התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית אנושית בתאי עצב באמצעות לנטי-וירוסים מהונדסים

טפל בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים דבוקים עם לנטי-וירוסים מהונדסים במגיב טרנספקציה.

הנגיף נושא גנים לעמידות לאנטיביוטיקה וגורם השעתוק הנוירוגני, הנשלט על ידי האלמנטים המגיבים לטטרציקלין והמווסתים.

מגיב הטרנספקציה הטעון חיובית משפר את האיחוי הנגיפי ואת שחרור התוכן שלו.

RNA ויראלי מתעתק לאחור ל-DNA ומשתלב ב-DNA של תאי הגזע, ומאפשר ביטוי של אלמנטים רגולטוריים המייצרים חלבונים אקטיבטור.

הוסף מדיום בסיסי עם נגזרת טטרציקלין, היוצר קומפלקס עם חלבוני המפעיל.

קומפלקס זה נקשר לאלמנט המגיב לטטרציקלין, מקדם ביטוי גנים ומייצר את גורמי השעתוק הנוירוגניים הגורמים להתמיינות תאי גזע לנוירונים.

הוסף מדיום בסיסי עם תרופה אנטיביוטית כדי לחסל את התאים הלא מועברים.

טפל בתאים בתמיסת ניתוק המכילה אנזימים פרוטאוליטיים המפרקים את המטריצה החוץ-תאית או ECM ומשחררים את התאים.

הסר את האנזימים וצלח מחדש את התאים על בארות מצופות ECM עם מדיום התבגרות, ומקדם התבגרות עצבית.

יומיים לפני השראת ההתמיינות יש לנתק תאי ES על ידי הוספת 1 מיליליטר של תמיסת ניתוק תאים, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. העבירו את התאים לצינור. לאחר מכן, שטפו את הבאר עם 2 מיליליטר מדיה והוסיפו אותה לאותו צינור. צנטריפוגה את התאים ב -300 פעמים גרם למשך 5 דקות. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה במדיה וצלחו את התאים על צלחות שש בארות מצופות מטריצה בצפיפות ישיבה של 1 כפול 10 עד התאים החמישיים לבאר.

למחרת, הוסף לנטי-וירוסים המבטאים Ngn2 בתוספת PuroR וטרנס-אקטיבטור טטרציקלין יחד עם פוליברן במדיום תחזוקת תאי ES טריים. ביום האפס, הוסף 2 מיקרוגרם למיליליטר דוקסיציקלין במדיום DMEM/F12 בתוספת N2 וללא מורפוגנים. ביום הראשון, הוסף פורומיצין ב-DMEM/F12 טרי בתוספת N2 ודוקסיציקלין לריכוז הסופי של 1 מיקרוגרם למיליליטר.

בחר את התאים המומרים בפורומיצין למשך 24 שעות לפחות. ביום השני, נתקו נוירונים מבדלים עם תמיסת ניתוק תאים וציפו אותם מחדש על צלחות של 24 בארות המצופות בתמיסת מטריצה. שמור אותם במדיום NBA/B27 ללא דוקסיציקלין. תרבית נוירונים מושרים טהורים על הצלחות המצופות בתמיסות מבוססות מטריצה חוץ-תאיות.