שיטה מבוססת ELISA לניתוח אינטראקציות בין חלבוני פיתיון וטרף

האינטראקציה הפיזית בין שני שותפי חלבון מווסתת את המנגנונים הביולוגיים במורד הזרם.

כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות מבחן אימונוסורבנט מקושר לאנזים, ELISA, קח צלחת בדיקה חיסונית מרובת בארות. הוסיפו חוצץ ציפוי המכיל את אחד החלבונים המקיימים אינטראקציה - חלבון הפיתיון - ודגרו. חלבוני הפיתיון נספגים על פני הבאר באמצעות אינטראקציות הידרופוביות לא ספציפיות.

השליכו את התמיסה המושקעת ושטפו את הצלחת עם חיץ כדי להסיר חלבונים לא קשורים. הוסיפו תמיסת חסימה ודגרו, מה שמאפשר למולקולות החומר החוסם של התמיסה לחסום אתרי קישור לא ספציפיים על פני הבאר.

הוסף את שותף החלבון המקיים אינטראקציה - חלבון הטרף - המתויג עם שאריות היסטידין לכימות קל. דגירה, מה שמאפשר לחלבון הטרף להיקשר באופן ספציפי לשותף האינטראקטיבי שלו - הפיתיון. הוסף תמיסה של נוגדנים אנטי-היסטידין מצומדים עם אנזימי פרוקסידאז חזרת הנקשרים לטרף, ויוצרים קומפלקס פיתיון-טרף-נוגדנים.

פיפטה תמיסה המכילה את המצע של האנזים ומי חמצן ודגירה.

האנזים חזרת פרוקסידאז משתמש במי חמצן לחמצון הקטליטי של המצע שלו - ויוצר מוצר בצבע כחול. הוסף תמיסה חומצית המפרקת את האנזים כדי לעצור את התגובה, וליצור תוצר תגובה צהוב.

בעזרת קורא מיקרו-פלטות, מדוד את עוצמת הצבע של המוצר, שהיא פרופורציונלית לכמות חלבון הטרף הקשור ומצביעה על אינטראקציה מוצלחת בין חלבון לחלבון.

כדי להתכונן ל-ELISA, יש להוציא 100 מיקרוליטר של תמיסת חלבון לכל באר של צלחת מיקרוטיטר Polysorp. סוגרים את הצלחות עם המכסה, ושומרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להקל על קיבוע החלבון על בארות צלחת מיקרוטיטר. השלך את התמיסה מלוח המיקרוטיטר על ידי הטיה הפוכה מעל הכיור. לאחר מכן, שטפו את הבארות שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטר PBS לבאר.

חסום את הבארות המצופות למשך שעה בטמפרטורת החדר עם PBS, המכילות 2.5 אחוז נפח משקל BSA. לאחר הסרת תמיסת החסימה, יש לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטר PBST לבאר. כעת, הוסף 100 מיקרוליטר של 50 ננו-מולרי רקומביננטי PH מתויג His לכל דגימה. בבארות הבקרה מוסיפים רק 100 מיקרוליטר PBS-BSA. דוגרים את הצלחת למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, השליכו את תמיסת החלבון והסירו את החלבונים הלא קשורים על ידי שטיפת הבארות שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטר PBST לבאר. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של PBS-BSA, המכילים נוגדנים אנטי-שבטיים מצומדים של חזרת פרוקסידאז.

לאחר דגירה של שעה בטמפרטורת החדר, יש לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטר PBST לבאר. זהה את קומפלקסי האנטיגן-נוגדנים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מגיב זיהוי ELISA לכל באר. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של חומצה גופרתית טוחנת אחת לבאר כדי לעצור את התגובה. מדוד את הצפיפות האופטית של הבארות ב-450 ננומטר, באמצעות קורא מיקרו-פלטות.