הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

המטרה הכוללת של הליך זה היא להגביר את אתרי האינטגרציה הרטרו-ויראלית מ-DNA גנומי בתפזורת, ולרצף את ספריית ה-DNA המתקבלת, כך שניתן יהיה למפות מיקומי אינטגרציה מדויקים לגנום ייחוס. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח ברטרו-וירולוגיה בסיסית וקלינית על ידי ניתוח התפלגות אתרי האינטגרציה ברחבי הגנום המארח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא עומק ריצוף ה-DNA, והעובדה שניתן להכפיל דגימות רבות בריצוף אחד.

יום אחד לפני הטרנספקציה, יש לצלחת 3.3 פעמים 10 עד HEK293T השישית ב-10 מיליליטר של Dulbecco's Modified Eagle's Medium בכל אחת מחמש מנות של 100 מילימטר. למחרת, השתמש בריאגנטים טרנספקציונים זמינים מסחרית או סידן פוספט כדי להעביר את התאים עם 10 מיקרוגרם של פלסמיד הנושאים שיבוטים מולקולריים רטרו-ויראלים באורך מלא או תשעה מיקרוגרם של וקטורים עגולים בודדים בתוספת מיקרוגרם אחד של מבנה ביטוי VSV-G. הוסף את התערובת למדיה התאית טיפתית.

לאחר הטרנספקציה, יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית תאים לח עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר כ-48 שעות, קצרו את המדיה התאית המכילה את הנגיף באמצעות פיפטה נפחית, והעבירו אותה דרך מסנן של 0.45 מיקרון על ידי זרימת כוח הכבידה. לאחר מכן, רכז את הנגיף על ידי אולטרה-צנטריפוגה ב-200,000 גרם למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט עד שיישארו כ-500 מיקרוליטר של DMEM FPS, והשהה מחדש את כדור הנגיף. מוסיפים 20 יחידות DNase ודוגרים למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס. קבע את ריכוז ה-p24 באמצעות ערכת לכידת אנטיגן HIV-1 p24 בהתאם להוראות היצרן.

יום לפני ההדבקה, צלחת 3.0 כפול 10 עד החמישית HEK293T תאים ב-2.5 מיליליטר של DMEM FPS לבאר בצלחת של שש בארות ודגירה למשך הלילה בחממת תרביות רקמה. הדביקו את התאים בריכוז p24 ויראלי סופי של 500 ננוגרם למיליליטר ב-500 מיקרוליטר של DMEM FPS טרי. דגירה במשך שעתיים בחממת תרביות רקמה.

לאחר שעתיים, הוסף שני מיליליטר של DMEM FPS שחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס לכל באר והחזיר את הצלחת לחממה. 48 שעות לאחר ההדבקה, הסר את המדיה ושטוף את התאים בשני מיליליטר מי מלח עם פוספט. קצרו את התאים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של טריפסין-EDTA שחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס, ולאחר מספר שניות, בדקו חזותית את הבארות לאיתור עקירת תאים.

לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של DMEM FPS שחומם מראש והשהה מחדש את התאים על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה נפחית. העבירו את התמיסה לבקבוק תרבית רקמה בגודל 75 סנטימטר רבוע המכיל 18 מיליליטר של DMEM FPS מחומם מראש, והחזרו לחממת תרבית הרקמות. לפחות חמישה ימים לאחר ההדבקה, קצרו את התאים כמו קודם והשעו מחדש בחמישה מיליליטר של DMEM FPS שחומם מראש על ידי פיפטינג.

צנטריפוגה את התמיסה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ב -2, 500 גרם, ואז שואבים וזורקים את הסופרנטנט. לבסוף, חלץ DNA גנומי מכדור התא באמצעות ערכה זמינה מסחרית. מסלק את ה-DNA מעמודת חילופי היונים המסופקת עם 200 מיקרוליטר של Tris-HCL מילי-מולרי ב-pH 8.5.

לאחר סוניקציה של ה-DNA הגנומי, טהר את ה-DNA הסוניקטיבי באמצעות ערכת טיהור PCR. לאחר מכן, תקן את ה-DNA באמצעות ערכת תיקון קצה. לאחר טיהור ה-DNA כמו קודם, A זנב את ה-DNA באמצעות אנזים Klenow Exo-Minus.

לחלופין, לפיצול על ידי עיכול אנדונוקלאז הגבלה, חתוך DNA גנומי עם קוקטייל של אנזימים המייצרים תלויות 5'TA, כמו גם אנזים לא תואם כגון BglII שמתבקע במורד הזרם מה-LTR הנגיפי במעלה הזרם. חותכים 10 מיקרוגרם DNA גנומי בנפח סופי של 100 מיקרוליטר. דגירה למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.

ודא שה-DNA הסופי מנוקה באמצעות ערכת טיהור ה-PCR. המקשר לשימוש עם DNA סוניקטיבי חייב להכיל תלייה תואמת של T 3', בעוד שהמקשר ל-DNA מעוכל MseI חייב להכיל תלייה תואמת של 5'TA. התחל בחישול 10 מיקרומולר של גדילי הקישור הקצרים והארוכים ב-35 מיקרוליטר של מאגר Tris-HCL EDTA על ידי חימום ל-90 מעלות צלזיוס וקירור איטי לטמפרטורת החדר בצעדים של מעלה צלזיוס אחת לדקה.

לאחר מכן, הכינו לפחות ארבע תגובות קשירה מקבילות לכל דגימת DNA גנומית המכילה 1.5 מקשר קשור מיקרומולרי, מיקרוגרם אחד של DNA מקוטע ו-800 יחידות של T4 DNA ligase בנפח סופי של 50 מיקרוליטר. קשר לילה ב-12 מעלות צלזיוס. עבור דגימות שהוכנו על ידי סוניקציה, עכל את תגובת הקשירה המטוהרת עם אנזים הגבלה שנבקע במורד הזרם מה-LTR במעלה הזרם.

השתמש ב-100 יחידות של האנזים המתאים בתנאים המומלצים על ידי היצרן למשך הלילה. ודא שהמוצרים הסופיים מטוהרים באמצעות ערכת טיהור PCR. הכן את ה-PCR של הסיבוב הראשון באמצעות הריאגנטים המוצגים כאן.

הפעל את ה-PCR בסיבוב הראשון באמצעות הפרמטרים הבאים:94 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ולאחר מכן 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 68 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות. מסיימים עם 68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אסוף את תגובות הסיבוב הראשון וטהר את ה-DNA כמו קודם.

לאחר מכן הכן את ה-PCR של הסיבוב השני המכילים את הריאגנטים המוצגים כאן. השתמש באותם פרמטרים של רכיבה כמו בסיבוב הראשון. לאחר איגום וטיהור ה-DNA מתגובת הסבב השני, לבצע בקרת איכות וריצוף מהדור הבא, ולנתח אתרי אינטגרציה באמצעות ההוראות המפורטות בחלק הכתוב של הפרוטוקול.

אתרי אינטגרציה מספריות שהוכנו על ידי עיכול עם אנזימי הגבלה, כפי שמוצג משמאל, או סוניקציה, כפי שמוצג מימין, יושרו באמצעות תוכנת לוגו אינטרנט. כל דילול בסדרת הטיטרציה מתואר, החל מ-DNA מסודר בחלק העליון של האיור, ועד לדילול המקסימלי של 1 עד 15, 625 בתחתית. מידת הוודאות פוחתת עם דילול הולך וגובר של DNA של תאים נגועים.

תמונה זו מציגה את לוגו הרצף עבור הבקרה האקראית התואמת של 50,000 אתרים גנומיים ייחודיים. שימו לב שהאתרים האקראיים המיושרים ממערך הנתונים של MRC, לעומת זאת, לא הצליחו לייצר רמות ניכרות של העדפות בסיס. לאחר השליטה, ניתן להכין ספריות אתר אינטגרציה מ-DNA גנומי תוך שלושה ימים.

לכן ניתן להשלים את מיפוי אתר האינטגרציה, מהזיהום הראשוני ועד לביואינפורמטיקה שהושלמה, תוך כשבועיים. בעקבות הליך זה, ניתן לקטלג אלפי או אפילו מיליוני אתרי אינטגרציה רטרו-ויראלים ייחודיים, וניתן לבצע ניתוחים מגוונים כדי לכמת אסוציאציות בין אתרי החדרה והערות גנומיות.