בדיקת סינון של מולקולות קטנות Nematicides: שיטת תפוקה בינונית לסינון נמטיקוטים פוטנציאליים נגד דיפסאצ'י דיפסאצ'י

נמטודות טפיליות צמחיות כגון Ditylenchus dipsaci הן תולעים מיקרוסקופיות. התולעים החיות מציגות תנועות סינוסואידיות באמצעות התכווצויות שרירים, והתנועתיות שלהן היא גורם חשוב לבריאותן בתנאי תרבית.

חשיפה לקוטלי נמטיקה - חומרים רעילים כימיים, עלולה להפריע לתהליכים ביולוגיים מרכזיים, ולהשפיע על הניידות של נמטודות מתורבתות אלה, ולהוביל למותן.

כדי לסנן קוטלי נמטיקה של מולקולות קטנות, קח צלחת מרובת בארות המכילה מים מזוקקים. בעזרת כלי הצמדה נקי, העבירו את קוטלי הנמטיקה המולקולריים הקטנים הפוטנציאליים מלוח המלאי הכימי ללוחית הבדיקה כדי להבטיח העברה של כמויות עקביות של מולקולות לכל באר.

מחלקים מספר שווה של נמטודות לכל באר בצלחת. אטום את הצלחות תוך שמירה על תנאים לחים כדי לתמוך בהישרדות ובניידות של הנמטודות. דגרו את הצלחת בתסיסה קלה כדי למנוע תולעים להתיישב.

במהלך הדגירה, מולקולות קטנות רעילות שונות פועלות על תולעים והורגות אותן, בעוד שללא רעילות אין השפעה. התבונן בצלחת תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לזהות את הבארות עם אוכלוסיית תולעים לא תנועה.

השלם את לוחות הבדיקה בתמיסת נתרן הידרוקסיד - ממריץ כימי בנקודת קצה. זה מפעיל את התנועה של כל תולעים במנוחה ומבדיל אותן ממתות.

נוכחותן של תולעים שאינן נעות לאחר טיפול בנתרן הידרוקסיד בבארות מסוימות מאשרת את יעילותן של מולקולות קטנות מתאימות כקוטלי נמטיקה.

להכנת לוחות הבדיקה, שפכו מים מזוקקים חיטוי לשוקת סטרילית, והוציאו 40 מיקרוליטר מים מזוקקים מהשוקת לכל באר של צלחת שטוחה עם 96 בארות עם פיפטה רב-ערוצית. הוסף כימיקלים מלוחות המלאי הכימיים של 96 הבארות ללוחות הבדיקה, על ידי הצמדה שלוש פעמים לתוך הצלחת הכימית. לאחר מכן, העבירו את הפינים 10 פעמים לתוך לוחית הבדיקה. כתם על נייר מול תמיסת הניקוי.

כדי לספור את מספר הנמטודות מהאוסף, ראשית, השעו מחדש את האוסף, ולאחר מכן, פיפטה 5 מיקרוליטר מהתמיסה באמצעות קצות שמירה נמוכים על שקופית. ספרו את מספר הנמטודות ב -5 מיקרוליטר באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה. לאחר מכן, התאם את הריכוז לשתי תולעים למיקרוליטר באמצעות מים מזוקקים סטריליים.

לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר מהדגימה לכל באר מלוחות 96 הבארות בעזרת פיפטה רב ערוצית ושוקת. עוטפים את הצלחות במגבת נייר לחה ומניחים אותן בקופסה. לאחר מכן, הוסיפו מגבת נייר לחה נוספת כדי לייצב ולהבטיח תנועה מינימלית של הצלחות, והדביקו על כרית דביקה באינקובטור טלזול של 20 מעלות צלזיוס המוגדר ל-200 סל"ד.

התבונן בצלחות ביום 5 תחת מיקרוסקופ מנתח. ספרו את מספר הדיפסאצ'ים הניידים והכוללים בבקרות ממס DMSO ובבארות שטופלו בתרופות.

אם התולעים אינן ניידות, הוסף 2 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד מולארי אחד לריכוז סופי של 40 מילימולר לבאר כדי לעורר תנועה. חשב את שיעור התולעים הניידות. במסכי D. dipsaci, בארות שהניבו באופן חוזר 0% תולעים ניידות מסווגות כפגיעות חזקות.