טיהור ננו-חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית באמצעות כרומטוגרפיית זיקה

קחו תרחיף של חיידקים מהונדסים המבטאים ננו-חלקיקי חלבון רקומביננטיים בהרכבה עצמית עם תגי פוליהיסטידין.

סוניקט לשחרור רכיבים תוך-תאיים.

צנטריפוגה לאיסוף הסופרנטנט המכיל ננו-חלקיקי חלבון. מדללים אותו עם חוצץ נטול אימידזול.

קח עמודת כרומטוגרפיה של זיקה המכילה חרוזי אגרוז עם קטיוני ניקל משותקים.

הוסף מאגר עם ריכוז אימידזול נמוך לשיווי משקל עמודות.

הוסף את הליזט החיידקי על העמוד.

במהלך הריצה, הפוליהיסטידין על ננו-חלקיקי חלבון נקשר חזק לקטיוני ניקל.

בינתיים, מזהמים כמו ליפופוליסכרידים חיידקיים וחלבונים אחרים נקשרים חלש לעמודה.

שטפו עם מאגר המכיל ריכוז אימידזול נמוך כדי להסיר את החלבונים הקשורים חלש.

הכניסו איזופרופנול להסרת ליפופוליסכרידים ולאחר מכן שטפו.

לאחר מכן, הציגו מאגר עם ריכוז אימידזול בינוני. האימידזול מתחרה עם היסטידין על קשירה לקטיון הניקל, ומשחרר ננו-חלקיקי חלבון קשורים.

לאחר מכן, הוסף מאגר המכיל ריכוז גבוה של אימידזול כדי לחסל לחלוטין את ננו-חלקיקי החלבון.

אסוף את ננו-חלקיקי החלבון המטוהרים להמשך יישום.

לליזה של E. coli שנקטף המבטא את צרור ששת הסלילים SAPN, השתמש בבדיקה עם תפוקת סוניקציה של 150 וואט, עם ארבע שניות של סוניקציה ושש שניות של מנוחה כדי לסוניקציה של כדורי חיידקים תלויים ב-40 מיליליטר של מאגר נטול אימידזול על קרח למשך חמש דקות.

צנטריפוגה של הליזאט התאי כדי ליצור סופרנטנט מובהר, ולהעביר את הסופרנטנט לבקבוק סטרילי של 150 מיליליטר. לאחר מכן, הביאו את הדגימה לנפח סופי של 100 מיליליטר עם מאגר טרי ללא אימידזול.

כדי לבודד את החלבון המעניין, פתח את תוכנת FPLC ולחץ על שיטה חדשה אופציה. בתפריט הגדרות שיטה, פתח את התפריט הנפתח מיקום עמודה ובחר יציאת C1 3. בתפריט הנפתח Shown By Technique, בחר Affinity. בתפריט הנפתח Column Type, בחר Others, HisTrap HP וחמישה מיליליטר. נפח העמודה ותיבות הלחץ יוגדרו אוטומטית לערכים המתאימים.

לחץ על מתאר שיטה וגרור את הלחצנים שיווי משקל ויישום לדוגמה, שלושה לחצני שטיפת עמודות ולחצן Elution מהתפריט המוקפץ ספריית פאזות ליד החץ, לפני סגירת תפריט ספריית השלבים. לחץ על שיווי משקל והגדר את הערכים המפורטים בטבלה כמאגר התחלתי ב', 4%, מאגר סופי ב', 4% ונפח עמודות, 5.

לחץ על יישום לדוגמה. בתיבה טעינת דגימה, לחץ על לחצן האפשרויות עבור הזרקת דגימה בעמודה עם משאבת דגימה ואשר שהתיבה שליד השתמש בקצב זרימה מהגדרות שיטה מסומנת בהזרקת דגימה עם System Pump Box. שנה את ערך תיבת הנפח ל- 100 מיליליטר ואת ערכת איסוף השברים לזמין.

בטל את הלחיצה על התיבה השתמש בגודל שבר מהגדרות שיטה ושנה את גודל השבר לארבעה מיליליטר. לחץ על כפתור שטיפת העמודות הראשון. הגדר את הערכים המפורטים בטבלה למאגר ראשוני B, 4%, למאגר סופי B, 4% ולנפח עמודות, 10. לחץ על התיבה הפוך סכימת אוסף שברים לזמינה ובטל את הלחיצה על השתמש בגודל שבר עבור הגדרות שיטה. שנה את גודל השבר לארבעה מיליליטר ולחץ על לחצן שטיפת העמודות השני.

הגדר את הערכים בטבלה למאגר התחלתי B, 0%, למאגר סופי B, 0% ונפח עמודות, 5. לחץ על התיבה הפוך את סכימת אוסף השברים לזמינה ובטל את הלחיצה על השתמש בגודל שבר מהגדרות השיטה. שנה את גודל השבר ל-4 מיליליטר ולחץ על לחצן שטיפת העמודה השלישית. הגדר את הערכים בטבלה למאגר התחלתי B, 0%, מאגר סופי B, 0% ונפח עמודות, 10. לחץ על הלחצן Fraction Collection Scheme Enable ובטל את הלחיצה על התיבה Use Fraction Size for Method Settings. לאחר מכן, שנה את גודל השבר ל -4 מיליליטר.

לחץ על לחצן Elution ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על המידע בטבלה. בתפריט המוקפץ, לחץ על מחק צעד וגרור את לחצן מעבר צבע איזוקרטי לטבלה פעמיים כך שיהיו שני ערכים. הגדר את הערך עבור הערך הראשון למאגר התחלתי B, 30%, למאגר סופי B, 30% ולנפח עמודות, 10.

הגדר את הערך עבור הערך השני למאגר התחלתי B, 100%, למאגר סופי B, 100% ונפח עמודות, 10. לחץ על לחצן הפוך את ערכת אוסף השברים לזמינה ולחץ על התיבה השתמש בגודל שבר עבור הגדרות שיטה. לאחר מכן, לחץ על שמירה בשם ותן לקובץ, טיהור.

הנח את צינור המשאבה A של ה-FPLC לתוך מאגר הכביסה נטול האימידזול, ואת צינור המשאבה B לתוך מאגר האימידזול בנפח 500 מילי-מולרי. הנח את צינור משאבת הדגימה לתוך הדגימה של 100 מיליליטר והפעל את תוכנית הטיהור. כאשר יש צורך בשטיפת איזופרופנול של 60%, השהה את התוכנית, העבר את צינור המשאבה מהכביסה נטולת האימידזול לשטיפת 60% איזופרופנול והפעל מחדש את התוכנית. בתום הכביסה, השהה שוב את התוכנית, החזר את צינור המשאבה A למאגר הכביסה נטול האימידזול והפעל מחדש את תוכנית הטיהור.