שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את זיקת הקישור של אינטראקציה של ליגנד חלבון מבלי לטהר את החלבון מליזאט תא. זה מושג על ידי ביטוי ראשון של החלבון המותך GFP המעניין בכל קו תאים דבק. לאחר הכנת דילול ליזאט וליגנד תאים, מכינים תערובות ליגנד ליזאט תאים ונטענות לנימים.

לאחר מכן, נמדדת הרזיס התרמו של החלבון המותך GFP בנוכחות ריכוזי ליגנד משתנים. השלב האחרון הוא ניתוח נתונים של מדידות תרמו פרזיס בקנה מידה מיקרו או MST. בסופו של דבר, רזיס תרמי בקנה מידה מיקרו משמש לקביעת זיקות הקישור של אינטראקציות בין חלבונים התמזגו GFP וליגנדים שונים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות כמו טיטרציה, קלורימטריה או מונו פלזמה על פני השטח הוא ance, הוא שהיא נמנעת מטיהור חלבונים, האפיון הכמותי המפשט והמאיץ באופן משמעותי של אינטראקציות בינאריות. שיטה זו מציגה יתרונות משמעותיים בעבודה עם חלבונים שקשה לבטא ולטהר אותם, כגון חלבוני ממברנה וגורמי שעתוק. אחד היתרונות הגדולים ביותר של תרמו פרזיס בקנה מידה מיקרו הוא שהוא עובד במגוון חוצצים וסובל את נוכחותם של חומרי ניקוי והתאים שלי במערכת תדגים את הטכניקה קארן סטפקה, ביולוגית מהמעבדה שלי להתחיל לשטוף את התאים לזמן קצר עם מי מלח קרים של פוספט קר או PBS באמצעות 10 מיליליטר של חיץ לכל בקבוק T 75.

שמור את התאים על קרח למשך חמש דקות או עד שהם מתחילים להתנתק מהבקבוק. מגרדים את התאים בעזרת מגרד התאים כדי לנתק במידת הצורך. השעו מחדש את התאים ב-10 מיליליטר PBS קר כקרח והעבירו לצינור צנטריפוגה תחתון עגול מקורר מראש של 14 מיליליטר.

גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 400 עד 600 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר ליזה קר כקרח. העבירו את התרחיף לצינור איינור מקורר מראש של 1.5 מיליליטר למיצוי חלבונים ציטוזוליים.

הנח את התאים על קרח כדי למזער התחממות יתר מקומית ותאים עם שלוש פעמים עשר פעימות שניות של סוניקציה במשרעת של 30%. בעזרת קצה טרום צינון של שניים עד שלושה מילימטרים, שמור את הקצה מתחת לפני השטח כדי למזער את ההקצפה. השמיט שלב זה בעת שימוש בחומר ניקוי המכיל חיץ ודגירה על קרח למשך 30 דקות.

במקום זאת, תקן את תמיסת הליזאט כך שתכיל ריכוז מלח פיזיולוגי של 100 מילי-מולרי נתרן כלורי במידת הצורך מתמיסת מלאי של חמש נתרן כלורי מולארי. לבסוף, אוספים את הליזטים על ידי צנטריפוגה בכ-25, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בחר את הדיודה פולטת האור או את מקור עירור ה-LED באורך הגל השווה ל-470 ננומטר במכשיר ה-MST.

טען נימים עם תמצית תאים מדוללת פעמיים ו -10 פעמים עם מאגר MST והנח אותם במכשיר MST. בצע את פעולת מציאת הנימים בתוכנת הבקרה של מכשיר MST. טווח הקרינה האופטימלי בליזט מדולל הוא בין 400 ל -1500 יחידות פלואורסצנטיות.

המשך לקבוע את טווח ריכוז הליגנד האופטימלי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הנח מתלה צינורות עם המספר הדרוש של צינורות צנטריפוגה נמוכים של 0.5 מיליליטר על פיפטת קרח 25 מיקרוליטר של מאגר MST לתחתית כל צינור ב-25 מיקרוליטר מתמיסת מלאי הליגנד לצינור הראשון ובצע דילול כפול סדרתי של הליגנד באמצעות שאר הצינורות. שמור את המתלה עם דגימות ליגנד על קרח.

חשב את דילול הליזאט של התא כדי להניב את הרמה האופטימלית של חלבון המטרה הפלואורסצנטי בתגובות הקשירה. ריכוז החלבון הסופי צריך להיות קרוב לקבוע הדיסוציאציה הצפוי או נמוך יותר, ויש להתאים אותו כדי להשיג את המספר הדרוש של ספירת הקרינה. בתמיסה הסופית, המשך לדלל את ליזאט התא עם מאגר MST.

הנח צינורות קשירה נמוכים של 0.5 מיליליטר במדף הצינורות מול צינורות עם דגימות דילול סדרתי של ליגנד. הוסף בזהירות 15 מיקרוליטר של ליזאט התא לתחתית כל צינור. נסה לא לגעת בקירות הצינור כדי למנוע אובדן דגימה.

הוסף 15 מיקרוליטר מדגימת הליגנד בריכוז הגבוה ביותר לצינור המתאים. מספר אחד, עם התא ליזאט. מערבבים היטב ומחליפים את קצה הפיפטה.

חזור על שלב זה עם שאר הצינורות למעט האחרון, שלא אמור להכיל ליגנד. הוסף 15 מיקרוליטר של מאגר MST לצינור האחרון וערבב. ובכן, מלאו כשני שליש מהנימים הראשונים בתערובת הכריכה מצינור מספר אחת.

הטה אותו כדי להזיז את התמיסה לכיוון המרכז והנח את הנימים על מגש הנימים למצב. ראשית, חזור על שלב זה עם שאר הנימים. ניתן לחבר קצוות נימיים בשעווה לניסויים ארוכים יותר.

הנח את המגש בתוך מכשיר ה-MST וסגור את דלת המכשיר. לאחר מכן, בחר את מקור עירור ה-LED באורך גל השווה ל-470 ננומטר. במכשיר MST, בצע את הפקודה מצא נימים כדי לאפשר למכשיר למצוא את המיקומים המדויקים של הנימים ולמדוד את הקרינה של הדגימות על סמך עוצמת האות הפלואורסצנטי.

כוונן את מתח ה-LED כדי להכניס אותו למרווח של 400 עד 1500 יחידות. לחץ על כפתור ההתחלה כדי לבצע את ניסוי Thermo Resis. ניתן לבחור יותר מכוח לייזר אינפרא אדום אחד לניסוי.

על מנת למצוא את שיפוע הטמפרטורה האופטימלי עבור המערכת המסוימת, לוקח 10 עד 12 דקות להפעיל סט אחד של 16 נימים. אסוף נתונים משתיים עד שלוש ריצות עבור אותה קבוצה של נימים כדי להבטיח את יכולת השחזור של המדידות. כדי להתחיל בניתוח נתונים, פתח את תוכנת הניתוח וטען את תיקיית הפרויקט.

במידע שהופיע לרוץ הצופה בחר שנאסף בכוח לייזר IR ספציפי עקומות תרמו רטיות. הייתה אפשרות לפתוח את כל העקבות התרמו-רטיות שנאספו בתנאים שונים בבת אחת, ולאחר מכן לבחור עקומות לניתוח על ידי הפעלה וכיבוי שלהן. בחלון גרף נקודות ההערכה, בחר את התרמו רזיס או התרמו פרזיס עם קווים כחולים ואדומים של קפיצת T.

הגדר שני אזורים של עקומות הניסוי שנבחרו באופן ידני לניתוח על ידי התוכנה. ודא שהקווים הכחולים והאדומים ממוקמים כהלכה כדי לספק את השינוי המקסימלי ב-Thermo Resis. כדי להשיג את הנקודות הממוצעות עם סטיות תקן, בחר השתמש בממוצע או הבחין בריצות עבור ריצות נפרדות.

כדי להתוות התאמה קבועה של דיסוציאציה, בחר השתמש בממוצע, הזן ותקן את ערך ריכוז המולקולה המסומן והתאם את העקומה. קבוע הדיסוציאציה המחייב או ערך KD עם סטיית התקן שלו מופיע בחלון מוקפץ מידע נפרד. שמור את נתוני ההתאמה הממוצעת בקובץ טקסט והעבר ל- Excel.Heck.

2 9 3 תאים המבטאים STAT 3G FP שימשו כמקור לסטטיסטיקה 3 המסומנת פלואורסצנטית. עבור בדיקת קשירת DNA קשירת קשירת אוליגונוקלאוטידים טעונים מאוד הביאה לשינויים משמעותיים בניידות STAT שלוש. בשיפוע הטמפרטורה.

אות תרמו-רטי משורטט כפונקציה של ריכוז אוליגונוקלאוטיד. כל נקודת נתונים מייצגת את הממוצע של שלוש מדידות. נעשה שימוש בתוכנת ניתוח זמן ננו כדי להתאים את ערכי ה-KD לכאורה.

קבועי הדיסוציאציה לכאורה היו 37.9 פלוס מינוס 1.0 מיקרומולר לקשירה למוטיב הגז, ו-23.3 פלוס או מינוס 0.6 מיקרומולר לקשירה לאוליגונוקלאוטיד עשיר s פלוס 100. באופן מפתיע רצפים של s פלוס 100 הראו קשירה מעט הדוקה יותר מגז. בשלוש חזרות מדידה, החלפה של A ל-G הביאה לירידה דרמטית בזיקה של ה-s ועוד 100 מוטנטי

בעוד ש-s פלוס 100 מוטנטים שניים לא הראו קשירה ניתנת לזיהוי, ובכך אישרו קשירה סלקטיבית ברצף של STAT שלוש עד s ועוד 100 לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך פחות משעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהתנאים האופטימליים למיצוי חלבוני ממברנה יהיו שונים עבור חלבונים שונים ובדרך כלל ידרשו אופטימיזציה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע זיקה מחייבת של חלבון לאלגנטי מבלי לטהר את החלבון מהתא. ליזאט.