ניתוח של נדידת תאים עצביות קרסט טרונק באמצעות Assay השתנה Zigmond הקאמרי

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את יכולתה של מולקולה לעורר כימוטקסיס ותגובות נדידה אחרות בתאי פסגה עצבית של תא המטען שהושתלו. זה מושג על ידי בידוד תחילה של צינורות עצביים בגובה תא המטען בין שמונה ל-15 סומיטים באורך של כ-8 עד 15 סומיטים ותרבית כל אחד מהצינורות העצביים בן לילה על החלקות כיסוי נפרדות מצופות פיברונקטין כדי לאפשר הגירה של הפסגה העצבית. לאחר מכן, נבחרת תרבית פסגה עצבית אופטימלית.

הצינור העצבי מוסר מהתרבית והחלקת הכיסוי המכילה את התרבית מותקנת על תא זיגמונד שונה כך שהגבול הישר ביותר של התרבית מקביל לווקטור של השיפוע המולקולרי שיש ליישם על פני התרבית. השלב השלישי הוא ליצור שיפוע מולקולרי על פני התרבית ולאחר מכן לצלם את הנדידה של תאי הפסגה העצבית ההיקפית לאורך הגבול הישר שנבחר קודם לכן של התרבות. השלב האחרון הוא לעקוב ולנתח את הנדידה של תאי הפסגה העצבית ההיקפית הממוקמים לאורך הגבול הנבחר של התרבית באמצעות תוכנת Image J.

בסופו של דבר, ניתן לקבוע אם המולקולה שנבחרה יכולה לשנות את כיווניות התא או מאפייני נדידה אחרים כגון מהירות באמצעות ניתוח נתוני מסלול התא שהתקבלו. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כמו בדיקת תא ביידן, הוא בעלות נמוכה מאוד. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח את הנדידה של תאים מקוטבים כבר בפריפריה של תרביות אקספלן ראשוניות באמצעות הדמיית זמן-lapse.

לאחר דגירה של ביצי אפרוחים במשך 56 שעות בחום של 38 מעלות צלזיוס, הוציאו את הביצים מהחממה, רססו אותן בעדינות באתנול 70% ולאחר מכן הניחו לביצים להתייבש בזמן שהביצים מתייבשות. מלאו צלחת פטרי סטרילית אחת מפלסטיק בתמיסת צ'יק רינגר ועיקרו מגש זכוכית UV. מלאו צלחת פטרי מזכוכית של חמישה סנטימטרים בתצוגות דיס.

כעת שוברים את הביצים למגש הזכוכית המעוקר UV. חלץ כל עובר מהחלמון שלו על ידי חיתוך תחילה סביב איי הדם של העובר במספריים מעוקלים. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים קהים, הרימו את העובר מהקרום העוברי הנוסף שלו והניחו את העובר בצלחת פטרי מוכנה המכילה צלצולים.

לאחר מכן, בחר כתשעה עוברים שנמצאים בין המבורגר להמילטון. שלבים 15 עד 17 עם מחט טונגסטן חותכים את כל הרקמות העובריות הקדמיות לקרדית 10 ומסירים את כל הרקמות העובריות החלליות החל מסביבות הקרדית החמישית החדשה ביותר שנוצרה. לאחר מכן חתוך את הממברנות העובריות הנוספות עד כשני מילימטרים מהעובר.

הניחו את גזעי העוברים המבודדים במפרצים ודגרו אותם למשך שעה ו-15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני בזמן שגזעי העובר דוגרים. הכן שש פתקי כיסוי לתרבית. ראשית על ידי שטיפתם באתנול 70% ומתן להם להתייבש.

לאחר מכן, בעזרת סמן מעבדה, צייר עיגול במרכז כל פתק כיסוי שקוטרו כסנטימטר אחד לזיהוי מאוחר יותר של שכבת חיבור הפיברין על אותו פנים של כל החלקת כיסוי. כתוב מילה או סמל א-סימטרי מחוץ לעיגול המצויר כדי להקל על זיהוי החלק העליון והתחתון של פתק הכריכה. כעת הניחו כל תלוש כיסוי בצלחת סטרילית נפרדת בגודל 40 על 10 מילימטר כשהצד המסומן פונה כלפי מטה, והניחו לכלי לשבת פתוח מתחת למנורת UV קוטל חיידקים למשך 10 דקות.

לאחר מכן מרחו 60 מיקרוליטר פיברונקטין על המשטח הלא מסומן של החלקת הכיסוי בתוך עיגול הסנטימטר האחד, וודאו שכל שטח המעגל מצופה. מניחים את הכלים בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר תקופת הדגירה, שאפו בזהירות את הנין מכל החלקת כיסוי.

לאחר מכן, הוסף 250 מיקרוליטר של מדיום תרבית לאזור המצופה FI nin. הכיסוי מחליק, ואז מדגר את הכיסוי מחליק שוב עד שהצינורות העצביים מבודדים. בזמן שהחלקות הכיסוי מודגרות, מלאו צלחת פטרי מזכוכית של חמישה סנטימטרים ב-L 15 בינוני.

כעת העבירו את כל גזעי העוברים המודגרים לצלחת הפטרי המוכנה. השתמש במלקחיים עדינים ובלשון חדה ומחט כדי לנתח את הצינור העצבי על ידי חיתוך זהיר לאורך גבול הצינור העצבי והסומיטים עם המחט. הסר את החלקות הכיסוי מהחממה.

בחר שישה מהצינורות העצביים הארוכים והישרים ביותר, ולאחר מכן השתמש בקצה מיקרו פיפטה עם מדיום תרבית, העבר צינור עצבי אחד לכל אחת משש החלקות הכיסוי. ודא שכל צינור עצבי נמצא באזור המצופה פיברונקטין של החלקת הכיסוי המתאימה שלו באמצעות מיקרו פיפטה ודגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, הניחו לפחות שני מיליליטר של מדיום תרבית ללא סרום לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר.

השאירו את העגל מעט לא מוברג תוך כדי דגירה של הצינור למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר ל-pH של המדיום להסתגל. לאחר תרבית לילה, בחר את שלושת תרביות תאי הפסגה העצבית הטובות ביותר שיש להן לפחות קצה ישר אחד ארוך משלוש התרביות. בחר אחד להעמסת החדר הראשון והחזיר את האחרים לחממה לשימוש מאוחר יותר.

לאחר מכן בעזרת צמר גפן שלנו, מרחו שכבה דקה ואחידה של ג'לי נפט על האזורים המקיפים את המאגרים והגשר של תא סיגמונד אחד שונה. לאחר מכן בעזרת מחט טונגסטן, הסר בעדינות את הצינור העצבי מתלוש הכיסוי המכיל את תרבית תאי הפסגה העצבית שנבחרה, והשאיר את תאי הפסגה העצבית המוקפים מחוברים למעטפת הפיברונקטין. סמן את המנה עם סמן מעבדה על מנת לזכור את הכיוון של הגבול הישר ביותר של תרבית תאי הפסגה העצבית.

לאחר מכן, הניחו כמה טיפות מהמדיום שהודגר מראש על הגשר של תא הזיגמונד שונה. ואז הרם את תלוש הכיסוי בעזרת מלקחיים עדינים. טפח את קצה החלקה על מגבון קים כדי להסיר את רוב מדיום התרבות הישן, והנח מיד את החלקת הכיסוי על תא הזיגמונד המותאם כך שגבול תא הפסגה העצבית הישר שיש לצלם יהיה מרוכז לאורך הגשר ובניצב בערך לגבול מאגר הגשר.

בעזרת מיקרוסקופ הפוך, הזיזו את גבול תא הפסגה העצבית הישר לצד הגשר הקרוב למאגר. זה יכיל את הטקט הכימותרפי החשוד ויישר בצורה עדינה יותר את גבול תא הפסגה העצבית הישר בניצב לגבול מאגר הגשר. כעת לחץ בזהירות אך בבטחה על המכסה, החלק לתוך ג'לי הנפט הקיים בתא הזיגמונד, וודא שהוא אטום לחלוטין על החדר.

לאחר מכן הניחו ג'לי נפט נוסף לאורך קצה החלקה של הכיסוי כדי להבטיח עוד יותר שהוא יהיה אטום בסדר. כוונן שוב את הזווית של גבול תא הפסגה העצבית כדי לתקן כל תנועה במהלך תהליך התקרה. לאחר מכן, טען כ-300 מיקרוליטר של מדיום מודגר מראש למזרק של מיליליטר אחד.

עם מחט מחוברת בגודל 25 על 1.5 אינץ'. הזרקו את המדיום למאגר שלא יכיל שום כימותרפיה עד למלא. היזהר לא ליצור בועות במאגר.

לאחר מכן חבר את המאגר משני הצדדים בכמות מספקת של ג'לי נפט לפני העמסת המאגר הבא. כעת טען מזרק שני עם 300 מיקרוליטר של מדיום מודגר מראש המכיל את הטקט הכימותרפי הרצוי. ואז הזרקו את המדיום למאגר הנגדי באותו אופן.

שוב, אוטמים בזהירות את המאגר בג'לי נפט. לאחר הדגירה של תא זיגמונד העמוס ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני הצילומים. לאחר מכן, תוך כדי דגירה בתמונה של כ-37 מעלות צלזיוס, הגבול הישר ביותר של תרבית תאי הפסגה העצבית למשך שלוש שעות במרווחים של 92 לבקרות, טען תאי זיגמונד המכילים כל אחד משני תרביות תאי הפסגה העצבית הטובות ביותר כפי שהוצג זה עתה.

שימוש בטיפולי הבקרה המתאימים למילוי המאגרים והקמת הגשר. השתמש בתוסף הטראקין הידני image J כדי לעקוב אחר הנדידה של תאי פסגה עצבית היקפיים לאורך הגבול הישר של התרבית. השתמש בתוסף הכימוטקסיס וכלי ההגירה כדי לנתח פרמטרים שונים של מסלולי הנדידה שהתקבלו.

תרביות תאי פסגה עצבית מוארכת הוכנו על ידי תרבית לילה של צינורות עצביים וכתוצאה מכך נבחרו לניסויים תרביות תאי פסגה עצבית עם גבול ישר ארוך אחד לפחות. הגבול הישר הארוך ביותר של תרבית נבחרת אחת הוצב אז בניצב לגבול מאגר הגשר, ולכן מקביל לווקטור של השיפוע המיושם העתידי. המאגר שלא הכיל את החומר החשוד בכימותרפיה המיוצג כאן עם סימן מינוס הועמס ראשון ואטום.

לאחר מכן המאגר השני הועמס בחומר המשיכה הכימותרפי החשוד המיוצג בסימן פלוס ותאי פסגה עצבית היקפיים אטומים לאורך הגבול שנבחר קודם לכן צולמו ועקבו באמצעות תוסף המעקב הידני לתמונה J. ניתן להעריך מאפיינים נדידה רבים בתגובה לשיפוע המיושם על סמך נתוני המעקב שהתקבלו כפי שמומחשים בגרף זה. לדוגמה, ניתן לגזור אינדקס כימוטקסיס על ידי חלוקת תזוזה של תאים לאורך ציר ה-x במרחק הכולל שהיא עברה. התגובה האטרקטיבית של כל התאים שאחריהם עוקבים מודגמת על ידי תרשים מסלול התא המוצג כאן.

כל מסלול אדום הוא המסלול של תא שנדד לעבר המאגר הטעון בחומר החשוד כמושך כימותרפיה. באיור זה, יש כמות גדולה משמעותית של מסלולים אדומים בהשוואה לשחור. בבדיקה אחרת אומתה יכולתו של תא סיגמונד שונה לשמור על שיפוע מולקולרי.

למאגר השמאלי נוסף מצומד Alexa Fluor 4 88 IGM ועוצמת הקרינה על פני הגשר נמדדה בזמנים שונים. השיפוע נשאר לפחות 26 שעות לאחר צפייה בווידאו, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח את יכולתה של מולקולה לעורר כימוטקסיס והתנהגויות נדידה אחרות בתרביות תאי פסגה עצבית של תא הגזע המושתל באמצעות בדיקת תא זיגמונד שונה.