זיהוי מבוסס אנאיזוטרופיה פלואורסצנטית של אינטראקציות חלבון-חלבון

לזיהוי אינטראקציה של חלבון-חלבון מבוסס אניזוטרופיה פלואורסצנטית, התחל עם חלבוני מטרה רקומביננטיים המתויגים במוטיבים של טטרציסטאין C-terminal במאגר אניזוטרופיה מתאים.

הוסף צבע המכיל פלואורופור - נקשר לחלבוני מטרה באמצעות מוטיב הטטרציסטאין. דיאליזה עם מאגר האניזוטרופיה, הסרת צבע לא קשור. מעבירים את התערובת לקובטות קוורץ. מדוד את הספיגה, קבע את אחוז חלבוני המטרה שסומנו בהצלחה.

בקובטה פלואורסצנטית, מערבבים את חלבוני המטרה המסומנים בפלואורופור עם חלבונים ללא תווית. בעזרת ספקטרופלואורומטר, מדוד אניזוטרופיה פלואורסצנטית.

כאשר חלבוני המטרה תלויים בחופשיות במאגר, הפלואורופורים המחוברים אליהם מסתובבים באופן אקראי סביב ציריהם עקב תנועה בראונית. עם עירור עם אור מקוטב אנכית באורך גל מתאים, הפלואורופורים פולטים אור מקוטב במישור האנכי והאופקי. נמדד היחס בין עוצמות הקרינה של הפליטות האנכיות והמקוטבות אופקית - אניזוטרופיה.

כאשר חלבונים ללא תווית נקשרים למטרות המסומנות בפלואורופור, הגודל המולקולרי של קומפלקס החלבון גדל, ומפחית את תנועתו הסיבובית. כתוצאה מכך, האור הנפלט הופך מקוטב יותר, עם פליטה גבוהה יותר במישור האנכי מאשר במישור האופקי - מה שמגדיל את האניזוטרופיה.

הוסף ריכוזים הולכים וגדלים של החלבון הלא מסומן וחזור על מדידת האניזוטרופיה.

עלייה לא ליניארית באניזוטרופיה עם תוספת חלבון מוגברת ללא תווית מצביעה על קשירת חלבון ללא תווית במספר אתרי קשירה לא זהים על חלבוני המטרה המתויגים בפלואורופור.

מערבבים 3 ננומול של חלבון SBDS-FlAsH עם 3 ננומול של הצבע הירוק Lumio בנפח של 5 מיקרוליטר של מאגר אניזוטרופי. תן לתגובה להימשך 8 שעות בחום של 4 מעלות צלזיוס. לאחר 8 שעות, יש לבצע דיאליזה של הדגימה כנגד מאגר האניזוטרופיה למשך הלילה כדי להסיר את הצבע החופשי. מדוד את הספיגה ב-280 ננומטר ו-508 ננומטר בספקטרופוטומטר באמצעות קובטת קוורץ. לאחר מכן, השתמש בחוק למברט-ביר כדי לכמת את אחוז החלבון המסומן כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לפני מדידת ערך האניזוטרופיה, כל שלב טיטרציה של ליגנד החלבון צריך להיעשות בזהירות, ולוודא שהדגימה כולה מוזרמת לתמיסה, והופכת להומוגנית.

בקובטה פלואורסצנטית, הנח 200 מיקרוליטר של 30 ננו-מולרי SBDS-FlAsH במאגר אניזוטרופי, וטטראט 2 מיקרוליטר של 30 מיקרו-מולרי EFL1. מערבבים היטב, ונותנים לתגובה לעמוד במשך 3 דקות לפני מדידת ערך האניזוטרופיה והפלואורסצנטיות. חזור על תהליך זה עד להוספת נפח כולל של 40 מיקרוליטר של EFL1. כשלב אחרון, התאם את הנתונים למודל כריכה משוער, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.