גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להפיק צאצאים עצביים באופן ישיר ובלעדי מתאי גזע עובריים אנושיים פלוריפוטנטיים באמצעות אינדוקציה של מולקולות קטנות. זה מושג על ידי הוספת חומצת רטינו לתאים לא ממוינים שנשמרו בתנאים מוגדרים. לאחר מכן, תהליך ההתמיינות ממשיך על ידי ניתוק תאים בתרבית תרחיף שבה הם יוצרים אשכולות תאים צפים הנקראים נוירובלסטים.

אם נותנים לנוירובלסטים להיצמד לצלחת תרבית רקמה במדיה של התמיינות עצבית, הם מפתחים מאפיינים של נוירונים בוגרים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש באימונופלואורסצנציה ודה-קונבולוציה או מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להראות את ההשפעה של טיפול בחומצה רטינו במורפולוגיה ובביטוי סמנים של תאי גזע עובריים אנושיים מטופלים. בטכניקות אחרות, רק חלק קטן מהתאים רודפים אחר פנוטיפ עצבי, בעוד שהשיטה שלנו מאפשרת אינדוקציה יעילה ומבוקרת היטב של תאי גזע עובריים אנושיים פלוריפוטנטיים אך ורק לעבר שושלת עצבית על ידי אספקה פשוטה של מולקולות קטנות.

ישנם כמה שלבים שיש להיזהר בהם בעת תיקון פתרונות מלאי. הקפד להאט את ההפשרה של מטריג'ל ולמינין אנושי ממינוס 80 מעלות צלזיוס לארבע מעלות צלזיוס, אחסן מדיה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס ותמיד לחמם את המדיה ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. כמו כן, בעת הכנת מדיה ESL אנושית, חלק מהתוספים מתווספים ממש לפני השימוש בה.

אלה כוללים BFGF, חומצה אסקורבית, אינסולין אנושי פעיל ב-A ומעביר. לאחר מכן, הכינו את ג'ל המאטרה או פתרונות העבודה של למינין אנושי מיד לפני ציפוי הצלחת. דגרו את הצלחות ב-37 מעלות SIUs ב-5% פחמן דו חמצני לאחר הכנת צלחות תרבית הרקמה המצופות מראש בג'לטין.

ניתן להחליף את הג'לטין בתמיסת העבודה של מטריג'ל או למינין. מצפים את הצלחות הללו על ידי דגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. התחילו בכך שתאפשרו למושבות תאי גזע אנושיים לגדול במשך חמישה עד שבעה ימים ואז התכוננו להתפצל.

חלקם בחרו מושבות עם יותר מ-75%תחת תאי ES אנושיים מובחנים, הם בדרך כלל מעט אטומים עם מושבות קצוות מוגדרות המכילות תאים נערמים. אינדיקציה לתחילת ההתמיינות נראית בדרך כלל כמושבות לבנות המכילות בעיקר תאים ממוינים בדרך כלל נראות ברורות. אל תבחר מושבות לבנות או שקופות.

החזק את הצלחות מול האור והשתמש בטוש כדי לתאר את המושבות האטומות מעט בתחתית הלוחות לאורך קווי המתאר. השתמש בקצה של קצה סטרילי של שני פיפטות P כדי לנתק את שכבת הפיברובלסטים שמסביב ממושבת תאי ה-ES האנושית. לאחר מכן הסר את תאי הפיברובלסטים שמסביב וגם הסר את כל החלקים המובחנים של המושבה.

כעת שאפו החוצה את המדיה הישנה המכילה את התאים הממוינים המנותקים. לאחר מכן, בכל באר, שטפו את התאים הלא ממוינים פעם אחת עם מדיה תאית אנושית חסרת BFGF, ולאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר של מדיה ESL אנושית טרייה המכילה B-F-G-F-B-F-G-F מתווספת למדיה הטרייה מיד לפני השימוש. כעת השתמש בקצה פיפטה סטרילי P שני כדי לחתוך את המושבות לחתיכות קטנות ולנתק אותן מהצלחת.

משוך את חלקי המושבה המנותקים במדיה שלהם לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. משוך אחד נוסף. שטיפת מדיה מיליליטר לבאר.

התאים מוכנים כעת להתמיינות נוספת באמצעות מולקולות קטנות. התחל בחימום צלחות מצופות טריות ל -37 מעלות צלזיוס. שאפו את תמיסת הציפוי מהצלחות והוסיפו לכל באר כמות של ארבעה מיליליטר של מדיה המכילה חתיכות מושבה, ואז העבירו בעדינות את הצלחות לחממה מבלי לנער אותן.

אל תפריע לצלחות כך שמותר להן לזרוע. לאחר זריעה של שלושה ימים, הכינו מדיה חדשה המכילה חומצה אומית. לאחר מכן הסר את רוב המדיה הישנה, והשאיר מספיק מדיה כך שהתאים יישארו שקועים.

אסור לתת לתאים להתייבש לכל אחד מהם. ובכן הוסף ארבעה מיליליטר של מדיה תאי ES אנושית טרייה עם BFGF וחומצה רטינו. החלף את המדיה כל יומיים ואפשר למושבות תאי ES אנושיים שטופלו בחומצה רטינו לגדול.

לאחר שבעה או שמונה ימים, התאים יעברו שינויים מורפולוגיים לתאים ממוינים גדולים. לאחר מכן המשך בהכנת תרבית תאי תרחיף כדי לגרום לתרבית תרחיף להתחיל בניתוק מושבות ESL מתאים שהתמיינו באופן ספונטני ונדדו החוצה ליצירת שכבת פיברובלסטים. השתמש בטכניקה הנ"ל עם קצה פיפטה סטרילי, ולאחר מכן שאב החוצה את המדיה הישנה המכילה תאי פיברובלסטים מנותקים צפים.

שטפו את התאים פעם אחת עם מדיה HESC והשעו אותם מחדש בשלושה מיליליטר של מדיה HESC. עכשיו באמצעות קצה סטרילי של שני פיפטות. חותכים את המושבות לחתיכות קטנות ומנתקים אותן מהצלחת.

משוך את המדיה עם מושבות מנותקות לצינור חרוטי יחיד של 50 מיליליטר. שוטפים את הבארות במיליליטר מדיה ומוסיפים את השטיפה לבריכה. לאחר מכן הכניסו ארבעה מיליליטר מהתאים המאוגדים לכל באר של צלחת חיבור נמוכה במיוחד של שש בארות למשך ארבעה עד חמישה ימים, שמרו את הצלחת בחממה.

במהלך תקופה זו, ייווצרו אשכולות תאים צפים או נוירובלסט כדי לקדם עוד יותר את הנוירובלסט לפנוטיפ עצבי בוגר יותר. משוך את המדיה המכילה אותם לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב -1, 400 סל"ד למשך חמש דקות.

שאפו, שקלו כמה שיותר מהמדיה הישנה והוסיפו כמות שווה של חומרי NSC טריים המכילים VEGF, N, NT 3 ו-BDNF. מערבבים את התאים לתרחיף על ידי פיפטינג, ואז מכניסים ארבעה מיליליטר מהתרחיף לבאר לשישה. ובכן, צלחות תרבית רקמות מעבירות את הצלחות לחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס.

הנוירובלסט יתחבר ללוחות התרבית למשך הלילה לתרבית תלת מימדית במטריג'ל או לרבד אנושי לתרחיף הנוירובלסטים. ומטריצה תלת מימדית תתפלמר ב-37 מעלות צלזיוס. החלף את המדיה כל יומיים.

תוך שבועיים, רשתות נרחבות של תאי עצב נושאי נויריט ותאים פיגמנטיים יופיעו חומצת רטינו מספיקה כדי לגרום לתאי ES אנושיים המאוחסנים במערכת התרבית המוגדרת לעבור מפלוריפוטנטיות אך ורק לפנוטיפ נוירו-אפידרמיס. עם חשיפה של תאי E es אנושיים לא ממוינים לחומצה רטינואית, כל התאים במושבה עברו שינויים מורפולוגיים לתאים מובחנים גדולים שהפסיקו לבטא את הסמן הקשור לפלוריפוטנטיות OCT 4. התאים החלו גם לבטא סמנים שונים הקשורים לנוירו-אקטודרם כגון HNK אחד a, P שני ו-TRKC.

תאים מובחנים גדולים אלה המשיכו להתרבות והמושבות גדלו בגודלן באופן ספונטני ומבטאות את הסמן העצבי המוקדם בטא שלוש טובולין. מפת הסמנים העצביים הבוגרת יותר החלה להופיע באזורים של המושבות שבהם התאים נערמו. במקרה, עם הופעתם של התאים הנוירואקטודרמליים, גורם השעתוק הספציפי העצבי NER אחד מעורב בהתמיינות עצבית דופמינרגית והפעלה של הגן טירוזין הידרוקסילאז שהועבר לגרעין.

לאחר הניתוק, תאי ES אנושיים שטופלו בחומצה רטינו יצרו נוירובלסטים בתרבית תרחיף עם הסרת ה-FGF הבסיסי ולאחר שאפשרו לנוירובלסט להיצמד לצלחת תרבית רקמה, רשתות נרחבות של תאי עצב נושאי נויריט ותאים פיגמנטיים, האופייניים למערכת העצבים המרכזית, האופייניים למערכת העצבים המרכזית, החלו להופיע עם עלייה דרסטית ביעילות וניתן היה לתרבת אותם במשך שלושה חודשים. תאים עצביים שמקורם בתאי ES אנושיים אלה ביטאו בטא שלושה טובולין בהשוואה להתמיינות ספונטנית מרובת שושלות של תאים ללא טיפולי חומצת רטינו ומפה משותפת שתיים לאחר שליטה. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ליצור אבות עצביים בתאי עצב באופן אחיד מתאי גזע עובריים אנושיים פלוריפוטנטיים תוך כארבעה שבועות אם היא מבוצעת כראוי.

אל תשכח שעבודה עם תאים אנושיים עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון הבטחת קווי תאים נקיים מפתוגנים ומיקופלזמה לפני ביצוע הליך זה.