Name: טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית שימוש cytometry הזרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: למד שיטות לבידוד וניתוח של תאיות שלפוחיות בדם באמצעות ציטומטריית זרימה. השיטות כוללות זיהוי בודד וגישה מבוססת חרוזים לניתוח מדויק של אוכלוסיות תאיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לדייל הירשקורן מהדם מערכות מכון מחקר על עזרתו עם cytometer זרימת הגדרות מכשיר. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי HL095470 וHL072268 U01 וחוזי DoD W81XWH-10-1-0023 וW81XWH-2-0028.

<ol><li>Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li>
<li>Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+platelet-derived+microparticle+formation--and+possible+side+effects-with+prestorage+leukofiltration+of+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).</li>
<li>Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Mause, S. F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles+Protagonists+of+a+Novel+Communication+Network+for+Intercellular+Information+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange.</a> Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).</li>
<li>Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributing+role+of+extracellular+vesicles+on+vascular+endothelium+haemostatic+balance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+Released+by+Melanoma+Cells+Prepare+Sentinel+Lymph+Nodes+for+Tumor+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis.</a> Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).</li>
<li>Gatti, S., Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+derived+from+human+adult+mesenchymal+stem+cells+protect+against+ischaemia-reperfusion-induced+acute+and+chronic+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+Dialysis+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).</li>
<li>Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microparticles%3A+square+the+circle%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating microparticles: square the circle.</a> BMC Cell Biology. 14 (1), 23(2013).</li>
<li>Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+functions%2C+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+to+understanding+microparticles%3A+standardized+isolation+and+identification+of+plasma+membrane-derived+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles.</a> Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).</li>
<li>Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -F., López, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+microparticles%3A+Pitfalls+and+protocol+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications.</a> Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).</li>
<li>Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+microparticles+by+flow+cytometry%3A+influence+of+centrifugation%2C+filtration+of+buffer%2C+and+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Health+and+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing.</a> Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).</li>
<li>Lacroix, R., Judicone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+pre-analytical+variables+in+plasma+microparticle+determination%3A+results+of+the+International+Society+on+Thrombosis+and+Haemostasis+SSC+Collaborative+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).</li>
<li>Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-analytical+issues+in+the+measurement+of+circulating+microparticles%3A+current+recommendations+and+pending+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).</li>
<li>Peramo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Characterization+of+Mouse+Deep+Vein+Thrombosis+Derived+Microparticles+by+Differential+Filtration+with+Nanopore+Filters%5BTitle%5D)+AND+%22Membranes%22%5BJournal%5D)">Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters.</a> Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Factor+Activity+is+Increased+in+a+Combined+Platelet+and+Microparticle+Sample+from+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+research%22%5BJournal%5D)">Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients.</a> Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).</li>
<li>Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+international%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).</li>
<li>Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+and+non-optical+methods+for+detection+and+characterization+of+microparticles+and+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+And+Haemostasis%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).</li>
<li>György, B., Szabó, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li>
<li>Miguet, L., Béchade, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+Malignant+B-Cell+Derived+Microparticles+Reveals+CD148+as+a+Potentially+Useful+Antigenic+Biomarker+for+Mantle+Cell+Lymphoma+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).</li>
<li>Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+discovery+of+21+proteins+expressed+in+human+plasma-derived+but+not+platelet-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).</li>
<li>Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+Limitations+of+Microparticle+Measurement+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Thrombosis+and+Hemostasis%22%5BJournal%5D)">Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).</li>
<li>Mobarrez, F., Antovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+flow+cytometric+assay+for+measurement+of+platelet-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).</li>
<li>Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+And+Haemostasis%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).</li>
<li>György, B., Szabó, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Flow+Cytometric+Assessment+Reveals+Distinct+Microvesicle+%28Cell-Derived+Microparticle%29+Signatures+in+Joint+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49726(2012).</li>
<li>György, B., Módos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+isolation+of+cell-derived+microparticles+are+compromised+by+protein+complexes+resulting+from+shared+biophysical+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters.</a> Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).</li>
<li>György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response%3A+systematic+use+of+Triton+lysis+as+a+control+for+microvesicle+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling.</a> Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).</li>
<li>Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotype+controls+in+phenotyping+and+quantification+of+microparticles%3A+a+major+source+of+error+and+how+to+evade+it%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).</li>
<li>Shet, A. S., Aras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li>
<li>Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+circulating+platelet-derived+microparticles+fail+to+bind+annexin+V%2C+lack+phospholipid-dependent+procoagulant+activity+and+demonstrate+greater+expression+of+glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib.</a> Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).</li>
<li>Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+And+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li>
<li>Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li>
<li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A.+77+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li>
</ol>

אי לנו ניגוד עניינים לחשוף.

שני פרוטוקולים שונים לבידוד, הטיפול והניתוח של כלי רכב חשמליים הוצגו, תוך שימוש בזיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. בחירה בשיטה המתאימה ביותר לשימוש היא לא תמיד פשוטה ודורש הבנה של המדגם נבדק, כמו גם תת-האוכלוסיות בודדות של עניין. יתר על כן, את הרגישות של cytometer שימש לרכישה יש לקחת בחשבון בעת ​​בחירת השיטה המתאימה ביותר. לעתים קרובות אין פרוטוקול בודד הטוב ביותר לשימוש, ולא, בשילוב של שיטות מספק מידע נוסף על מדגם מכל שיטה אחת בלבד. באופן אידיאלי, יש להעריך כמה טכניקות בידוד וזיהוי ...

תאי שלפוחית ​​(EVS) היא שלפוחית ​​שנמצאה בנוזלי גוף, כי הם מעורבים מאוד בתקשורת בין תאים ומסייעים בויסות מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים קטנה, המופק מקרום. ניתוח של כלי רכב חשמליים באמצעות cytometry זרימה (FCM) כבר קשה לשמצה בשל גודלם הקטן וחוסר אוכלוסיות בדידות חיוביות לסמנים של עניין. שיטות לניתוח EV, תוך שיפור ניכר בעשור האחרון, עדיין בתהליך עבודה. למרבה הצער, אין אף אחד בגודל שמתאים לכל פרוטוקול, וכמה היבטים יש לקחת בחשבון בעת ​​קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. מוצג כאן מספר טכניקות שונות לכלי רכב חשמליים עיבוד ושני פרוטוקולים לניתוח כלי רכב חשמליים או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. השיטות שתוארו כאן יסייע בביטול מצרפי הנוגדן נמצאים בדרך כלל בהכנות מסחריות, יחס אות לרעש גובר, ושערים הגדרה בf רציונליםashion שממזער גילוי של הקרינה רקע. הפרוטוקול הראשון משתמש בשיטת זיהוי אישית שמתאים במיוחד לניתוח נפח גבוה של דגימות קליניות, בעוד שהפרוטוקול השני משתמש בגישה מבוססת חרוז כדי ללכוד ולזהות כלי רכב חשמליים וexosomes קטנים יותר. כלי רכב חשמליים, הידוע גם בmicroparticles, הם שלפוחית ​​שנמצאה בנוזלי גוף שמעורבים בתקשורת בין תאים ומסייעים בויסות מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים 1 קטנה, המופק מקרום. דרך ביטוי של סמנים שונים משטח ו / או העברה ישירה של חומר ביולוגי, כלי רכב חשמליים יכולים לשנות את התפקוד של תאי נמען לשחק או הפעלה או דיכוי תפקידים בתקשורת בין תאית 2-4. כלי רכב חשמליים מבחינה קלינית, platelet-derived ידועים יש פעילות נוגדת קרישה חזקה 5, בעוד שאחרים כבר הוכיחו לתרום למגוון רחב של מצבים, מקידום metasta גידולsis 6 להגנה מפני מחלות 7. כלי רכב חשמליים יכול להיות מסווג לקטגוריות קטנות יותר של שלפוחית ​​שמקורן בתאים כגון exosomes וmicrovesicles (MVS), תלוי בגודל ובמנגנון של דור 8 שלהם. המינוח של תת-אוכלוסיות שלפוחית ​​שמקורן בתאים ממשיך להיות נושא לויכוח מתמשך 8,9, לעומת זאת, exosomes בדרך כלל מתואר כקטנים, 40 עד 100 חלקיקי ננומטר נגזרים מהיתוך endosomal עם קרום הפלזמה, בעוד MVS גדול יותר 100 עד 1,000 חלקיקי ננומטר נוצרו על ידי שפיכה של קרום הפלזמה 10. כאן, המונח הכללי &quot;הרכב החשמלי&quot; ישמש כדי להתייחס לכל הסוגים של שלפוחית ​​ביולוגית תאית שפורסמו על ידי תאים. בידוד של כלי רכב חשמליים מכל הדם הוא הליך רב-שלבים ומשתני עיבוד רבים ושונים הוכחו משפיעים על תוכן EV, כוללים טמפרטורת אחסון ומשך 11,12, נוגד קרישה / חומר משמר המשמש 13 ושיטת צנטריפוגה משמשת 14. צורך בסטנדרטיזציה של המשתנים הללו הוביל להמלצות על ידי האגודה הבינלאומית על פקקת ותהליכי עיבוד דם ובידוד EV haemostasis מדעיים ותקינת הוועדה (ISTH SSC) לנכון 15,16, עדיין לא קיים הסכמה בין חוקרים על הפרוטוקול האופטימלי להשתמש 12. רובם מסכימים, עם זאת, כי משתנים מראש אנליטיים פיקוח הדוק הם חיוניים לנתונים מדויקים ושחזור. על מנת לנתח את המכוניות חשמליות, חוקרים נצלו את שיטות שונות, ובכלל זה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים 17, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק 18,19, במיקרוסקופ כוח אטומי, אור דינמי פיזור 20,21 ומערבי סופג 22,23. בעוד FCM הוא שיטת בחירה של חוקרים רבים 9,24 - 26 בשל יכולות התפוקה הגבוהה שלה, ניתוח של כלי רכב חשמליים באמצעות FCM היהקשה לשמצה בשל הגודל וחוסר אוכלוסיות חיוביות בדידות 27 - 32. בהשוואה לניתוח של תאים, גודלו הקטן של כלי הרכב החשמליים בתוצאות 1) הקרינה הנפלטת פחות בשל המספר קטן יותר של אנטיגנים לכל חלקיק ו- 2) ההיתכנות מוגבלת של שטיפת הודעה כתם-, שיש צורך להפחית את קרינת רקע. אתגרים משותפים בין חוקרים כוללים אותות הנובעים מאגרגטים אימונוגלובולין 27,28 וצבירה עצמית של נוגדנים 29. יתר על כן, פעמים העיבוד הארוכות ונהלי כביסה / בידוד ממושכים בשימוש על ידי רב של הפרוטוקולים הנוכחיים 33,34 דורשים התחייבויות זמן רב היום לנתח מספר קטן של דוגמאות, שהופך אותם פחות אידיאלי עבור יישומי תפוקה גבוהים. חלק מהחוקרים לוותר שלב לשטוף לגמרי, טיוח בקרות שליליות FCM משמשים באופן מסורתי כמו מינוס הקרינה אחד (FMO) וisotypes נוגדן חסר תועלת עבור במדויק הערכת Bacהקרינה kground 30. הפרוטוקולים שלנו מטפל בשלוש בעיות נפוצות שיכול לעכב ניתוח FCM נאות של כלי רכב חשמליים: אותות הנובעים מאגרגטים נוגדן ולא שלפוחית ​​אחרת, קושי בהסרת נוגדן מאוגד, וחוסר אוכלוסיות חיוביות ניכרו. הטכניקות המתוארות כאן יסייעו בביטול מצרפי הנוגדן נמצאים בדרך כלל בהכנות מסחריות, הגדלת יחס אות לרעש, וקביעת שערים בצורה רציונלית שממזערת גילוי של הקרינה רקע. שתי שיטות זיהוי שונות מוצגות כאן: הפרוטוקול הראשון משתמש בשיטת זיהוי אישית שמתאים במיוחד לניתוח נפח גבוה של דגימות קליניות, בעוד שהפרוטוקול השני משתמש בגישה מבוססת חרוזים כדי ללכוד ולזהות כלי רכב חשמליים וexosomes קטנים יותר.

<table><tbody><tr><td>LSR II ציטומטר זרימה שולחנית</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>3 לייזר (20 mW ספיר קוהרנטי 488 ננומטר כחול, 25 mW קוהרנטי Vioflame 405 ננומטר סגול ו-17 mW JDS חד פאזי HeNe 633 ננומטר אדום)</td></tr><tr><td>תוכנת FACS Diva&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>PC גרסה 6.0</td></tr><tr><td>תוכנת FlowJo&nbsp;</td><td>Treestar US</td><td></td><td>Mac גרסה 9.6.1 או PC גרסה 7.6.5</td></tr><tr><td>חלקיקי פלואורסצנט Sphero Rainbow</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>556298 משמש להתאמת כל מתחי הערוץ כדי לשמור על עקביות עוצמת הקרינה&nbsp;</td></tr><tr><td>חלקיקים פלואורסצנטיים אולטרה ריינבו&nbsp;</td><td>Spherotech</td><td>URFP-10-5</td><td>משמש בנוסף לחרוזי SSC של Megamix-Plus כדי להבטיח עקביות שער EV מאצווה לאצווה</td></tr><tr><td>חרוזי Megmix-Plus SSC</td><td>Biocytex</td><td>7803</td><td>משמש להתאמת מתחי FSC ו-SSC&nbsp; לשמירה על עקביות&nbsp; בין ריצות. יכול לשמש גם לניטור קצב הזרימה וחוגת קצב הזרימה המדויקת על מנת להבטיח שאותו קצב זרימה משמש בכל הריצות</td></tr><tr><td>AbC Anti-Mouse Bead Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A-10344</td><td>המשמש לבקרות פיצוי וחרוזי AbC שליליים המשמשים לשיטה מבוססת חרוזים</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td> <td>סנטה קרוז&nbsp;</td><td>SC-281108</td><td>משמש בשיטת הזיהוי הפרטנית רק כדי ליז דגימות לאחר קריאה ראשונית לשימוש כבקרות שליליות. ניתן לדלל את המלאי ל-1:10 ב-PBS ולאחסן במקרר עד חודש.</td></tr><tr><td>340334 להשתמש בצינורות BD TruCOUNT</td> BD <td>Biosciences</td><td></td><td>בכל פעם שיש צורך בריכוזי EV מוחלטים</td></tr><tr><td>Ultrafree-MC, GV 0.22 ומיקרו; מ יחידות סינון צנטריפוגליות</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>UFC30GVNB</td><td>משמש לשטיפה לאחר כתמים של Evs ו/או לפיצול EVs על סמך גודל</td></tr><tr><td>צינורות דם מלא מזכוכית Vacutainer ACD-A</td><td>BD Biosciences</td><td>364606</td><td></td></tr><tr><td>צינורות Facs 12x75 polystrene</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל מאגרים עטופים בנפרד</td><td>Phoenix</td><td>RR-50-1s</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak פיפט טיפים - 10 ומיקרו; l</td><td>קצות פיפט Rainin</td><td>GP-L10S</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak -200 ומיקרו; l&nbsp;</td><td>Rainin</td><td>GP-L250S</td><td></td></tr><tr><td>ירוק - קצות פיפט פאק - 1,000 ומיקרו; l&nbsp;</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000S</td><td></td></tr><tr><td>מחסנית יציבה L300 טיפים מעוקרים מראש</td><td>Rainin</td><td>SS-L300S</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite&nbsp;XLS 8 ערוצים LTS&nbsp; מתכוונן&nbsp; מרווח&nbsp;</td><td>Rainin</td><td>LA8-300XLS</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחות תרבית רקמות</td><td>באר E& K Scientific</td><td>EK-20180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 מדיה (ללא Hepes)</td><td>מתקן תרבית תאים UCSF</td><td>CCFAE001</td><td>מדיה המשמשת לשיטת זיהוי מבוססת חרוזים</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS D-PBS, ללא CaMg, 0.2 ומיקרו; מתקן</td><td>תרבית תאים UCSF</td> מסונן <td>CCFAL003</td><td></td></tr><tr><td>צינור אולטרה-צנטריפוגה, קיר דק, אולטרה-ברור</td><td>BECKMAN COULTER INC</td><td></td><td></td></tr> 344058 <tr><td>פאנל I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>344808</td><td>2 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>CD14 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301820</td><td>2 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>CD16 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560474</td><td>2 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>CD28 FITC</td><td>biolegend</td><td>302906</td><td>2 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>CD152 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555855</td><td>2 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>CD19 A700</td><td>Biolegend</td><td>302226</td><td>2 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>PANEL II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD41a PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>340930</td><td>2 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>CD62L APC</td><td>Biolegend</td><td>304810</td><td>2 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>CD108 PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>552830</td><td>2 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>CD235a FITC</td><td>biolegend</td><td>349104</td><td>2 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>פאנל III</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301322</td><td>2 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>CD62p APC</td><td>Biolegend</td><td>304910</td><td>2 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>CD66b PE&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305106</td><td>2 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>CD15 FITC</td><td>exalpha</td><td>X1496M</td><td>5 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>CD9 PE</td><td>Biolegend</td><td>555372</td><td></td></tr><tr><td>CD63 APC</td><td>Biolegend</td><td>353008</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ms IgG2a, &kappa;</td><td>ביולג'נד</td><td>400230</td><td></td></tr></tbody></table>

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

תאי שלפוחית ​​(EVS) היא שלפוחית ​​שנמצאה בנוזלי גוף, כי הם מעורבים מאוד בתקשורת בין תאים ומסייעים בויסות מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים קטנה, המופק מקרום. ניתוח של כלי רכב חשמליים באמצעות cytometry זרימה (FCM) כבר קשה לשמצה בשל גודלם הקטן וחוסר אוכלוסיות בדידות חיוביות לסמנים של עניין. שיטות לניתוח EV, תוך שיפור ניכר בעשור האחרון, עדיין בתהליך עבודה. למרבה הצער, אין אף אחד בגודל שמתאים לכל פרוטוקול, וכמה היבטים יש לקחת בחשבון בעת ​​קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. מוצג כאן מספר טכניקות שונות לכלי רכב חשמליים עיבוד ושני פרוטוקולים לניתוח כלי רכב חשמליים או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. השיטות שתוארו כאן יסייע בביטול מצרפי הנוגדן נמצאים בדרך כלל בהכנות מסחריות, יחס אות לרעש גובר, ושערים הגדרה בf רציונליםashion שממזער גילוי של הקרינה רקע. הפרוטוקול הראשון משתמש בשיטת זיהוי אישית שמתאים במיוחד לניתוח נפח גבוה של דגימות קליניות, בעוד שהפרוטוקול השני משתמש בגישה מבוססת חרוז כדי ללכוד ולזהות כלי רכב חשמליים וexosomes קטנים יותר.

<html> איור 1 מתאר את התכנית הכוללת לעיבוד הבידוד וזיהוי של כלי רכב חשמליים או באמצעות השיטה המבוססת על חרוז או שיטת זיהוי אישית. זיהוי אישי של כלי רכב חשמליים באמצעות FCM עובד היטב לניתוח רכב חשמלי גדול יותר אבל רוב cytometers אינו מסוגל בנפרד גילוי חלקיקים קטנים כמו exosomes. גישה מבוססת חרוז מאפשרת כלי רכב חשמליים קטנים כדי להתגלות, עם זאת, יש חסרונות הקשורים בשימוש בשיטה זו, כפי שמתוארים בטבלה 1. באופן כללי, בידוד של כלי רכב חשמליים באמצעות ult...

שיטות שונות רבות קיימות למדידה של שלפוחית ​​תאית (EVS) באמצעות cytometry זרימה (FCM). כמה היבטים יש לשקול בעת קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. שני פרוטוקולים לכלי רכב חשמליים מדידה מוצגים, או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז.

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד ולנתח את סירקולציית הוויזקולות החוץ-תאיות בדם באמצעות שתי שיטות שונות. עבור שיטת הזיהוי של הוויזקולות החוץ-תאיות הבודדות, תחילה מבודד פלזמה דלה בטסיות (Platelet poor plasma או PPP) מדגימת דם.לאחר מכן צובעים את ה-PPP עם הנוגדנים הרלוונטיים הצמודים לפלואורוכרום. עבור שיטת הזיהוי המבוססת על חרו지를, מדגרירים את הוסיקולות החוץ-תאיות עם חרוזים, ולאחר מכן צובעים את הוסיקולות הקשורות לחרוזים עם הנוגדנים הרלוונטיים הצמודים לפלואורוכרום. בסופו של דבר, ניתן לקבוע את תכולת הוסיקולות החוץ-תאיות במחזור הדם על ידי ניתוח הדגימות באמצעות ציטומטריה זרימה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית או הפרדה באמצעות חרוזי מגנט, הוא שהיא מהירה הרבה יותר ומאפשרת הערכה של כלל אוכלוסיית ה-extracellular vesicles, במקום להיות מוגבלת לתת-אוכלוסיות ספציפיות. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקשיים, שכן הצלחתה דורשת הקפדה מחמירה על התמרונים שהודגמו ועל פרמטרי הגדרת הציטומטר. על מנת להפיק נתונים באיכות גבוהה עם מינימום שונות יומית, התחילו בצנטריפוגציה של דגימות דם מלא כדי להפריד את הפלזמה מה-Buffy coat ומהתאים האדומים. לאחר מכן, העבירו מנות של 1.2 milliliter מהעליון של הפלזמה למבחנות צנטריפוגה של 1.5 milliliter, תוך הקפדה שלא להפריע לשכבות התחתונות המכילות את ה-buffy coat והתאים האדומים, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגציה שוב של העליון כדי להסיר טסיות דם ושברים תאיים גדולים.בסיום הסבוב, העבירו בזהירות את כל דגימות ה-PPP לצינורות חדשים, למעט 200 µL האחרונים, תוך הקפדה לא להפריע למשקעים. לאחר מכן, ערבבו את הפלזמה על ידי העברה למעלה ולמטה מספר פעמים והעבירו 320 µL מכל דגימה לשורה העליונה של פלטת 96 בארות. לצביעת הדגימות, שלבו את הנוגדנים הרלוונטיים עבור כל אחד משלושת הפאנלים לתוך צינורות סינון צנטריפוגיים נפרדים של 0.22 µm, וסבבו את הנוגדנים באמצעות צנטריפוגה בעלת זווית קבועה ומהירות אחת.כאשר כל הנוגדן עבר דרך המסנן, יש להוסיף את הכמות המתאימה של התערובת לכל באער בלוח של 96 באערים כפי שמוצג באיור. לאחר מכן, השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי לערבב את דגימות ה-PPP, ולאחר מכן העבירו 100 µl מכל דגימה אל הנוגדנים בשורה השנייה. ערבבו את הדגימות שוב, החליפו את הטיפים והעבירו 100 µl מדגימה לכל אחת משתי השורות הבאות של הנוגדנים בהתאם.עבור הניסוי, דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 4 °C לאחר 30 דקות, כאשר בכל באער בשורות שש עד שמונה נמצאים 220 µL של PBS, וכל זאת בתוך קבלינה ביולוגית. לאחר מכן, באמצעות פיפט רב-ערוצית בעלת רוחב מתכוונן, העבירו את תכולת כל באער למסננת הצנטריפוגית התואמת לו, ללא החלפת קצות הפיפט.השתמש ב-200 µL של PBS מאחת משורות השטיפה כדי לשטוף את הבארים מהן הוסרו הדגימות זה עתה. לאחר מכן, העבר את תמיסת השטיפה לאותם מסננים אליהם הוספו קודם לכן דגימות ה-PPP, וסגור את המסננים הצנטריפוגליים. לאחר שכל דגימות ה-PPP הצבועות הועברו יחד עם תמיסות השטיפה שלהן, סבב את הדגימות בצנטריפוגה עם רוטור קבוע.לאחר הסבוב, ודאו שלא נותר נוזל על גבי המסננים. לאחר מכן, השביו את התוכן שעל פני המסננים ב-300 microliters של PBS והעבירו את התוכן המושבה למבחנות מסומנות מראש לצורך ניתוח מיידי בציטומטריה עם זרימה. שטיפת הדגימות הצבועות באמצעות מסננים צנטריפוגליים משפרת את ההפרדה בין הרקע לבין אותות הסמן החיוביים.עם זאת, חשוב לציין כי חלק מהשלpouliות החוץ-תאיות הקטנות יותר, כולל אקסוזומים, עלולות ללכת לאיבוד דרך נקבוביות המסנן. כדי לנתח את הדגימות, הגדירו תחילה את פרמטרי המתח של הפיזור הקדמי והצדי (forward and side scatter) לסולם לוגריתמי ובחרו בסף הנמוך ביותר המותר על ידי הציטומטר עבור כל פרמטר. לאחר מכן, בעת הרצת מבחנה של PBS מסונן ב-0.22 µm, כווננו מתחים אלו לערכים הגבוהים ביותר שמוציאים את מרבית רעשי הרקע. לבסוף, הריצו מבחנה המכילה תערובת של חרו지를 בגודל של 1 µm ומטה, וציירו שער (gate) סביב אוכלוסיית החרו지를 בגרף של פיזור קדמי מול פיזור צדי כדי לתפוס את כל האירועים שמתחת לחרו지를 של 1 µm.כעת הגדירו את קצב הזרימה של הציטומטר לנמוך והשתמשו בחרוזים כדי לכוון את חוגת קצב הזרימה בציטומטר לקצב האירועים הרצוי. לאחר מכן, באמצעות מבחנה של חלקיקים פלואורסצנטיים רב-גוניים (rainbow) המדוללים ב-PBS, רכשו 5,000 אירועים, תוך תיעוד עוצמת הערכים הממוצעת עבור ה-forward scatter, ה-side scatter וכל ערוץ צבע. כאשר כל הפרמטרים מוגדרים, הפעילו כל דגימה למשך דקה אחת או שתי דקות בדיוק. לאחר השלמת הקריאה הראשונה עבור כל מבחנה, ערבבו 20 µL של 10%MP 40 לתוך כל דגימה, וקראו שוב את המבחנות למשך אותו פרק זמן כדי לאפשר את החסרת האירועים החיוביים שזוהו בדגימה המלוחית (lysed) לאורך פרק זמן שווה.כדי לזהות וזיקולות חוץ-תאיות באמצעות לכידה מבוססת חרוצים, התחילו בשטיפה של חרוצי פוליסטירן לא מצופים בגודל 6 µm פעמיים עם מצע RPMI, ולאחר מכן בביצוע Resus בשני מיליליטר של אותו מצע. בשלב הבא, הוסיפו 6,000 חרוצים לכל מבחנת fax חדשה: למבחנת הביקורת השלילית הוסיפו 400 µL של מצע, ולשאר המבחנות הוסיפו 200 µL של PPP או וזיקולות חוץ-תאיות שעברו אולטרה-צנטריפוגה לפי הצורך, ו-200 µL של מצע. התאימו את הנפח הסופי בכל מבחנה ל-400 µL.עם מצע נוסף. דגרו את המבחנות למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C על שייקר. למחרת בבוקר, שטפו את החרוזים עם 2 mL של מצע.שאבו את העליון (supernatant) ומנעו קישור לא ספציפי באמצעות 400 µL של 5% bovine serum albumin; הניחו על שייקר בטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש שעות. לאחר שלוש שעות, שטפו את החרוזיים ב-2 mL נוספים של מדיום ותלו את המשקעים ב-100 µL של מדיום טרי. כעת סננו את הנוגדנים והוסיפו לכל מבחנה את הנפח המתאים של תערובת נוגדנים מסוננת, ולאחר 30 דקות ב-4 °C, שטפו את החרוזיים ב-2 mL נוספים של מדיום.בשלב זה, השביה מחדש את המשקעים ב-400 microliters של מדיום ובצע ניתוח מיידי של הדגימות באמצעות ציטומטריית זרימה, תוך התאמת פרמטרי ה-forward inside scatter לסף הנמוך ביותר המותר על ידי הציטומטר, כפי שהודגם זה עתה. לבסוף, הגדר שער (gate) לאוכלוסיית חרוזי הסינגלט ורכוש 2000 אירועים לדגימה. ניתן להשתמש הן בשיטת הזיהוי האינדיבידואלית והן בשיטת הזיהוי מבוססת החרוזים כדי לזהות את נוכחות השלפוחיות החוץ-תאיות בדגימות ה-PPP, כפי שמוצג בתרשימי נקודות אלו. עבור בדיקת הזיהוי האינדיבידואלית, נעשה שימוש בביקורת המלוחית (lysed control) כדי לקבוע את השערים עבור הדגימה הבלתי-רשומה התואמת.מרבית האירועים צריכים להיכנס למסגרת (gate) של הוויזקולות החוץ-תאיות. לדוגמה, בדמות זו, תרשימי הפרמטרים הכפולים הראו זיהוי של הסמנים, CD 1 0 8 A ו-CD 2 35 A, שהם שני סמנים של תאי דם אדומים הידועים כמי שנמצאים יחד על גבי תאים. כצפוי, למעלה ממחצית מהאירועים החיוביים בוויזקולות החוץ-תאיות הם חיוביים לשני הסמנים, בעוד שבתרשימי הפרמטרים הכפולים הללו, ביטוי של שני סמנים בוויזקולות החוץ-תאיות, אשר ידוע כי אינם נמצאים יחד על גבי תאים, מראה אוכלוסיות חיוביות נפרדות ומובחנות בשימוש בשיטת הזיהוי מבוססת החרוזיים.אין הפרדה בין האוכלוסיות החיוביות והשליליות ואירועים מופיעים ברבעים הכפוליים החיוביים, למרות שבדרך כלל הם אינם נמצאים באותם סוגי תאים, וזאת בשל העובדה ששני סוגי הוסיקולות החוץ-תאיות נקשרים לחרוז בודד. לכן, את הנתונים משיטה זו מומלץ לנתח באמצעות היסטוגרמות המוטלות על נתוני הביקורת השלילית, כאשר ניתן להבחין בהסטה בביטוי הסמן בדגימות עם החרוזים בהשוואה לביקורות לאחר רכישת מיומנות בשיטה. ניתן להשתמש בטכניקה זו לניתוח של 12 דגימות דם עם שלושה פאנלים של נוגדנים תוך שלוש עד ארבע שעות בשיטת הזיהוי האינדיבידואלית, או תוך יום וחצי בשיטת החרוזים, במידה והיא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על עקביות בטיפול בכל דגימה, ולהבטיח שקצב הזרימה של הציטומטר ועוצמות הפלואורסצנציה כוילו כראוי בתחילת כל ניסוי כדי להתאימן להגדרות הניסוייות של היום הקודם, במיוחד כאשר מריצים דגימות מרובות לאורך מספר ימים.

techniques-for-analysis-extracellular-vesicles-using-flow

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים את הלכידה החיסונית של שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות צימודים של ננו-חלקיקים מגנטיים עם תווית פלואורסצנטית. התהליך כולל היווצרות מורכבת, צביעה בנוגדני זיהוי מסומנים פלואורסצנטית, הפרדה מגנטית וניתוח ציטומטרי זרימה לאפיון אנטיגני.

לכידה חיסונית וציטומטריית זרימה של שלפוחיות חוץ-תאיות לאפיון אנטיגני

וירוסים או שלפוחיות חוץ-תאיות נלכדו חיסונית עם ננו-חלקיקים מגנטיים של 15 ננומטר יחד עם נוגדנים המזהים אנטיגנים על פני השטח. הנגיפים או השלפוחיות שנתפסו סומנו בנוגדנים פלואורסצנטיים כנגד אנטיגנים אחרים על פני השטח. הקומפלקסים שהתקבלו הופרדו בשדה מגנטי גבוה ונותחו באמצעות ציטומטרים זרימה קונבנציונליים המופעלים על פלואורסצנטיות.

זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את זרימת העבודה מלאה עבור בידוד מהיר של שלפוחית חוץ-תאי של דם אנושי ואפיון של סמני ספציפיים על-ידי ניתוח מעקב nanoparticle מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית. התוצאות שהוצגו להציג רמה גבוהה של הפארמצבטית, ניתן לכוונן תא תרבות supernatants.

אפיון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מהירה של יחיד חוץ-תאית שלפוחית בדם אנושי עם ניתוח מעקב ננו-חלקיק

הפרוטוקול מתאר שיטה ישימה מיועד לשימוש עם תא תרבות supernatants לאתר epitopes משטח על שלפוחית קטנה חוץ-תאית (EV). הוא מנצל immunoprecipitation EV ספציפי באמצעות חרוזים בשילוב עם נוגדנים מזהה אנטיגן פני שטח CD9, CD63, CD81. השיטה ממוטבים לניתוח cytometry במורד הזרם.

זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

הדור האחרון של כלי אפיון EV מסוגלים לנתח EV יחיד על פני מספר פרמטרים בו זמנית. ציטומטריה של זרימה ננו מודדת את כל החלקיקים הביולוגיים הגדולים מ-45 ננומטר ללא התוויה ומזהה מאפיינים ספציפיים של תת-אוכלוסיות על ידי מגוון טכניקות תיוג פלואורסצנטיות.

אפיון חלבון טרנס-ממברנה חוץ-תאי יחיד על-ידי ציטומטריה של זרימה ננו

פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד מהירה וספציפית לגודל עבור בועיות חוץ-תאיות קטנות על ידי מיטוב גודל פיית ריסוס האוויר, לחץ נוזל הנדן, לחץ זרימת הדגימה, מתח, רווח ופרמטרי סף הפעלה.

אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטרי של זרימה לבידוד וטיהור של בועיות חוץ-תאיות קטנות בתפוקה גבוהה

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט המאפשר הערכה חוץ גופית של שפע המיקרו-רנ"א המסומן באופן פלואורסצנטי כדי לחקור את הדינמיקה של אריזות מיקרו-רנ"א ולייצא לשלפוחיות חוץ-תאיות (EV).

מעקב אחר שחרור miRNA לתוך שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות ציטומטריית זרימה

כאן, אנו מדגימים את שיטת האפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שנאספו מנוזלים ביולוגיים, כגון דמעות ורוק, של נבדקים אנושיים. הסורק המשמש בשיטה זו מסוגל לזהות את הפנוטיפ, הגודל וספירת החלקיקים הכוללת של EVs מ-1 מיקרוליטר של הדגימה.

אפיון שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים ביולוגיים

שיטה יעילה להשגת מטוהרים שברים meiotic קיימא מהעכבר testis מתואר, המשלבת תא מעודן דיסוציאציה פרוטוקול עם מיון פלורסנט התא הפעיל (FACS). שיטה זו מנצלת את ההבדלים בתוכן דנ"א צפיפות גרעינית של שברים meiotic בדידים.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

שימוש מוצלח של צבעי מעקב סלולרי כדי לעקוב אחר תפקוד תא חיסוני והתפשטות כרוכה במספר שלבים קריטיים. אנו מתארים שיטות ל: 1) קבלת תווית-ing הבהיר והאחיד, לשחזור קרום עם צבעים: 2) בחירת תנאי נתוני רכישת fluorochromes ו; ו3) בחירת מודל לכמת התפשטות תאים על בסיס דילול צבע.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

למד שיטות לבידוד וניתוח של תאיות שלפוחיות בדם באמצעות ציטומטריית זרימה. השיטות כוללות זיהוי בודד וגישה מבוססת חרוזים לניתוח מדויק של אוכלוסיות תאיות.

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

גלה סרטונים נוספים

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית שימוש cytometry הזרימה