פיתוח ובדיקה של מבחני PCR כמותיים ספציפיים למינים עבור יישומי DNA סביבתיים

בדיקות מותאמות היטב חיוניות לפירוש נכון של נתוני DNA סביבתיים. פרוטוקול זה מתאר את שלבי התכנון והבדיקה הדרושים לפיתוח בדיקה כזו. באופן כללי, DNA סביבתי הוא שיטה לא פולשנית לזיהוי מין מסוים או חבילת מינים.

זה עשוי להפחית עלויות ולהיות רגיש יותר בהשוואה לשיטות סקר קונבנציונליות. שיטה זו יכולה לסייע בשימור וניהול חיות בר באמצעות זיהוי DNA ממין מעניין, מה שמאפשר להסיק את נוכחות המינים באזור הדגימה. בגלל הרגישות הרבה של PCR כמותי, זיהום יכול לקרות בקלות, ויש צורך בבקרות שליליות כדי לזהות שלבים שבהם הוכנס זיהום.

דנ"א סביבתי הוא תחום זרוע בז'רגון ומונחים מקוצרים. עבור אלה שאינם מתורגלים בביולוגיה מולקולרית או qPCR, הדגמות חזותיות יכולות לסייע בתכנון תכנון ניסיוני מהמשגה ועד ליצירת נתונים. ידגימו את ההליך דניס רואיז ראמוס, ביולוגית מהמעבדה שלנו, וטרודי פרוסט, עוזרת מעבדה לסטודנטים.

כדי להתחיל, חפש והורד רצפים מאזורי גנים מרובים עבור מינים מעניינים באמצעות מסד הנתונים של הנוקלאוטידים של NCBI. בחר את כל הרצפים התואמים למפרטים, ובחר שלח אל.בחר השלם רשומה, קובץ, פורמט הורדה כ-GenBank או FASTA, ולאחר מכן צור קובץ. רצפים אלה נשמרים כעת במחשב.

חזור על שלבים אלה עבור כל המינים המעניינים. שמור רצפים עבור כל אזור גן בקובץ נפרד, מכיוון שהם ינותחו בנפרד. כדי ליישר את הרצפים מכל אזור גן בנפרד, ייבא את קבצי הרצף שהורדת לתוכנית יישור רצף, כגון תוכנת Geneious Prime.

צור תיקיות נפרדות עבור כל אזור גן, ולאחר מכן בחר את כל הרצפים בתוך תיקייה המכילה רצפים מאזור גן אחד. השתמש בכלי יישור מרובה כדי ליצור יישור נוקלאוטידים, כגון Geneious או MUSCLE של הרצפים שנבחרו. בחר אזורים מבטיחים לתכנון בדיקה באמצעות הדמיה של נתוני רצף מיושרים.

בחר אזור שיש בו הרבה נתוני רצף זמינים עבור המין המבוקש, הוא שונה מאוד בין המינים ומראה שונות נמוכה בתוך המינים. לאחר מכן, תכנן את פריימרים הבדיקה והבדיקה. השתמש בתוכנת עיצוב בדיקת qPCR כדי לעצב חמש קבוצות של בדיקות qPCR.

הדבק את הרצף שנבחר בתיבה ערך רצף. אם היישור יצר רווחים, מחק אותם מהרצף. בחר בדיקת פריימרים qPCR 2 באפשרות בחר את העיצוב שלך, ולאחר מכן הורד את הבדיקות המומלצות.

העתק את הרצפים מהפריימר הקדמי של הבדיקה הראשונה, וחפש את רצף הפריימר הזה ביישור שנוצר קודם לכן. אם אתה משתמש ב- Geneious Prime, השתמש בכלי Annotate Predict כדי להוסיף את אזור הפריימר ליישור. עשה זאת עבור כל שילובי הפריימר והבדיקה.

בדוק את האזורים הללו של היישור לאיתור שונות בתוך מין המטרה, כמו גם בתוך המינים המתרחשים במקביל. בדוק פריימרים בסיליקו באמצעות Primer-BLAST של NCBI. הדבק פריימרים לשימוש בתיבת הפריימר שלי תחת פרמטרי פריימר.

באפשרויות פרמטרים לבדיקת ספציפיות של זוג פריימרים, בחר NR כמסד הנתונים והקלד את הסדר הטקסונומי או המשפחה של האורגניזם המעניין בתיבה אורגניזם. ודא שהפריימרים שנבחרו אינם צפויים להגביר מינים שאינם מטרה. בדוק את יעילות הבדיקה במבחנה על ידי יצירת עקומה סטנדרטית וקבע את יעילות העקומה ואת הטווח הליניארי.

בדוק לפחות שישה דילולים של פי עשרה של תקן DNA סינתטי המכיל את רצף המטרה, בערך 1 עד מיליון עותקים לכל תגובה. השתמש בתוכנת qPCR כדי לשרטט את ערך ה-CQ של כל תקן על ציר ה-Y, ואת בסיס ה-log 10 של הריכוז הסטנדרטי הראשוני בעותקים לכל תגובה על ציר ה-X. תוכנת qPCR אמורה להריץ רגרסיה ליניארית באופן אוטומטי.

חשב את היעילות משיפוע הרגרסיה. בדוק חזותית את העקומה הסטנדרטית לאיתור הטיה או ביצועים גרועים, כפי שנמדד על-ידי ערכי יעילות וערכי R בריבוע. השתמש בבקרה חיובית פנימית כדי לבדוק עיכוב PCR של דגימות שדה בפועל, מה שעלול להוביל לירידה ברגישות ולשליליות כוזבות.

קבע את גבולות הזיהוי והכימות עבור כל בדיקה. בדוק בדיקות עם מינים שאינם מטרה כדי לאמת את הספציפיות, וודא שהבדיקה מתפקדת היטב עם ריבוב IPC. בדיקות עם רגישות, ספציפיות ויעילות טובות יכולות לעבור לשלבים הבאים.

כדי לבצע בדיקה באתרה של הבדיקה, קבל מספר דגימות מים ועבד אותן עבור qPCR. הפעל את בדיקת ה-PCR הכמותית והשווה את ריכוז ה-eDNA ותדירות הזיהוי עם הבדלים ידועים באתרים בהתרחשות ובשפע. אשר את כל הזיהויים על-ידי רצף.

רצפים זמינים של כל מיני ה-Unionidae בנהר קלינץ' הורדו והותאמו. לאחר תכנון בדיקות מרובות, נוספו חמישה סטים של פריימרים ובדיקה ליישור להערכה חזותית. ערכות הפריימר והבדיקה נבדקו בסיליקו ובמבחנה.

במעבדה, כל הבדיקות נבדקו באמצעות מיצוי DNA של 27 מינים זמינים כדי לאמת את הספציפיות. בדיקה אחת הצליחה להגביר רק את מין המטרה. בדיקה מוצלחת עם יעילות טובה וערכי R בריבוע מוצגת כאן.

ה-LOD וה-LOQ עבור הבדיקה שנבחרה היו שניהם חמישה עותקים לתגובה. לעומת זאת, בדיקות שיצרו עקומה סטנדרטית עם יעילות ירודה הושלכו. ב-qPCR איכותי, הדילולים הסטנדרטיים מגבירים בערכי כימות מחזור במרווחים שווים של כ-3.3 מחזורים עבור כל הבדל של פי עשרה בריכוז.

ב-qPCR גרוע, התקנים עשויים להראות שונות לא אחידה בערכי כימות המחזור בין דילול. יש להשוות את הגברת ה-IPC עבור דגימות לא ידועות לתוצאות של בקרת התבנית השלילית IPC. אם אין מעכבים בדגימות, כל הגברת ה-IPC צריכה להיות בעלת קיבוץ הדוק בעלילה, עם ערכי כימות מחזור כמעט זהים לבקרת היעדר תבנית.

לצורך בדיקה באתרה של הבדיקה, אתרי המיקום כללו את החלק התחתון של ערוגת המולים בנחל, תחתית מצע השרירים ליד החוף, 100 מטר במורד הזרם של המיטה בזרם, 500 מטר במורד הזרם של הקרקעית בנחל ו-500 מטר במורד הזרם של הקרקעית ליד החוף. מבחני PCR כמותיים ל-DNA סביבתי יכולים לסייע בניטור של מינים פולשים ובסכנת הכחדה, כמו גם לשפר את הבנתנו את השינויים המרחביים והזמניים בזיהוי מינים מבלי שנצטרך ללכוד פיזית את האורגניזם הבודד.