ניתוח של נדידת תאים עצביות קרסט טרונק באמצעות Assay השתנה Zigmond הקאמרי
19 בינואר 2012
גישה לנתח את ההגירה של תאים (תאי explanted רכס עצביים גזע) הוא תאר. שיטה זו היא זולה, עדינה, ומסוגלת להבחין chemotaxis משני chemokinesis והשפעות אחרות על קוטביות נדידה כגון אלה נגזרים מאינטראקציות תא תא בתוך התרבות העיקרית הגזע עצבי פסגת התא.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להעריך את יכולתה של מולקולה לעורר כימוטקסיס ותגובות נדידה אחרות בתאי רב-עצב (neural crest) שבודדו מהגב. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד צינורות עצביים מגזע הגב באורך של בערך שמונה עד 15 סומריטים, ותרביות של כל אחד מהצינורות העצביים למשך לילה על לביבות זכוכית נפרדות מצופות בפיברונקטין כדי לאפשר הגירה של תאי הרב-עצב. לאחר מכן, נבחרת תרבית אופטימלית של תאי רב-עצב.
מוציאים את צינור העצבים מהתרבית, ומקבעים את זכוכית הכיסוי המכילה את התרבית אל תוך תא זיגמונד (zigmund chamber) משונה, כך שהגבול הישר ביותר של התרבית יהיה מקבילה לווקטור של המפל המולקולרי שיופעל על פני התרבית. השלב השלישי הוא יצירת מפל מולקולרי על פני התרבית, ולאחר מכן צילום נדידת תאי הרכס העצבי ההיקפיים לאורך הגבול הישר שנבחר קודם לכן בתרבית. השלב הסופי הוא מעקב וניתוח של נדידת תאי הרכס העצבי ההיקפיים הממוקמים לאורך הגבול הנבחר של התרבית באמצעות תוכנת Image J.
בסופו של דבר, ניתן לקבוע האם המולקולה שנבחרה מסוגלת לשנות את כיווניות התא או מאפייני נדידה אחרים, כגון מהירות, באמצעות ניתוח נתוני מסלול התא שהתקבלו. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון בדיקת תא בוידן (Boyden chamber assay), הוא עלותה הנמוכה מאוד. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח את נדידתם של תאים מקוטבים כבר בשלב מוקדם בפריפריה של תרביות אקספלנט ראשוניות (primary explan cultures) באמצעות דימוי במרווחי זמן (time-lapse imaging).
לאחר דגירה של ביצי תרנגולת למשך 56 שעות בטמפרטורה של 38 °C, הוצא את הביצים מהמדגרה, רסס אותן קלות ב-70% ethanol, ואז הנח לביצים להתייבש. מלא צלחת פטרי פלסטית סטרילית בתמיסת Chick ringer וסטריליז ב-UV מגש זכוכית. מלא צלחת פטרי מזכוכית בקוטר חמישה סנטימטרים ב-dis displays.
כעת שמרו את הביצים אל תוך מגש זכוכית שעבר סטריליזציה ב-UV. הוציאו כל עובר מהחלמון על ידי גזירה ראשונית מסביב לאיי הדם של העובר באמצעות מספריים מעוקלים. לאחר מכן, בעזרת פינצטה קהה, הרימו את העובר מהממברנה חוץ-עוברית והניחו אותו בצלחת פטרי המכילה תמיסת Ringers שהוכנה מראש.
בשלב הבא, בחרו כארבעה עוברי שהם בין השלבים 15 ל-17 לפי סיווגי Hamburger ו-Hamilton. בעזרת מחט טונגסטן, חתכו את כל רקמות העובר הנמצאות קדמה לסומריט 10, והסירו את כל רקמות העובר הגדבתיות (cordal embryonic tissues) החל בערך מהסומריט החמישי שנוצר לאחרונה. לאחר מכן, קצצו את קרומי חוץ-עובר למרחק של כ-2 mm מהעובר.
הניחו את גזעי העוברים המבודדים בתוך תאי דגירה והדגירו אותם למשך שעה ו-15 דקות ב-37 °C ו-5% carbon dioxide. בזמן שהגזעי העוברים מדגירים, הכינו שש זכוכיות כיסוי לתרבית. ראשית, שטפו אותן ב-70% ethanol והניחו להן להתייבש.
לאחר מכן, באמצעות טוש למעבדה, שרטטו עיגול במרכז כל זכוכית כיסוי בקוטר של כסנטימטר אחד, לצורך זיהוי מאוחר יותר של ציפוי הפיברין המקשר על אותו פני של כל זכוכית כיסוי. כתבו מילה או סמל לא סימטריים מחוץ לעיגול ששורטט כדי להקל על זיהוי החלק העליון והתחתון של זכוכית הכיסוי. כעת, הניחו כל זכוכית כיסוי בצלחת סטרילית נפרדת בגודל 40 על 10 מילימטר, כאשר הצד המסומן פונה כלפי מטה, והשאירו את הצלחת פתוחה תחת מנורת UV ג'רמיצידית למשך 10 דקות.
לאחר מכן, מרטיחו 60 µL של פיברונקטין על פני השטח שאינם מסומנים של זכוכית הכיסוי בתוך המעגל שקוטרו סנטימטר אחד, תוך וידוא שכל שטח המעגל מצופה. הניחו את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. בתום תקופת האינקובציה, שאבו בזהירות את הפיברונקטין מכל זכוכית כיסוי.
בשלב הבא, הוסף 250 µL של מצע גידול לאזור המצופה ב-FI nin. הנח את לוחות הכיסוי, ואז הדגר אותם שוב עד לבידוד של צינורות העצבים (neural tubes). בזמן הדגרת לוחות הכיסוי, מלא צלחת פטרי זכוכית בקוטר 5 cm במצע L 15.
כעת העבירו את כל גזעי העוברים שעברו אינקובציה לצלחת הפטרי המוכנה. השתמשו בפינצטה עדינה ובמחט ופינצטה חדה כדי להוציא את צינור העצבים על ידי חיתוך זהיר לאורך הגבול שבין צינור העצבים לסומיטים באמצעות המחט. הסירו את כיסויי הזכוכית (cover slips) מהאינקובטור.
בחרו שש מהפרוטובות העצביות (neural tubes) הארוכות והישורות ביותר, ולאחר מכן, באמצעות טיפ של מיקרופיפט שהורט במצע גידול, העבירו פרוטובה עצבית אחת לכל אחת משש זכוכית כיסוי (cover slips). וודאו בעזרת מיקרופיפט שכל פרוטובה עצבית נמצאת בתוך האזור המצופה בפיברונקטין של זכוכית הכיסוי המתאימה לה, והדגירו למשך לילה ב-37 °C ו-5% carbon dioxide. לאחר מכן, העבירו לפחות 2 mL של מצע גידול ללא סרום לשפופרת צנטריפוגה סטרילית של 15 mL.
השאירו את הפקק מעט פתוח בזמן דגירת המבחנה למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide כדי לאפשר התאמת pH של המצע. לאחר תרבית לילה, בחרו את שלושת תרביות תאי הרבב העצבי (neural crest) הטובות ביותר, שבהן לפחות לאחת משלוש התרביות יש קצה ישר וארוך. בחרו תרבית אחת לטעינה לתא הראשון והחזירו את השאר לאינקובטור לשימוש מאוחר יותר.
לאחר מכן, בעזרת מקל צמר גפן, מרחו שכבה דקה ואחידה של וזלין באזורים שסביב המאגרים ובגשר של תא סיגמונד (sigmund chamber) מושנה אחד. לאחר מכן, בעזרת מחט טונגסטן, הסירו בעדינות את צינור העצבים (neural tube) מלוחית הכיסוי המכילה את תרבית תאי הרכס העצבי (neural crest) הנבחרים, והשאירו את תאי הרכס העצבי המקיפים אותו צמודים לציפוי הפיברונקטין. סמנו את הצלחת בעזרת טוש מעבדה כדי לזכור את כיוונה של השפה הישרה ביותר של תרבית תאי הרכס העצבי.
בשלב הבא, טפטפו מספר טיפות מהתווך שעבר דגירה מוקדמת על גשרו של תא זיגמונד (zigmund chamber) המשונה. לאחר מכן, הרימו את לוחית הכיסוי בעזרת פינצטה עדינה. טפיקו את קצה לוחית הכיסוי על נייר ניקיון מסוג Kim wipe כדי להסיר את רוב תוצר התרבית הישן, והניחו מיד את לוחית הכיסוי על תא זיגמונד המשונה, כך שגבול תאי הרבד העצבי (neural crest cell) הישר שיוקלט יהיה ממורכז לאורך הגשר ובזווית ניצבת בקירוב לגבול מאגר הגשר.
באמצעות מיקרוסקופ הפוך, העבירו את הגבול הישר של תאי הרבב העצבי (neural crest cells) לצד של הגשר הקרוב ביותר למאגר. פעולה זו תכיל את החומר החשוד כמעודד chemotaxis ותיישר באופן מדויק יותר את הגבול הישר של תאי הרבב העצבי כך שיהיה ניצב לגבול מאגר הגשר. כעת, לחצו בזהירות אך בבטחה את כיסוי הזכוכית (coverslip) אל תוך הוואזלין שנמצא על תא זיגמונד (zigmund chamber), וודאו שהוא אטום לחלוטין לתא.
לאחר מכן, מרחו וזלין נוסף לאורך קצה כיסוי הזכוכית כדי להבטיח שהאיטום יהיה הרמטי. כווננו שוב את זווית גבול תאי הרב גבאי (neural crest) כדי לתקן כל תזוזה שהתרחשה במהלך תהליך האיטום. בשלב הבא, טענו למזרק של 1 mL כ-300 µL של מצע שעבר דגירה מראש.
באמצעות מחט מחוברת בכיול 25 gauge ואורך 1.5 inch. מזגים את המצע אל תוך המאגר שלא יכיל חומר מושך כימי (chemo tact) עד למילויו. יש להקפיד על מניעת היווצרות בועות בתוך המאגר.
לאחר מכן, אטמו את המאגר משני הצדדים בכמות מספקת של וזלין לפני טעינת המאגר הבא. כעת, טענו מזרק שני עם 300 µL של מצע שעבר דגירה מוקדמת ומכיל את החומר המושך (chemo tact) הרצוי. לאחר מכן, הזריקו את המצע למאגר הנגדי באותה הדרך.
שוב, אטמו בזהירות את המאגר באמצעות וזלין. לאחר מכן, דגרו את תא זיגמונד (Sigmund chamber) הטעון ב-37 °C למשך שעה אחת לפני הצילום. לאחר מכן, בזמן דגירה בטמפרטורה של כ-37 °C, צלמו את הגבול הישר ביותר של תרבית תאי הרבב העצבי (neural crest) למשך שלוש שעות במרווחים של 92 שניות עבור הביקורות; במקביל, טענו תאי זיגמונד המכילים כל אחת משתי תרביות תאי הרבב העצבי הטובות האחרות כפי שהודגם הרגע.
השתמשו בטיפולי הביקורת המתאימים למילוי המאגרים ולהחנקת (priming) הגשר. השתמשו בתוסף ה-manual tracking של Image J כדי לעקוב אחר נדידת תאי רב-עצביים היקפיים (peripheral neural crest cells) לאורך הגבול הישר של התרבית. השתמשו בתוסף ה-chemotaxis and migration tool כדי לנתח פרמטרים שונים של מסלולי הנדידה שהתקבלו.
תרביות של תאי רב-עצביים (neural crest) מגזע מוארך הוכנו על ידי תרבית לילה של צינורות עצביים, וסוכו תרביות של תאי רב-עצביים עם גבול ישר וארוך אחד לפחות לצורך הניסוי. הגבול הישר הארוך ביותר של תרבית נבחרת מוקם לאחר מכן בניצב לגבול מאגר הגשר, ולפיכך במקביל לווקטור של המדרג העתידי שיוחל. המאגר שלא הכיל את חומר המשיכה הכימי (chemo attractant) החשוד, המיוצג כאן בסימן מינוס, מולא ראשון ונאטם.
לאחר מכן, המאגר השני נטען עם חומר המשיכה הכימי החשוד, המסומן בסימן פלוס, ותאי רב-עצב של הרכס העצבי (neural crest cells) שנחתמו לאורך הגבול שנבחר קודם לכן צולמו ועוקבו באמצעות תוסף המעקב הידני של image J. ניתן להעריך מאפייני נדידה רבים בתגובה למדרג שהופעל על בסיס נתוני המעקב שהתקבלו, כפי שמוצג בגרף זה. לדוגמה, ניתן לגזור מדד כימותקסס (chemotaxis index) על ידי חלוקת ההעתקה של התא לאורך ציר ה-x במרחק הכולל שנדד. התגובה המושכת של כל התאים שעוקבו מוצגת בגרף מסלולי התאים המוצג כאן.
כל מסלול אדום מייצג את מסלול התנועה של תא שנדד לעבר המאגר שהוטען בחומר שחשוד כמעודד כימוטקסיס. באיור זה, ישנה כמות גדולה משמעותית של מסלולים אדומים בהשוואה לשחורים. בבדיקה אחרת, תוקפה היכולת של תא סיגמונד (sigmund chamber) משופר לשמור על מדרג ריכוזים מולקולרי.
צמיג Alexa Fluor 4 88 IGM הוסף למאגר השמאלי, ועצימות הפלואורסצנציה לאורך הגשר נמדדה בנקודות זמן שונות. הגרדיאנט נשמר למשך 26 שעות לפחות. לאחר צפייה בסרטון, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לנתח את יכולתו של מולקולה לעורר כימותקסיס והתנהגויות נדידה אחרות בתרביות של תאי רב-עצביים (neural crest) שהוצאו מגזע העובר, באמצעות בדיקת תא זיגמונד (zigmund chamber) שונה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לניתוח נדירה של תאי רכס עצביים (neural crest cells) המותירים את הגזע. גישה זו היא חסכונית ומאפשרת להבדיל בין כימוטקסיס לבין השפעות נדירה אחרות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- תאי רב-עצביים (neural crest) של הגו הם קריטיים לתהליכי התפתחות שונים.
- הבנת הגירתם יכולה לספק תובנות בתחום הביולוגיה ההתפתחותית.
- שיטות נוכחיות לחקר הגירה של תאים עשויות להיות יקרות או מורכבות.
- מחקר זה מציג חלופה פשוטה יותר עבור חוקרים.
מטרת המחקר
- להערכת היכולת של מולקולות להשרות כימוטקסיס בתאי רב-עצביים (neural crest cells).
- להבחנה בין סוגים שונים של תגובות נדידה.
- לספק שיטה מהימנה לחקר דינמיקת נדידת תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של צינורות עצביים מגב העוברים.
- גידול של צינורות עצביים על כיסויי זכוכית מצופים בפיברונקטין.
- הצבת תרביות בתא זיגמונד (Zigmund chamber) שעבר התאמה.
- יצירת מדרגות ריכוז מולקולריות והקלטה של נדידת תאים.
- מעקב וניתוח של הנדידה באמצעות תוכנת Image J.
תוצאות עיקריות
- השיטה הבדילה בהצלחה בין כימוטקסיס לבין השפעות נדידה אחרות.
- הושגה ויזואליזציה ברורה של דפוסי נדידת תאים.
- תוכנת Image J סיפקה ניתוח יעיל של נתוני הנדידה.
- הגישה ניתנת לשחזור ונגישה עבור חוקרים.
מסקנות
- שיטה זו מציעה דרך חדשנית לחקר נדידת תאי רב רכס העצבים (neural crest).
- ניתן להחילה אותה על שאלות מחקר מגוונות בביולוגיה התפתחותית.
- לממצאים עשויות להיות השלכות על הבנת התנהגות תאים בהקשרים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת הערכה חסכונית של תגובות כימותקטיות בתאי רב-עצביים ראשוניים ללא צורך בפיזור הומוגני או בדיסוציאציה חריפה, ובכך שומרת על הרלוונטיות הפיזיולוגית. היא תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים על ידי כימות נדידה מכוונת בתגובה למדרגי מולקולות, ובכך מספקת מידע להפחתת סיכונים מכניסטיים של רמזי הנחיה. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מועמדים מובילים עבור תוכניות של ביולוגיה התפתחותית-עצבית וביולוגיה רגנרטיבית.
יישומים אסטרטגיים במו and פיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי הערכה אם מולקולות מועמדות משנות את הכיוון או את המהירות של תאי הרגב העצבי.
- ערך תפעולי: משתמש בכמות מינימלית של חומר ביולוגי (שני שתלי צינור עצבי לכל חזרה) ונמנע מדיסוציאציה אנזימטית, ובכך מפחית שונות ומשמר את המצב הטבעי של התאים.
- ערך ניבוי: מאפשר כימות של מדד כימותקסס (chemotaxis) וניתוח מסלול כדי לתעדף תרכובות בעלות פעילות כיוונית אמיתית על פני תנועתיות אקראית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: יוצר גרדיאנטים מולקולריים יציבים ומדידים על פני ממשק מוגדר לע กระตุ้น כימותקסיס עקבי.
- פלט כמותי: מייצר פרמטרי נדידה הניתנים למעקב (העתקה, מהירות, התמדה) באמצעות תוספי ImageJ לצורך השוואה אובייקטיבית.
- סקביליות: תואם לצילומי time-lapse ולבדיקה של תנאים מרובים באמצעות מאגרי ביקורת ומאגרי ניסוי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה מערכת התפתחותית שבה נדידה חריגה תורמת לנוירוקריסטופתיות (neurocristopathies), ובכך תומכת ברלוונטיות לבדיקה פנוטיפית.
- המשכיות תרגומית: שומרת על תאים בסידור מרחבי דמוי-טבעי, מה שמשפר את ההשלכה למסלולי נדידה in vivo.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבדילה בין השפעות כימוטקטיות להשפעות של כימוקינים או הפטוטקסיות על ידי בידוד תגובות התלויות במעגל ריכוזים (gradient).
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
משתלב בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, לאחר בדיקת מעורבות המטרה ולפני סריקה פנוטיפית, ומספק תיקוף תפקודי של ויסות נדידה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהבהרה של מסלולים ביולוגיים על ידי קישור רמזי הנחיה מולקולריים לתנועה כיוונית של תאים במערכת ראשונית המופקת מתאי גזע.
- סריקה: מספקת גרייה הניתנת לשחזור המבוססת על מדרג ריכוזים (gradient), המאפשרת הערכה אמינה של תרכובות בהקשר של תאים ראשוניים.
- אנליטיקה: מפיקה מדד כימוטקסיס ונתוני מסלול כדי לכמת הטיה כיוונית ולהשוות תנאים באופן אובייקטיבי.
- מחקר תרגומי: מקשרת לתקפות פרה-קלינית באמצעות שימוש במערכת תאים רלוונטית למחלה, שנדידתם משקפת דפוסים עובריים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה בעלות נמוכה וניתנת לשימוש חוזר לסריקה של רמזי הנחיה מרובים בפרויקטים שונים ללא צורך בעיצוב מחדש.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי בידוד נדידה המכוונת על ידי מדרג (gradient) מניידות כללית במודל של תאים ראשוניים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה באמצעות יצירת מדרג מבוקרת והדמיה בזמן אמת (time-lapse), ובכך משפר את השחזוריות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) על ידי זיהוי מוקדם של תרכובות בעלות פעילות כיmotactic אותנטית, ובכך מפחית השקעה בתוצאות חיוביות שגויות (false positives).
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף של מובילים (leads) מותאם סיכון, בהתבסס על נתוני נדידה פונקציונליים במערכת רלוונטית התפתחותית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בעוברי עוף, בדיסקציה של צינור העצבים ותחזוקת תרביות תאים ראשוניות.
- תלוי במיקרוסקופיה הפוכה עם בקרת סביבה ובתוכנת ImageJ עם תוספי מעקב ידני וניתוח כימוטקסיס.
- מחייב סטנדרטיזציה של תזמון יישום הגרדיאנט ואיטום התא למניעת ארטיפקטים של החלפת מצע או התאיידות.
- התאמה למערכות יונקיים עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי תרבית האקספלנט וציפוי הסובסטרט.
- מוגבל לאוכלוסיות תאים דבקים ונודדים בשולי התרבית; אינו רלוונטי לתרביות שאינן מקוטבות או לתרביות סספנסיה.
