ביניים מותאם אישית לבמה.
לאחר מכן, חברו את רכיבי החממה כדי לאפשר למערכת להגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 37 °C. השתמשו בסימונים שנעשו קודם לכן כדי למקם את תא הזרימה כך שהעדשה תהיה מיושרת עם אחת השכבות הכפולות, והשתמשו במיקרוסקופיית השחלה של מחזירים (interference reflection microscopy) כדי לאתר את מישור המוקד על ידי מיקוד בתמונת האור המוחזר של דיאפרגמת השדה. לבסוף, שטפו את ה-ICAM 1 שאינו קשור מתאי הזרימה.
רכשו תמונות פלואורסצנציה של השכבה הכפולה בערוץ ICAM 1 במצבי turf M ו-widefield. זאת כדי לאשר את קישור ה-ICAM 1 לשכבה הכפולה המצופה בניקל ביחס לשכבה הכפולה ללא ניקל. תא הזרימה מוכן כעת לקבלת תאים.
עבור הדגמה זו, נשתמש בתאי T טרנסגנ icy של רקספטור תאי T מסוג ND אשר עברו טרנסדוקציה עם רטרו-וירוס ENC המצופה ב-GFPs P zap 70, נשטוף את התאים פעם אחת עם H-B-S-H-S-A ולאחר מכן נדגיר את התאים עם FAB המסומן ב-Alexa 5 68 לרספטור תאי ה-T כדי שנוכל לעקוב אחר מיקרו-קלאסטרים של TCR. לאחר 15 דקות, נדלל את התאים ביחס של 1 ל-10. דילול זה מדלל את הנוגדן H 57 מספיק כדי שלא יפריע לדימות turf M, אך שומר על רוויה של רספטור תאי ה-T בעוד ה-fab שנקשר בתחילה מתחיל להתנתק, ולאחר מכן נזריק אותם לתא הזרימה.
אנו מדמיינים את הסינפס האימונולוגי במצב Turf M בשלושה צבעים. הדבר כולל את היווצרות האינטראקציה בין LFA-1 ל-ICAM-1, היווצרות אשכולות TCR ואת ה-c-SMAC, ואת היווצרותם המתמשכת של מיקרו-אשכולות TCR, המגייסים GFP-ZAP70. חלק מתוצאות אלה ברורות כבר במהלך הרכישה, בעוד שאחרות ידרשו ניתוח בעיבוד לאחר הרכישה כדי להערכתון באופן מלא.
ובכן, הרגע הצגנו בפניכם כיצד להשתמש בשכבות דו-שכבתיות מישוריות נתמכות (supported planar bilayers) כדי לחקור את הסינפסה האימונולוגית. כדי שניסויים אלו יצליחו, חשוב מאוד שתאי ה-T יהיו במצב תקין וטוב, שכן תמיסת ה-PPS buffered saline אינה מתאימה לתרבית תאי T לטווח ארוך. לכן, עליכם להוציא את התאים מהתרבית, להעבירם למדיום זה, ולהשתמש בהם במהירות.
אם תמצאו שאתם מעוניינים לבצע ניסויים לטווח ארוך יותר, קיימים תרכיבי מצע ללא סרום טובים מאוד שניתן להחליף בהם את ה-phosphate buffered saline. הדבר ישמור על חיויות התאים למשך זמן רב יותר אם ברצונכם לבחון נקודות סוף רחוקות יותר, כגון ייצור ציטוקינים או פרוליפרציה של T cells. זהו כל הפרוטוקול.
תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטות ליצירת שכבות ביליפייד מישוריות נתמכות למחקר של סינפסים אימונולוגיים. הדגש הוא על עיגון חלבוני הידבקות תאיים לשכבת הליפידים וויזואליזציה של היווצרות הסינפס באמצעות מיקרוסקופיית TIRF.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
רקע
- שכבות דו-שכבתיות מישוריות נתמכות הן מודלים יעילים לחקר אינטראקציות מולקולריות.
- סינפסים אימונולוגיים ממלאים תפקיד מכריע בתגובות חיסוניות.
- חלבוני היצמדות תאיים הם מרכיבים מפתח ביצירת סינפסים.
- מיקרוסקופיית TIRF מאפשרת ויזואליזציה מפורטת של דינמיקה סינפטית.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטות לעיגון חלבונים לשכבות דו-שומניות של ליפידים.
- ויזואליזציה של היווצרות סינפסים אימונולוגיים.
- העמקת ההבנה של אינטראקציות סינפטיות בתאי מערכת החיסון.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת שכבה ליפידית כפולה תוך שימוש בהרכב ליפידים ספציפי.
- אידוי של ממסים ליצירת השכבה הכפולה.
- שימוש במיקרוסקופיית TIRF לצורך ויזואליזציה.
- עיגון של חלבוני היצמדות תאית לשכבה הכפולה.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של שכבות בי-ליפיד מישוריות נתמכות.
- הדמיה של דינמיקת היווצרות הסינפסים.
- הדגמה של תפקידן של חלבוני היצמדות ביציבות הסינפסיס.
- תובנות לגבי אינטראקציות מולקולריות בסינפסיס האימונולוגי.
מסקנות
- שכבות דו-שכבתיות פלנריות נתמכות הן בעלות ערך לחקר סינפסים אימונולוגיים.
- השיטות שפותחו יכולות לסייע במחקרים עתידיים על תגובות חיסוניות.
- הבנת תהליך היווצרות הסינפסיס עשויה להוביל להתקדמות בתחום האימונולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שכבות דו-שכבתיות מישוריות נתמכות מאפשרות הפחתת סיכונים מכניסטית של מודלים של סינפס אימונולוגי, על ידי אספקת מערכת רדוקציוניסטית לבידוד אינטראקציות בין רספטור לליגנד. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות באימונולוגיה באמצעות כימות דינמיקת קישור וארגון מרחבי של מולקולות היצמדות ואיתות. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית הניתנת לשחזור של מנגנוני הפעלה של תאי T לפני זיהוי המולקולה המובילה (lead).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי בקרת צפיפות והרכב הליגנדים כדי לחקות משטחים של תאים מציגי אנטיגן.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות ויזואליזציה ישירה של אתרי מיון, קיבץ (clustering) ופירוק של רצפטורים.
- ערך מדעי: מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד משתנים כגון אינטראקציות בין ICAM-1 ו-TCR-pMHC בסביבה ביוכימית מוגדרת.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך תפעולי: הכנה של מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור שלבי עבודה המשכיים, על ידי סטנדרטיזציה של השקעת חלבונים על שכבות כפולות עם קלטי ניקל.
- ערך תפעולי: מתאפשרת סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות כיול אימונו-פלואורומטרי זורמי כמותי של צפיפות החלבון הקשור.
- ערך תפעולי: תמיכה במוכנות לסריקה על ידי יצירת שכבות כפולות בעלות הרכבי ליפידים מוגדרים (למשל, 10% ליפידים קולטי ניקל) לצורך מחקרי אינטראקציה עקביים של לימפוציטים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: שומר על רלוונטיות למחלה על ידי מידול של יצירת סינפסה אימונולוגית תוך שימוש בצפיפויות חלבון רלוונטיות פיזיולוגית (200 מולקולות ICAM-1 ו-0.2–20 מולקולות I-E-K-M-C-C ל-μm²).
- ערך תרגומי: מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי קישור בין אינטראקציות מולקולריות לתוצאות פונקציונליות, כגון יצירת מיקרו-קלאסטרים של TCR וגיוס ZAP-70.
- ערך תרגומי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי כימות יציבות הסינפסה ודינמיקת האותות תחת תנאים מבוקרים.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי אספקת קריאות כמותיות מבוססות דימוי של מעורבות קולטן והפעלת אותים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן שליטה מדויקת בהצגת ליגנדים ובדימוג בזמן אמת של התהוות סינפסה אימונולוגית.
- סריקה: מספקת מוכנות של הבדיקה וחזרתיות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים ליצירת שכבה כפולה ועיגון חלבונים באמצעות ליפידים קלטי Ni²⁺ וחלבונים עם תג polyhistidine.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות באמצעות TIRF ודימוג פלואורסצנציה בשטח רחב למעקב אחר ארגון מחדש של חלבונים, היווצרות אשכולות וגיוס חלבוני איתות (למשל, GFP-ZAP-70).
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי מידול דינמיקת סינפסה המתואמת עם מצבי הפעלה של תאי T הרלוונטיים לייצור ציטוקינים ולהתרבות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה לשימוש חוזר להערכת תרכובות אימונומודולטוריות על ידי מתן אפשרות להזרקת לימפוציטים ומחזורי דימוג חוזרים על שכבות כפולות סטנדרטיות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בהרכבה ובסיגנלינג של הסינפסה האימונולוגית.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות הרכב ליפידים מוגדר, עיגון חלבונים ונהלי הרכבה של תא זרימה (flow cell).
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי אספקת נקודות סוף כמותיות מבוססות דימות למעורבות מטרה ואירועי סיגנלינג מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים למודולציה אימונולוגית בהתבסס על נתוני יצירת סינפסות ויציבות מיקרו-קלאסטרים של TCR.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ביצירת שכבות ליפידיות כפולות, סימון חלבונים והקמה של מיקרוסקופ TIRF.
- תלוי במיכשור מיוחד הכולל תאי זרימה עם שקופיות אינדיום-בדיל-חמצן (indium tin oxide), יצירת שכבה כפולה בסיוע ואקום ומערכות דימוי פלואורסצנטי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי שיקיעת חלבונים ובקרות הרכב ליפידיים להשגת תוצאות הניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לזוגות קולטנן-ליגנד שונים או לסוגי תאים שאינם לימפוציטים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון יציבות השכבה הכפולה לאורך זמן והצורך בשימוש מהיר בלימפוציטים לאחר הבידוד כדי לשמור על חיוניותם.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:29
Preparing the lipids
2:13
Determining how much ICAM-1 and MHC are deposited on the planar bilayer
3:22
Cleaning the glass cover slips for forming planar bilayers
4:47
Forming the bilayers
8:27
Charging the bilayers and introducing His-tagged proteins
11:36
Conclusion
10:20
Introducing primary T cells into the flow cell
