הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להגביר באמצעות PCR את אתרי האינטגרציה הרטרו-ויראליים מתוך DNA גנומי כולל, ולרצף את ספריית ה-DNA שהתקבלה, כך שניתן יהיה למפות מיקומי אינטגרציה מדויקים אל מול גנום ייחוס. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח ברטרו-וירולוגיה בסיסית וקלינית על ידי ניתוח התהלוכיות של אתרי האינטגרציה לאורך גנום המארח. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא עומק ריצוף ה-DNA, והעובדה שניתן לבצע מולטיפלקס לדגימות רבות בריצת ריצוף אחת.

יום אחד לפני הטרנספקציה, זרעו 3.3 times 10 to the sixth תאי HEK293T ב-10 milliliters של Dulbecco's Modified Eagle's Medium מועשר בכל אחת מחמש צלחות בקוטר 100 millimeter. למחרת, השתמשו בריאגנטים לטרנספקציה הזמינים מסחרית או בסידן פוספט כדי לבצע טרנספקציה לתאים עם 10 micrograms של פלסמיד הנושא קלונים מולקולריים רטרו-ויראליים מלאים, או עם תשעה micrograms של וקטורים של סבב יחיד (single round vectors) עטופים ומכווצים בתוספת מיקרוגרם אחד של מבנה ביטוי VSV-G. הוסיפו את התערובת למצע התאים בטיפות.

לאחר הטרנספקציה, הדגרימו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרביות תאים עם לחות ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר כ-48 שעות, אספו את מצע התאים המכיל את הווירוס באמצעות פיפטה וולומטרית, והעבירו אותו דרך פילטר של 0.45 מיקרון באמצעות זרימה בכבידה. לאחר מכן, רכזו את הווירוס באמצעות אולטרסנטריפוגציה ב-200,000 Gs למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגה, הסר את הנוזל העליון עד שיישארו כ-500 µL של DMEM FPS, וסספנד מחדש את משקע הווירוס. הוסף 20 units של DNase והדגר למשך שעה אחת ב-37 °C. קבע את ריכוז ה-p24 באמצעות ערכה ללכידת אנטיגן HIV-1 p24 לפי הוראות היצרן.

יום לפני ההדבקה, זרעו 3.0 × 10⁵ תאי HEK293T ב-2.5 milliliters של DMEM FPS לכל באר בפלטה בעלת שש בארות, והדגרירו למשך לילה באינקובטור לתרביות רקמה. הדביקו את התאים בריכוז סופי של p24 ויראלי של 500 nanograms per milliliter ב-500 microliters של DMEM FPS טרי. הדגרירו למשך שעתיים באינקובטור לתרביות רקמה.

לאחר שעתיים, הוסיפו שתי מיליליטר של DMEM FPS שחומם מראש ל-37 °C לכל באר והחזירו את הפלטה לאינקובטור. 48 שעות לאחר ההדבקה, הסירו את המצע ושטפו את התאים עם שתי מיליליטר של phosphate-buffered saline. קצרו את התאים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של Trypsin-EDTA שחומם מראש ל-37 °C, ולאחר מספר שניות, בדקו חזותית את הבארים כדי לוודא שהתאים ניתקו.

בשלב הבא, הוסיפו שני מיליליטר של DMEM FPS שחומם מראש והשעיכו את התאים על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטה נפחית. העבירו את התמיסה לבקבוק תרבית רקמה של 75 סנטימטר רבוע המכיל 18 מיליליטר של DMEM FPS שחומם מרוש, והחזירו אותו לאינקובטור לתרבית רקמה. לפחות חמישה ימים לאחר ההדבקה, קצרו את התאים כפי שנעשה קודם לכן והשעיכו אותם בחמישה מיליליטר של DMEM FPS שחומם מראש באמצעות פיפוט.

סבב את התמיסה בצנטריפוגה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ב-2,500 Gs, ולאחר מכן שאב והשלך את הנוזל העליון (supernatant). לבסוף, חלץ DNA גנומי ממשקע התאים באמצעות ערכה זמינה מסחרית. אלוט את ה-DNA מעמודת חילוף היונים המסופקת עם 200 microliters של Tris-HCL מילימולרי ב-pH 8.5.

לאחר סוניקציה של ה-DNA הגנומי, טהרו את ה-DNA שעבר סוניקציה באמצעות ערכה לניקוי PCR. לאחר מכן, תקנו את ה-DNA באמצעות ערכה לתיקון קצוות (end repair kit). לאחר טהרת ה-DNA כפי שבוצע קודם לכן, הוסיפו זנב A ל-DNA באמצעות האנזים Klenow Exo-Minus.

לחלופין, עבור פרגמנטציה באמצעות עיכול על ידי אנדונוקליאז רסטריקציה, גזרו את ה-DNA הגנומי עם תערובת אנזימים היוצרים בליטות 5'TA, וכן עם אנזים שאינו תואם, כגון BglII, הגוזר במורד ה-LTR הוויראלי שמעלה. גזרו 10 micrograms של DNA גנומי בנפח סופי של 100 microliters. הדגרירו למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

יש לוודא כי ה-DNA הסופי מנוקה באמצעות ערכת טיהור PCR. המקשר (linker) שבו נעשה שימוש עם DNA שעבר סוניקציה חייב להכיל בליטה (overhang) תואמת של T'3, בעוד שהמקשר עבור DNA שעבר עיכול על ידי MseI חייב להכיל בליטה תואמת של 5'TA. התחילו בביצוע היברידציה (annealing) של 10 micromolar של גדילי המקשר הקצרים והארוכים ב-35 microliters של Tris-HCL EDTA buffer, על ידי חימום ל-90 degrees Celsius וקירור איטי לטמפרטורת החדר במדרגות של one degree Celsius לדקה.

בשלב הבא, הכינו לפחות ארבע תגובות ליגציה מקבילות עבור כל דגימת DNA גנומי, המכילות 1.5 micromolar של לינקר, מיקרוגרם אחד של DNA מפוfragmented, ו-800 units של T4 DNA ligase בנפח סופי של 50 microliters. בצעו ליגציה למשך לילה בטמפרטורה של 12 degrees Celsius. עבור דגימות שהוכנו באמצעות סוניקציה, כדירו את תגובת הליגציה המזוהה באמצעות אנזים הגבלה שחותך במורד ה-LTR העליון.

השתמשו ב-100 units של האנזים המתאים תחת התנאים המומלצים על ידי היצרן למשך לילה. ודאו כי המוצרים הסופיים מטוהרים באמצעות ערכה לטיהור PCR. הכינו את סבבי ה-PCR הראשונים באמצעות הרכיבים המוצגים כאן.

בצעו את סבב ה-PCR הראשון לפי הפרמטרים הבאים: 94 degrees Celsius למשך שתי דקות, ולאחר מכן 30 מחזורים של 94 degrees Celsius למשך 15 שניות, 55 degrees Celsius למשך 30 שניות, ו-68 degrees Celsius למשך 45 שניות. סיימו ב-68 degrees Celsius למשך 10 דקות. אגדו את תגובות הסבב הראשון וטהרו את ה-DNA כפי שבוצע קודם לכן.

לאחר מכן, הכינו את תגובות ה-PCR של הסבב השני המכילות את הרכיבים המוצגים כאן. השתמשו באותם פרמטרי מחזור כפי שבוצעו ב-PCR של הסבב הראשון. לאחר איסוף וטיהור ה-DNA מתגובת הסבב השני, בצעו בקרת איכות וריצוף מהדור הבא (next generation sequencing), ונתחו את אתרי השילוב (integration sites) בהתאם להוראות המפורטות בחלק הכתוב של הפרוטוקול.

אתרי השתחלה מספריות שהוכנו על ידי עיכול עם אנזימי הגבלה, כפי שמוצג משמאל, או סוניקציה, כפי שמוצג מימין, סודרו באמצעות תוכנת web logo. כל דילול בסדרת הטיטראציה מוצג, החל מ-DNA לא מדולל בחלק העליון של האיור, ועד לדילול המקסימלי של 1 ל-15,625 בחלקו התחתון. רמת הוודאות פוחתת עם הגדלת הדילול של ה-DNA מתאים מזוהם.

תמונה זו מציגה את לוגו הרצף עבור הביקורת האקראית התואמת של 50,000 אתרים גנומיים ייחודיים. שימו לב כי בניגוד להם, האתרים האקראים שסודרו מתוך מערך ה-MRC לא הניבו רמות ניכרות של העדפות בסיסים. לאחר השליטה בשיטה, ניתן להכין ספריות של אתרי אינטגרציה מ-DNA גנומי בתוך שלושה ימים.

מיפוי אתרי השילוב, מהזיהום הראשוני ועד להשלמת הביואינפורמטיקה, יכול להסתיים לפיכך תוך כשבועיים. בעקבות הליך זה, ניתן לקטלג אלפים ואפילו מיליוני אתרי שילוב רטרוויראליים ייחודיים, וניתן לבצע ניתוחים מגוונים כדי לכמת קשרים בין אתרי ההחדרה לבין השערות גנומיות (genomic annotations).