שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע את זיקת הקשירה (binding affinity) של אינטראקציה בין חלבון לליגנד ללא טיהור החלבון מליזט תאי. דבר זה מושג תחילה על ידי ביטוי של חלבון העניין המהודבק ל-GFP בכל קו תאים דבקים. לאחר הכנת ליזט תאי ודילול הליגנדים, מכינים תערובות של ליזט תאי עם ליגנדים וטוענים אותן לתוך קפילרות.

בשלב הבא, נמדד ה-thermo phoresis של החלבון המהולב ל-GFP בנוכחות ריכוזי ליגנד משתנים. השלב הסופי הוא ניתוח נתונים של מדידות microscale thermophoresis או MST. בסופו של דבר, נעשה שימוש ב-microscale thermophoresis כדי לקבוע את זיקות הכשירה (binding affinities) של אינטראקציות בין חלבונים המהולבים ל-GFP לבין ליגנדים שונים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון טיטרציה, קלורימטריה או surface plasma resonance, הוא שהיא נמנעת מצורך בטיהור חלבונים, מה שמפשט ומאיץ משמעותית את האפיון הכמותי של אינטראקציות בינאריות. שיטה זו מציגה יתרונות משמעותיים בעבודה עם חלבונים שקשה לבטא ולטהר, כגון חלבוני ממברנה וגורמי שעתוק. אחד היתרונות הגדולים ביותר של microscale thermophoresis הוא שהיא פועלת במגוון של באפרים ועמידה לנוכחות של דטרגנטים ותאי מיקרוסיסטם. את הטכניקה תדגים קארן סטפקה, ביולוגית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, שטפו את התאים בקצרה במי מלח פוספט (PBS) קרים מאוד, תוך שימוש ב-10 milliliters של באפר לכל בקבוק T 75.

השאירו את התאים על קרח למשך חמש דקות או עד אשר יתחילו להינתק מהבקבוק. במידת הצורך, גרדו את התאים באמצעות מגרדת תאים כדי לנתקם. השאירו את התאים בסוספנזיה ב-10 milliliters של PBS קר מאוד והעבירו אותם למבחנת צנטריפוגה בעלת תחתית עגולה בנפח 14 milliliter שהקוררה מראש.

שקיעו את התאים על ידי סבוב בצנטריפוגה ב-400 עד 600 Gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ושסעו מחדש את המשקע ב-200 µL של בופר ליזיס קר מאוד. העבירו את התוך למבחנת אפנדורף של 1.5 mL שקוללה מראש לצורך מיצוי של חלבוני ציטוזול.

הנח את התאים על קרח כדי למזער חימום יתר מקומי, ובצע ליזיס של התאים באמצעות שלושה פולסים של סוניקציה למשך עשר שניות כל אחד בעוצמה של 30% amplitude. באמצעות טיפ שקודר במראש ברוחב של שני עד שלושה מילימטרים, החזק את הטיפ מתחת לפני השטח כדי למזער הקצפה. השמט שלב זה כאשר נעשה שימוש בבופר המכיל דטרגנט, והדגר על קרח למשך 30 דקות.

במקום זאת, תקנו במידת הצורך את תמיסת הליזאט כך שתכיל ריכוז מלח פיזיולוגי של 100 millimolar של sodium chloride, באמצעות תמיסת אם של five molar של sodium chloride. לבסוף, אספו את הליזאטים על ידי סנטריפוגציה בערך ב-25,000 Gs ובטמפרטורה של ארבע degrees Celsius למשך 10 דקות. בחרו במכשיר ה-MST במקור עירור מסוג דיודה פולטת אור או LED בעל אורך גל השווה ל-470 nanometers.

טענו את הנימיים בתמצית תאים המדוללת פי 2 ופי 10 בבופר MST והניחו אותם במכשיר ה-MST. בצעו את פעולת איתור הנימיים (find capillaries) בתוכנת הבקרה של מכשיר ה-MST. טווח הפלואורסצנציה האופטימלי בליזאט המדולל הוא בין 400 ל-1500 יחידות פלואורסצנציה.

המשיכו בקביעת טווח ריכוזי הליגנד האופטימלי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הניחו על קרח מעמד מבחנות עם המספר הדרוש של מבחנות צנטריפוגה בנפח 0.5 מיליליטר בעלות קישור נמוך (low bind); פפוטו 25 µL של MST buffer לתחתית כל מבחנה, פפוטו 25 µL של תמיסת הסטוק של הליגנד למבחנה הראשונה, ובצעו דילול סדרתי פי 2 של הליגנד באמצעות שאר המבחנות. השאירו את המעמד עם דגימות הליגנד על קרח.

חשבו את דילול ליזאט התאים כדי להגיע לרמה אופטימלית של חלבון המטרה הפלואורסצנטי בתגובות הקישור. ריכוז החלבון הסופי צריך להיות קרוב לקבוע הדיסוציאציה של הקישור הצפוי או נמוך ממנו, ויש להתאימו כדי להשיג את מספר ספירות הפלואורסצנציה הנדרש. בtפתרון הסופי, המשיכו לדלל את ליזאט התאים באמצעות MST Buffer.

מקמו מבחנות low bind בנפח 0.5 milliliter במעמד המבחנות מול המבחנות המכילות דגימות של דילול טורטי של הליגנד. הוסיפו בזהירות 15 microliters של תמצית תאים (cell lysate) לתחתית כל מבחנה. השתדלו לא לגעת בדפנות המבחנה כדי למנוע אובדן של הדגימה.

הוסיפו 15 µL של דגימת הליגנד בריכוז הגבוה ביותר למבחנה המתאימה. מספר אחת, עם הליזט התאי. ערבבו היטב והחליפו את טיפ הפפיטה.

חזור על שלב זה עם שאר המבחנות, למעט האחרונה, שאסורה להכיל ליגנד. הוסף 15 µl של MST buffer למבחנה האחרונה וערבב. מלא כשני שלישים מהנימי הראשון בתערובת הקישור ממבחנה מספר אחת.

הטה את הכלי כדי להעביר את התמיסה לעבר המרכז והנח את הנימיון על מגש הנימיות בעמדה מספר אחת; חזור על שלב זה עם שאר הנימיות. ניתן לאטום את קצות הנימיות בשעווה עבור ניסויים ממושכים יותר.

הנח את המגש בתוך מכשיר ה-MST וסגור את דלת המכשיר. לאחר מכן, בחר במקור עירור LED בעל אורך גל של 470 nanometers. במכשיר ה-MST, בצע את פקודת איתור הקפילריות (find capillaries) כדי לאפשר למכשיר למצוא את המיקומים המדויקים של הקפילריות ולמדוד את הפלואורסצנציה של הדגימות בהתבסס על עוצמת אות הפלואורסצנציה.

כוון את הספק ה-LED כדי להביאו לטווח שבין 400 ל-1500 יחידות. לחץ על כפתור ההפעלה (start) כדי לבצע את ניסוי התנגדות התרמי (Thermo Resis Experiment). ניתן לבחור ביותר מדרגת הספק אחת של לייזר אינפרא-אדום עבור הניסוי.

על מנת למצוא את מדרג הטמפרטורה האופטימלי עבור המערכת הספציפית, נדרשים 10 עד 12 דקות להרצת סט אחד של 16 קפילריות. אספו נתונים משתי עד שלוש הרצות עבור אותו סט של קפילריות כדי להבטיח את השחזוריות של המדידות. כדי להתחיל בניתוח הנתונים, פתחו את תוכנת הניתוח וטענו את תיקיית הפרויקט.

בצופה הנתונים שהופיע, בחרו את עקומות התרמורטיקה שנאספו בהספק לייזר IR ספציפי. הייתה אפשרות לפתוח את כל עקומות התרמורטיקה שנאספו תחת תנאים שונים בבת אחת, ולאחר מכן לבחור עקומות לניתוח על ידי הפעלתן או כיבוין. בחלון הגרף של נקודות ההערכה, בחרו את התרמורזיסטנסיות או התרמופורזיות עם קווי T jump כחולים ואדומים.

הגדר שני אזורים בעקומות הניסוי הנבחרים ידנית לצורך הניתוח על ידי התוכנה. ודא שהקווים הכחולים והאדומים ממוקמים נכון כדי לאפשר שינוי מקסימלי ב-Thermo Resis. כדי לקבל נקודות ממוצעות עם סטיות תקן, בחר באפשרות use average או distinguish runs עבור הרצות נפרדות.

כדי להפיק גרף של התאמה לקבוע הדיסוציאציה, יש לבחור בשימוש בממוצע (use average), להזין ולקבע את ערך הריכוז של המולקולה המסומנת ולהתאים את העקומה. קבוע הדיסוציאציה של הקישור או ערך ה-KD, יחד עם סטיית התקן שלו, יופיעו בחלון מידע נפרד. שמרו את נתוני ההתאמה הממוצעים בקובץ טקסט והעבירו אותם ל-Excel.Heck.

תאי 2 9 3 המבטאים STAT 3G FP שימשו כמקור ל-stat three מסומן פלואורסצנטית. עבור בדיקת קישור ל-DNA, קישור של אוליגנוקלאוטידים בעלי מטען גבוה הוביל לשינויים משמעותיים בניידות של STAT three. בגרדיאנט הטמפרטורה.

אות התרמו-רטיק מप्लोט כפונקציה של ריכוז האוליגונוקלאוטיד. כל נקודת נתון מייצגת ממוצע של שלוש מדידות. תוכנת Nano temporal analysis שימשה להתאמה ולביסוס ערכי ה-KD הגלויים.

קבועי הדיסוציאציה הנראה היו 37.9 פלוס או מינוס 1.0 µM עבור קישור למוטיב gas, ו-23.3 פלוס או מינוס 0.6 µM עבור קישור לאוליגונוקלאיד s plus 100 העשיר ב-AT. באופן מפתיע, רצפי s plus 100 הראו קישור הדוק מעט יותר מאשר gas. בשלוש חזרות של המדידה, החלפה של A ב-G גרמה לירידה דרמטית באפִיניות של מוטנט s plus 100 מספר אחת.

בעוד שהמוטנט s plus 100 two לא הראה קישור שניתן לזיהוי, ובכך אישר קישור סלקטיבי של רצף STAT three ל-s plus 100, לאחר ששולטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה בפחות משעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לזכור כי תנאים אופטימליים להפקה של חלבוני ממברנה יהיו שונים עבור חלבונים שונים ובדרך כלל דורשים אופטימיזציה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובהB של הדרך לקביעת זיקת קישור (binding affinity) של חלבון לליגנד ללא צורך בטיהור החלבון מתוך ליזט התאים.