טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד ולנתח את סירקולציית הוויזקולות החוץ-תאיות בדם באמצעות שתי שיטות שונות. עבור שיטת הזיהוי של הוויזקולות החוץ-תאיות הבודדות, תחילה מבודד פלזמה דלה בטסיות (Platelet poor plasma או PPP) מדגימת דם.

לאחר מכן צובעים את ה-PPP עם הנוגדנים הרלוונטיים הצמודים לפלואורוכרום. עבור שיטת הזיהוי המבוססת על חרו지를, מדגרירים את הוסיקולות החוץ-תאיות עם חרוזים, ולאחר מכן צובעים את הוסיקולות הקשורות לחרוזים עם הנוגדנים הרלוונטיים הצמודים לפלואורוכרום. בסופו של דבר, ניתן לקבוע את תכולת הוסיקולות החוץ-תאיות במחזור הדם על ידי ניתוח הדגימות באמצעות ציטומטריה זרימה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית או הפרדה באמצעות חרוזי מגנט, הוא שהיא מהירה הרבה יותר ומאפשרת הערכה של כלל אוכלוסיית ה-extracellular vesicles, במקום להיות מוגבלת לתת-אוכלוסיות ספציפיות. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקשיים, שכן הצלחתה דורשת הקפדה מחמירה על התמרונים שהודגמו ועל פרמטרי הגדרת הציטומטר. על מנת להפיק נתונים באיכות גבוהה עם מינימום שונות יומית, התחילו בצנטריפוגציה של דגימות דם מלא כדי להפריד את הפלזמה מה-Buffy coat ומהתאים האדומים. לאחר מכן, העבירו מנות של 1.2 milliliter מהעליון של הפלזמה למבחנות צנטריפוגה של 1.5 milliliter, תוך הקפדה שלא להפריע לשכבות התחתונות המכילות את ה-buffy coat והתאים האדומים, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגציה שוב של העליון כדי להסיר טסיות דם ושברים תאיים גדולים.

בסיום הסבוב, העבירו בזהירות את כל דגימות ה-PPP לצינורות חדשים, למעט 200 µL האחרונים, תוך הקפדה לא להפריע למשקעים. לאחר מכן, ערבבו את הפלזמה על ידי העברה למעלה ולמטה מספר פעמים והעבירו 320 µL מכל דגימה לשורה העליונה של פלטת 96 בארות. לצביעת הדגימות, שלבו את הנוגדנים הרלוונטיים עבור כל אחד משלושת הפאנלים לתוך צינורות סינון צנטריפוגיים נפרדים של 0.22 µm, וסבבו את הנוגדנים באמצעות צנטריפוגה בעלת זווית קבועה ומהירות אחת.

כאשר כל הנוגדן עבר דרך המסנן, יש להוסיף את הכמות המתאימה של התערובת לכל באער בלוח של 96 באערים כפי שמוצג באיור. לאחר מכן, השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי לערבב את דגימות ה-PPP, ולאחר מכן העבירו 100 µl מכל דגימה אל הנוגדנים בשורה השנייה. ערבבו את הדגימות שוב, החליפו את הטיפים והעבירו 100 µl מדגימה לכל אחת משתי השורות הבאות של הנוגדנים בהתאם.

עבור הניסוי, דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 4 °C לאחר 30 דקות, כאשר בכל באער בשורות שש עד שמונה נמצאים 220 µL של PBS, וכל זאת בתוך קבלינה ביולוגית. לאחר מכן, באמצעות פיפט רב-ערוצית בעלת רוחב מתכוונן, העבירו את תכולת כל באער למסננת הצנטריפוגית התואמת לו, ללא החלפת קצות הפיפט.

השתמש ב-200 µL של PBS מאחת משורות השטיפה כדי לשטוף את הבארים מהן הוסרו הדגימות זה עתה. לאחר מכן, העבר את תמיסת השטיפה לאותם מסננים אליהם הוספו קודם לכן דגימות ה-PPP, וסגור את המסננים הצנטריפוגליים. לאחר שכל דגימות ה-PPP הצבועות הועברו יחד עם תמיסות השטיפה שלהן, סבב את הדגימות בצנטריפוגה עם רוטור קבוע.

לאחר הסבוב, ודאו שלא נותר נוזל על גבי המסננים. לאחר מכן, השביו את התוכן שעל פני המסננים ב-300 microliters של PBS והעבירו את התוכן המושבה למבחנות מסומנות מראש לצורך ניתוח מיידי בציטומטריה עם זרימה. שטיפת הדגימות הצבועות באמצעות מסננים צנטריפוגליים משפרת את ההפרדה בין הרקע לבין אותות הסמן החיוביים.

עם זאת, חשוב לציין כי חלק מהשלpouliות החוץ-תאיות הקטנות יותר, כולל אקסוזומים, עלולות ללכת לאיבוד דרך נקבוביות המסנן. כדי לנתח את הדגימות, הגדירו תחילה את פרמטרי המתח של הפיזור הקדמי והצדי (forward and side scatter) לסולם לוגריתמי ובחרו בסף הנמוך ביותר המותר על ידי הציטומטר עבור כל פרמטר. לאחר מכן, בעת הרצת מבחנה של PBS מסונן ב-0.22 µm, כווננו מתחים אלו לערכים הגבוהים ביותר שמוציאים את מרבית רעשי הרקע. לבסוף, הריצו מבחנה המכילה תערובת של חרו지를 בגודל של 1 µm ומטה, וציירו שער (gate) סביב אוכלוסיית החרו지를 בגרף של פיזור קדמי מול פיזור צדי כדי לתפוס את כל האירועים שמתחת לחרו지를 של 1 µm.

כעת הגדירו את קצב הזרימה של הציטומטר לנמוך והשתמשו בחרוזים כדי לכוון את חוגת קצב הזרימה בציטומטר לקצב האירועים הרצוי. לאחר מכן, באמצעות מבחנה של חלקיקים פלואורסצנטיים רב-גוניים (rainbow) המדוללים ב-PBS, רכשו 5,000 אירועים, תוך תיעוד עוצמת הערכים הממוצעת עבור ה-forward scatter, ה-side scatter וכל ערוץ צבע. כאשר כל הפרמטרים מוגדרים, הפעילו כל דגימה למשך דקה אחת או שתי דקות בדיוק. לאחר השלמת הקריאה הראשונה עבור כל מבחנה, ערבבו 20 µL של 10%MP 40 לתוך כל דגימה, וקראו שוב את המבחנות למשך אותו פרק זמן כדי לאפשר את החסרת האירועים החיוביים שזוהו בדגימה המלוחית (lysed) לאורך פרק זמן שווה.

כדי לזהות וזיקולות חוץ-תאיות באמצעות לכידה מבוססת חרוצים, התחילו בשטיפה של חרוצי פוליסטירן לא מצופים בגודל 6 µm פעמיים עם מצע RPMI, ולאחר מכן בביצוע Resus בשני מיליליטר של אותו מצע. בשלב הבא, הוסיפו 6,000 חרוצים לכל מבחנת fax חדשה: למבחנת הביקורת השלילית הוסיפו 400 µL של מצע, ולשאר המבחנות הוסיפו 200 µL של PPP או וזיקולות חוץ-תאיות שעברו אולטרה-צנטריפוגה לפי הצורך, ו-200 µL של מצע. התאימו את הנפח הסופי בכל מבחנה ל-400 µL.

עם מצע נוסף. דגרו את המבחנות למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C על שייקר. למחרת בבוקר, שטפו את החרוזים עם 2 mL של מצע.

שאבו את העליון (supernatant) ומנעו קישור לא ספציפי באמצעות 400 µL של 5% bovine serum albumin; הניחו על שייקר בטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש שעות. לאחר שלוש שעות, שטפו את החרוזיים ב-2 mL נוספים של מדיום ותלו את המשקעים ב-100 µL של מדיום טרי. כעת סננו את הנוגדנים והוסיפו לכל מבחנה את הנפח המתאים של תערובת נוגדנים מסוננת, ולאחר 30 דקות ב-4 °C, שטפו את החרוזיים ב-2 mL נוספים של מדיום.

בשלב זה, השביה מחדש את המשקעים ב-400 microliters של מדיום ובצע ניתוח מיידי של הדגימות באמצעות ציטומטריית זרימה, תוך התאמת פרמטרי ה-forward inside scatter לסף הנמוך ביותר המותר על ידי הציטומטר, כפי שהודגם זה עתה. לבסוף, הגדר שער (gate) לאוכלוסיית חרוזי הסינגלט ורכוש 2000 אירועים לדגימה. ניתן להשתמש הן בשיטת הזיהוי האינדיבידואלית והן בשיטת הזיהוי מבוססת החרוזים כדי לזהות את נוכחות השלפוחיות החוץ-תאיות בדגימות ה-PPP, כפי שמוצג בתרשימי נקודות אלו. עבור בדיקת הזיהוי האינדיבידואלית, נעשה שימוש בביקורת המלוחית (lysed control) כדי לקבוע את השערים עבור הדגימה הבלתי-רשומה התואמת.

מרבית האירועים צריכים להיכנס למסגרת (gate) של הוויזקולות החוץ-תאיות. לדוגמה, בדמות זו, תרשימי הפרמטרים הכפולים הראו זיהוי של הסמנים, CD 1 0 8 A ו-CD 2 35 A, שהם שני סמנים של תאי דם אדומים הידועים כמי שנמצאים יחד על גבי תאים. כצפוי, למעלה ממחצית מהאירועים החיוביים בוויזקולות החוץ-תאיות הם חיוביים לשני הסמנים, בעוד שבתרשימי הפרמטרים הכפולים הללו, ביטוי של שני סמנים בוויזקולות החוץ-תאיות, אשר ידוע כי אינם נמצאים יחד על גבי תאים, מראה אוכלוסיות חיוביות נפרדות ומובחנות בשימוש בשיטת הזיהוי מבוססת החרוזיים.

אין הפרדה בין האוכלוסיות החיוביות והשליליות ואירועים מופיעים ברבעים הכפוליים החיוביים, למרות שבדרך כלל הם אינם נמצאים באותם סוגי תאים, וזאת בשל העובדה ששני סוגי הוסיקולות החוץ-תאיות נקשרים לחרוז בודד. לכן, את הנתונים משיטה זו מומלץ לנתח באמצעות היסטוגרמות המוטלות על נתוני הביקורת השלילית, כאשר ניתן להבחין בהסטה בביטוי הסמן בדגימות עם החרוזים בהשוואה לביקורות לאחר רכישת מיומנות בשיטה. ניתן להשתמש בטכניקה זו לניתוח של 12 דגימות דם עם שלושה פאנלים של נוגדנים תוך שלוש עד ארבע שעות בשיטת הזיהוי האינדיבידואלית, או תוך יום וחצי בשיטת החרוזים, במידה והיא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על עקביות בטיפול בכל דגימה, ולהבטיח שקצב הזרימה של הציטומטר ועוצמות הפלואורסצנציה כוילו כראוי בתחילת כל ניסוי כדי להתאימן להגדרות הניסוייות של היום הקודם, במיוחד כאשר מריצים דגימות מרובות לאורך מספר ימים.