Nested PCR היא טכניקה שכוללת שני סבבי הגברה של PCR כדי להגדיל את הספציפיות והרגישות של זיהוי DNA.

מדוע שליטות חשובות ב-PCR?

השליטות עוזרות לאמת את התוצאות על ידי הבטחת שההגברה היא ספציפית ושאין זיהום.

כיצד nested PCR משפר את הספציפיות?

על ידי שימוש בשתי קבוצות של פריימרים, nested PCR מקטין את הסיכוי להגברת רצפים שאינם ממוקדים, מה שמוביל לתוצאות מדויקות יותר.

מהם המרכיבים העיקריים של מיקס ה-PCR מאסטר?

מיקס המאסטר כולל בדרך כלל פולימראז DNA, dNTPs, פריימרים, ופתרון מאגר.

האם ניתן להשתמש ב-nested PCR ליישומים אחרים?

כן, ניתן להתאים את nested PCR ליישומים שונים בביולוגיה מולקולרית, כולל בדיקות גנטיות וזיהוי פתוגנים.

PCR מקונן כדי לזהות רצף גנומי ויראלי ספציפי

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

0 views • 3:20 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תגובת שרשרת פולימראז מקוננת, PCR מקונן, יכולה להגביר באופן סלקטיבי רצפי גנים ספציפיים.

כדי לזהות רצף נגיפי מטרה, התחל עם תערובת מאסטר המכילה פריימרים חיצוניים המשלימים לאזור DNA גדול יותר המכיל את הרצף הנגיפי הממוקד, dNTPs ו-DNA פולימראז יציב בחום במאגר מתאים.

הוסף לתערובת זו DNA ויראלי דו-גדילי, המופק מהתאים הנגועים בנגיף. העבירו את הצינור לתרמו-סייקלר; הפעל את מחזור ה-PCR הראשון.

במהלך דנטורציה, ה-DNA הדו-גדילי מייצר שתי תבניות חד-גדיליות. בטמפרטורת חישול מתאימה, פריימרים חיצוניים נקשרים לרצפי היעד המתאימים להם. מאוחר יותר, DNA פולימראז מרחיב את הפריימרים באמצעות dNTPs, ומייצר מגברים גדולים, המכילים את הרצף הספציפי בתוך ה-DNA המוגבר.

העבירו את האמפליקונים הללו לצינור חדש. השלימו עם תערובת מאסטר טרייה המכילה פריימרים פנימיים או מקוננים המכוונים לרצף קטן וספציפי יותר בתוך ה-DNA המוגבר הגדול יותר. הפעל את ה-PCR השני.

במהלך ה-PCR השני, גדיל ה-DNA עובר דנטורציה. לאחר דנטורציה, הפריימרים המקוננים קושרים את אתרי המטרה בתבנית החד-גדילית, ואחריה הרחבת פריימר בתיווך פולימראז.

חזור על מחזור ה-PCR השני מספר פעמים כדי להגביר באופן בלעדי את הרצף הנגיפי הממוקד.

נתח את מוצר ה-PCR כדי לדמיין את המגברים הקטנים יותר, המאשרים את נוכחותו של הרצף הנגיפי הספציפי.

אחזר את הריאגנטים הדרושים ושמור אותם על קרח בחדר נקי עד שהם מוכנים לשימוש. כשהוא מוכן, מפשירים ומערבלים את הריאגנטים. לאחר מכן, הכינו 48 מיקרוליטר של תערובת PCR סיבוב ראשון עבור כל דגימה בצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, כמתואר בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט, וחלקו את תערובת התגובה לצינורות PCR של 0.2 מיליליטר.

בתחנת עבודה PCR בחדר תבנית, הוסף דגימה של 2 מיקרוליטר של ה-cDNA לתערובת ה-PCR בסיבוב הראשון. כלול שני מיקרוליטרים של CVS-11 cDNA כבקרה חיובית ושני מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים כבקרה שלילית. לאחר מכן, העבירו את הצינורות האטומים למחזור תרמי PCR ומחזור באמצעות הפרמטרים המפורטים בטבלה 3 של פרוטוקול הטקסט.

כדי להתחיל, הכינו 48 מיקרוליטר של תערובת PCR סיבוב שני עבור כל דגימה בצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, כמתואר בטבלה 4 של פרוטוקול הטקסט, וחלקו את תערובת התגובה לצינורות PCR של 0.2 מיליליטר. הוסף שני מיקרוליטר של מוצר ה-PCR בסיבוב הראשון לתערובת ה-PCR בסיבוב השני. כלול מים מזוקקים כפולים כבקרה שלילית לסבב זה של PCR. לאחר מכן, בצע רכיבה תרמית PCR באמצעות הפרמטרים המפורטים בטבלה 3 של פרוטוקול הטקסט.