הדמיה של קספאזות דלקתיות המושרות קרבה במקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה להשגת מקרופאגים שמקורם במונוציטים (MDM) מדגימות דם אנושיות, שיטה פשוטה להחדרה יעילה של כתבי השלמה פלואורסצנטית דו-עינית (BiFC) של קספאזה דלקתית ל-MDM אנושי מבלי להתפשר על הכדאיות וההתנהגות של התאים, וגישה מבוססת הדמיה למדידת הפעלת קספאזה דלקתית בתאים חיים.

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שניתן להשתמש בו כדי לדמיין ולחקור מסלול קספאזה דלקתי ברמה המולקולרית בתאים חיים במצב מחלה מסוים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לזהות את המרכיבים, הדרישות והלוקליזציה של קומפלקסי ההפעלה של הקספאזה הדלקתית בתאי מערכת החיסון הראשוניים. עם אופטימיזציות קלות, ניתן להתאים שיטה זו לתאים ראשוניים אחרים ולמגוון חלבונים המופעלים על ידי אוליגומריזציה, ויישומה אינו מוגבל למתודולוגיות מיקרוסקופיות.

ראשית, שאפו את המדיה מקרופאגים מובחנים לחלוטין על כלים בקוטר 10 ס"מ ושטפו את מונו-שכבת התאים במדיום RPMI-1640 חם ללא סרום, תוך הסרת כל המדיה לחלוטין. קוצרים את התאים על ידי הוספת שני מיליליטרים של תמיסת טריפסין-EDTA חמה של 0.25% לכל מנה של 10 סנטימטרים. יש לטפטף בעדינות את הטריפסין-EDTA למעלה ולמטה על פני המנה כולה עם מיקרופיפט P-1000, ולאחר מכן מעבירים את המתלים לצינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטרים של מדיום תרבית שלם חם.

בדוק אם יש ניתוק תאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר והתנתק שוב במידת הצורך. לשאוף את המדיום ולהחיות את התאים ב 10 מיליליטרים של 1X PBS סטרילי מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן קח 20 אליקוט מיקרוליטר כדי לקבוע את מספר התא באמצעות המוציטומטר.

קח אחד עד פעמיים 10 עד התאים החמישיים לכל טרנספקציה והנח אותם בצינור 15 מיליליטר. הביאו לנפח סופי של 15 מיליליטרים עם PBS סטרילי 1X מחומם מראש. שאפו את ה-PBS והצנטריפוגה פעם נוספת למשך דקה אחת ב-250 x גרם.

הסר כל PBS שיורי מכדור התא באמצעות מיקרופיפט P-200. קחו מיקרו-צינורית סטרילית של 1.5 מיליליטר לכל טרנספקציה והוסיפו למכסה המנוע את הפלסמיד העיתונאי המתאים ואת הפלסמידים של Caspase BiFC. מניחים את תחנת הפיפטה, המכשיר, הקצוות, צינורות האלקטרופורציה והפיפטה במכסה מנוע זרימה למינרי סטרילי.

התחברו והפעילו את התקן הגרעין. הזן את פרמטרי הטרנסקציה במסך האתחול המוצג. לחץ על מתח, הזן 1000 ולחץ על בוצע כדי להגדיר אותו ל- 1000 וולט.

לחץ על רוחב, הזן 40 ולחץ על בוצע כדי לכוון את הדופק ל- 40 אלפיות השנייה. לבסוף, לחץ על פולסים, הזן 2 ולחץ על בוצע כדי להגדיר את מספר הפולסים החשמליים ל-2. קח את אחד מצינורות האלקטרופורציה ומלא אותו בשלושה מיליליטר של חיץ אלקטרוליטי E בטמפרטורת החדר.

הכנס את צינור האלקטרופורציה למחזיק הפיפטה בתחנת הפיפטה, כדי לוודא שהאלקטרודה בצד הצינור פונה פנימה וצליל קליק נשמע כאשר הצינור מוכנס. קח את גלולת התא והוסף 10 מיקרוליטרים של חיץ R החייאה מחומם מראש עבור כל אחד עד פעמיים 10 לתאים החמישיים, וערבב בעדינות עם מיקרופיפט P-20. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תרחיף התא לכל צינור טרנספקציה וערבבו בעדינות עם מיקרופיפט P-20.

הכנס קצה לתוך הפיפטה על ידי לחיצה על כפתור הלחיצה לתחנה השנייה, כדי להבטיח שהמהדק מרים לחלוטין את גבעול ההרכבה של הבוכנה בקצה. לאחר מכן, לחץ על כפתור הלחיצה על הפיפטה לתחנה הראשונה וטבל לתוך הצינור הראשון המכיל תערובת DNA של תאים או פלסמידים כדי לשאוף את הדגימה. הכנס את הפיפטה עם הדגימה בזהירות רבה לתוך מחזיק הפיפטה, כדי לוודא שהפיפטה לוחצת ומונחת כראוי.

לחץ על הפעל במסך המגע והמתן עד שהפולסים החשמליים יימסרו. הסר באיטיות את הפיפטה מהתחנה ומיד הוסף את מתלה התאים הטרנסקטואליים לבאר המתאימה עם המדיום נטול האנטיביוטיקה שחומם מראש על ידי לחיצה איטית על כפתור הלחיצה לתחנה הראשונה. מנדנדים בעדינות את הצלחת עם תאים שעברו תעתוע ודגירה במשך שעה עד שלוש שעות בחממת תרביות רקמה לחה, ואז מוסיפים 200 מיקרוליטרים של מדיום תרבית שחומם מראש לכל באר.

מניחים את המנה באינקובטור ומאפשרים לפחות 24 שעות לביטוי גנים. למחרת, בדקו את הכדאיות של התא ואת יעילות הטרנספקציה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. הסר את המדיה מהתאים בזהירות באמצעות מיקרופיפט P-1000 והוסף 500 מיקרוליטרים של תמיסת הגירוי בצד הבאר.

כדי להפעיל בארות בקרה שלא טופלו, הוסיפו מדיום הדמיה ללא הגירוי. כדי לדמיין את התאים באמצעות אפיפלואורסצנציה או מיקרוסקופ קונפוקלי, הפעל את המיקרוסקופ ואת מקור האור הפלואורסצנטי בהתאם להוראות. בחרו את המטרה של 10 פעמים או 20 פעמים והניחו את צלחת התרבות על במת המיקרוסקופ.

מצא תאים מתחת למסנן 568 ננומטר עם חתיכת העין. והתמקדו בתאים המבטאים את התאים האדומים של הכתב. ספרו את כל התאים האדומים בשדה הראייה.

בעוד באותו שדה ראייה, שנה למסננים 488 או 512, ספר את מספר התאים האדומים שהם גם ירוקים. ספרו לפחות 100 תאים אדומים משלושה שדות לפחות. חשב את אחוז התאים המתעלים החיוביים לוונוס לכל שדה ראייה וממוצע את האחוזים המתקבלים עבור כל טיפול היטב כדי לקבל את סטיית התקן.

כדי לדמות את התאים באמצעות אפיפלואורסצנציה או מיקרוסקופ קונפוקלי, דמיינו את התמונה החיה של התאים על מסך המחשב כפי שנרכשה על ידי המצלמה. כוונו את המיקוד והמיקום של התאים באמצעות גלגל הבקרה והמיקוד של הג'ויסטיק. הגדר את אחוז כוח הלייזר וזמן החשיפה עבור לייזרים של 512 ננומטר או 488 ננומטר ו-568 ננומטר, כך שהאות בתמונה ייראה טוב ללא רוויה.

הפעל את הצילום החי ובחן את התמונה המתקבלת, כדי לוודא שניתן לראות שיא מובחן עבור כל קומה בהיסטוגרמות התצוגה עבור שני הערוצים. תוך כדי הדמיה של התמונה החיה של התאים, צלם מספר תמונות מייצגות של שדה המכיל תא אחד או יותר המבטאים את כתב mCherry או dsRedmito עבור כל באר של הצלחת. מונוציטים חיוביים נבחרים מסוג CD-14 שהודגרו עם GM-CSF במשך שבעה ימים הראו שינויים במורפולוגיה של התא במהלך תקופת ההתמיינות, מעבר מתאי תרחיף כדוריים לתאי תרחיף מסתובבים ומלאים, ולבסוף, לתאים מתפשטים יותר כאשר הם מתמיינים במלואם.

תאים שהתמיינו במלואם עברו טרנסקטציה עם זוגות ה-BiFC של הקספאזה VC ו-VN יחד עם הכתב פלסמיד dsRedmito, ששימש לסימון התאים שעברו טרנסקטציה. תאים שלא טופלו לא הראו פלואורסצנציה של נוגה. ובתאים שטופלו בניגריצין, caspase-1 BiFC הופיע כפונקטום יחיד עם הצורה האופיינית של כתמי ASC.

כמות של MDM חיובי לוונוס הראתה כי האחוז הגבוה ביותר של caspase-1 BiFC נראה בקבוצת הטיפול LPS בתוספת ניז'ריצין. על טיטרציה פלסמידית של זוגות קספאזה-1, 4 ו-5 פרו-BiFC, האחוז הגבוה ביותר של תאים חיוביים לוונוס נבע מ-400, 500 ו-1, 000 ננוגרם של פלסמיד שעבר טרנסקטציה, בהתאמה. תמונות קונפוקליות שהתקבלו עם מטרה של פי 20 משדה של תאים 24 שעות לאחר הטרנסקציה הראו כי התאים העוברים שלא טופלו הם בני קיימא מכיוון שהמיטוכונדריה שלמה.

לאחר הטיפול עם heme, קומפלקס caspase-1 מופיע כמו punctum ירוק יחיד דומה לזה המושרה על ידי nigericin. זכור להימנע מתנאים קשים וממניפולציה מוגזמת של התאים במהלך התמיינות, טרנספקציה וטיפול מכיוון שהוא יכול לגרום להפעלה ספונטנית ורמות רקע גבוהות של הפעלת קספאזה.