חסימת PCR מסוג Wild לאיתור מוטציות סומטיות בתדר נמוך

תגובת שרשרת פולימראז חוסמת מסוג פראי, או WTB-PCR מזהה מוטציות נקודתיות על ידי הגברה סלקטיבית של אללים מוטנטיים בשפע נמוך תוך עיכוב ההגברה של אללים מסוג בר בשפע גבוה בדגימות DNA.

WTB-PCR משתמש בחומצות גרעין נעולות, או אוליגונוקלאוטיד חד-גדילי ושונה המכיל LNA המשלים לגדיל ה-DNA מסוג הבר של הדגימה שנקשר במיוחד לגדיל המשלים. קשירת LNA חוסמת את פעילות ה-DNA פולימראז ומעכבת את התארכות ה-DNA של תבנית הבר.

כדי לבצע WTB-PCR, קח תערובת מאסטר המכילה dNTPs, LNAs ופריימרים קדימה ואחורה ספציפיים למטרה במים מזוקקים ללא נוקלאז.

הוסף תמיסה המכילה DNA פולימראז יציב תרמית לשפופרת, והכניס את התערובת לבאר של צלחת PCR. הוסף את דגימת ה-DNA הגנומית המכילה DNA מסוג בר ומוטנטי לבאר, והתחל PCR.

במהלך ה-PCR, דנטורציה בתיווך טמפרטורה גבוהה מפרידה בין ה-DNA הדו-גדילי. הגדילים המופרדים משמשים כתבניות לחישול הפריימרים, בעוד שה-LNA נקשר לגדיל ה-DNA המשלים שלו מסוג פרא ויוצר את הכלאת ה-DNA מסוג חוסם-פראי. בטמפרטורה גבוהה יותר, DNA פולימראז מוסיף dNTPs ומרחיב את תבניות הפריימר-DNA.

טמפרטורת התכה גבוהה יותר של הכלאה LNA-DNA מאשר קומפלקס ה-DNA-DNA שומרת עליו שלם. השינוי של LNA חוסם בסופו של דבר את ה-DNA פולימראז מלהרחיב את הכלאה של LNA-DNA, מה שמעכב את התארכותו.

במשך מספר מחזורי PCR, חסימה בתיווך LNA מגדילה את מספר האמפליקונים מסוג מוטנט ביחס לגרסה הפראית שלה בדגימה, ומסייעת לזיהוי הסלקטיבי שלהם.

הפריימרים קדימה ואחורה תוכננו עם רצף 5'-M13 כדי לאפשר חישול של פריימרים משלימים לרצף. תכנן את האוליגונוקלאוטיד החוסם כך שיהיה באורך של כ-10 עד 15 בסיסים ומשלים לתבנית מסוג הבר שבה רצויה העשרה מוטנטית.

אוליגו קצר יותר ישפר את אפליית אי ההתאמה. כדי להשיג ספציפיות מטרה גבוהה, חשוב לא להשתמש יותר מדי בנוקלאוטידים החוסמים, מכיוון שהדבר יגרום לאוליגונוקלאוטיד "דביק" מאוד.

כדי לעצב את האוליגונוקלאוטיד החוסם, התחל בניווט לאתר האינטרנט של Oligo Tools. בחר בכלי "Oligo T_M Prediction". ייפתח חלון חדש. הדבק את הרצף של התבנית מסוג פרא שיש לחסום בתיבה "רצף אוליגו". הוסף סימן פלוס לפני בסיסי החוסם כדי לסמן אותם. לחץ על כפתור "חשב" כדי לקבוע את ה- T_M המשוער של היברידית חוסם ה- DNA. טמפרטורות ההיתוך המחושבות יופיעו בתיבות למטה.

תכנן את האוליגו החוסם כך שיהיה לו טמפרטורת התכה של 10 עד 15 מעלות צלזיוס מעל טמפרטורת ההארכה במהלך רכיבה תרמית. כאן, טמפרטורת ההארכה היא 72 מעלות צלזיוס. כדי להתאים את טמפרטורת ההיתוך, הוסף, הסר או החלף בסיסים חוסמים. הימנע ממתיחות ארוכות של שלושה עד ארבעה בסיסי C או G חוסמים.

לאחר מכן, כדי למנוע היווצרות מבנה משני או דימריזציה עצמית, חזור למסך הבית של אתר Oligo Tools ובחר בכלי "Oligo Optimizer". ייפתח חלון חדש. הדבק את הרצף של התבנית מסוג הבר שיש לחסום לתוך התיבה. הוסף סימן פלוס כדי לציין בסיסים חוסמים. בחר את שתי התיבות עבור "מבנה משני" ו"עצמי בלבד" ולחץ על כפתור "נתח" כדי לראות את הציונים עבור הכלאה ומבנה משני.

ציונים אלה מייצגים הערכות גסות מאוד של טמפרטורות ההיתוך של הדימרים העצמיים והמבנים המשניים, בהתאמה. ציונים נמוכים יותר הם אופטימליים וניתן להשיג אותם על ידי הגבלת זיווג חוסם-חוסם. הסר או מקם מחדש נוקלאוטידים חוסמים על מנת להשיג ציונים נמוכים יותר. האוליגונוקלאוטיד החוסם האופטימלי עבור MyD88, המוצג כאן, יוצר איזון בין טמפרטורת ההיתוך ההיברידית של חוסם ה-DNA לבין הכלאה נמוכה מספיק וציוני מבנה משני.

הוא תוכנן לכסות חומצות אמינו Q262 עד I266 וכולל dT הפוך של 3' כדי לעכב הן התרחבות על ידי DNA פולימראז והן פירוק על ידי 3'-אקסונוקלאז. לאחר תכנון הפריימרים, הגדר את ה-PCR החוסם מסוג פרא ובצע רכיבה תרמית, כמתואר במסמך הנלווה.