זיהוי מבוסס אנאיזוטרופיה פלואורסצנטית של אינטראקציות חלבון-חלבון
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:41 דק׳ • July 8th, 2025
לזיהוי אינטראקציה של חלבון-חלבון מבוסס אניזוטרופיה פלואורסצנטית, התחל עם חלבוני מטרה רקומביננטיים המתויגים במוטיבים של טטרציסטאין C-terminal במאגר אניזוטרופיה מתאים.
הוסף צבע המכיל פלואורופור - נקשר לחלבוני מטרה באמצעות מוטיב הטטרציסטאין. דיאליזה עם מאגר האניזוטרופיה, הסרת צבע לא קשור. מעבירים את התערובת לקובטות קוורץ. מדוד את הספיגה, קבע את אחוז חלבוני המטרה שסומנו בהצלחה.
בקובטה פלואורסצנטית, מערבבים את חלבוני המטרה המסומנים בפלואורופור עם חלבונים ללא תווית. בעזרת ספקטרופלואורומטר, מדוד אניזוטרופיה פלואורסצנטית.
כאשר חלבוני המטרה תלויים בחופשיות במאגר, הפלואורופורים המחוברים אליהם מסתובבים באופן אקראי סביב ציריהם עקב תנועה בראונית. עם עירור עם אור מקוטב אנכית באורך גל מתאים, הפלואורופורים פולטים אור מקוטב במישור האנכי והאופקי. נמדד היחס בין עוצמות הקרינה של הפליטות האנכיות והמקוטבות אופקית - אניזוטרופיה.
כאשר חלבונים ללא תווית נקשרים למטרות המסומנות בפלואורופור, הגודל המולקולרי של קומפלקס החלבון גדל, ומפחית את תנועתו הסיבובית. כתוצאה מכך, האור הנפלט הופך מקוטב יותר, עם פליטה גבוהה יותר במישור האנכי מאשר במישור האופקי - מה שמגדיל את האניזוטרופיה.
הוסף ריכוזים הולכים וגדלים של החלבון הלא מסומן וחזור על מדידת האניזוטרופיה.
עלייה לא ליניארית באניזוטרופיה עם תוספת חלבון מוגברת ללא תוו
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים