בידוד קפלים עצביים גולגולתיים מעובר אפרוח לצורך תרבית תאי קרסט עצבית

קח עובר אפרוח הנתמך בתוך מסגרת נייר פילטר ומקם אותו מתחת למיקרוסקופ מנתח.

הסר את קרום הוויטלין, ציפוי מגן המקיף את העובר.

זהה את הקפלים העצביים במוח התיכון הממוקמים מאחורי האונות האופטיות וקדמיים לסהר הלב, המבשר העוברי של הלב הבוגר.

הקפלים העצביים מכילים תאי פסגה עצבית טרום-נדידה, שהם תאי גזע רב-פוטנטיים שהופכים לתאים נודדים במהלך ההתפתחות.

תאים נודדים אלה מתמיינים לתאים עצביים ולא עצביים.

כרתו את ההיבט הגבי ביותר של הקפלים העצביים והעבירו את הרקמה לצלחת תרבית המכילה חיץ.

לאחר מכן, הניחו כיסויים מצופים בחלבון הידבקות בבארות צלחת תרבות המכילות מדיה.

העבירו את הקפלים העצביים אל הכיסויים המצופים. דגירה כדי להקל על הצמדת רקמות.

במהלך התרבות, תאי פסגה עצבית נודדים יוצאים מהקפלים העצביים על פני השטח המצופה, ויוצרים תרבית תאי פסגה עצבית.

העבירו עובר לכלי נקי המכיל תמיסת Pen-Strep של רינגר. העבירו בעדינות את העובר קדימה ואחורה כדי לנקות כל חלמון שמסתיר את הנוף, והחליפו את תמיסת ה-Pen-Strep של רינגר או העבירו אותו לכלי טרי אם הוא נעשה מעונן. מקם את הגב של העובר ואת צד המסגרת כלפי מעלה תחת מיקרוסקופ מנתח. השאירו את העובר על מסגרת הנייר כדי לשמור אותו מתוח ומוחזק במקומו.

לאחר מכן, הסר את קרום הוויטלין באמצעות מלקחיים כדי לחשוף את הקפלים העצביים. כלול רקמות זנב לשלפוחיות האופטיות המתרחבות ורוסטרל למוח האחורי, שם רק מתחילות להופיע התכווצויות מעוין. בעזרת מספריים קפיציים, כרתו בזהירות את הקפלים העצביים במוח האמצעי. הקפידו לכרות את ההיבט הגבי של הקפל העצבי עם זיהום מינימלי של הצינור העצבי והאקטודרם הלא עצבי, והעבירו את הקפלים העצביים לכלי נקי המכיל תמיסת Pen-Strep של רינגר באמצעות פיפטור P20 או פיפטת פסטר סטרילית מזכוכית שטופה בתמיסת Pen-Strep של רינגר.

אחסן קפלים שנאספו על קרח תוך ניתוח קפלים נוספים. לאחר הוצאת צלחת התרבות מהחממה, השתמש בפיפטור או בפיפטה פסטר כדי להסיר את תמיסת הפיברונקטין מכלי הכיסוי. לאחר שטיפת המצע המצופה פיברונקטין בתמיסת Pen-Strep של רינגר, הוסף נפח מתאים של מצע תרבית שלם לכלי או לבאר.

כדי לחסום את הפלסטיק ולמנוע מהרקמה להידבק, השתמש בפיפטור P20 או P200, ושטוף את קצה הפיפטה בתמיסת Pen-Strep חלמונית של רינגר. לאחר מכן, העבירו את הקפלים העצביים המבודדים לכיוון מרכז הכיסוי המצופה פיברונקטין, תוך הקפדה על העברת כמה שפחות תמיסת Pen-Strep של רינגר. לאחר שאפשרתם לצמחים להתיישב במשך 10 עד 15 דקות, הכניסו אותם לתא לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס על ידי נשיאה איטית וזהירה של צלחת התרבית עם קפלים עצביים מצופים.