בדיקת לוציפראז למדידת פעילות γ-secretase בתאים אנושיים

התחל עם תאים אנושיים מהונדסים גנטית במדיום גידול.

תאים אלה מכילים מערכת השראת טטרציקלין בעלת חלבון מבשר עמילואיד או גן APP וגן לוציפראז.

החלפה עם מדיום המכיל טטרציקלין ודגירה.

טטרציקלין נקשר לחלבון המפעיל, שנקשר למקדם ה-APP.

זה גורם לביטוי גנים ומייצר את החלבונים הקודמים המתמקמים בקרום התא.

האנזים β-Secretase מבקע את APP, ויוצר שבר שנשאר מחובר לקרום התא.

ה-γ-secretase מבקע את השבר הזה, מייצר פפטידים β עמילואיד ומשחרר רכיב מפעיל.

מפעיל זה נכנס לגרעין, נקשר למקדם הלוציפראז, גורם לביטוי גנים ומייצר אנזימי לוציפראז.

החלף את המדיום במגיב בדיקה המכיל את מצע הלוציפראז. המצע מתפזר לתאים ומגיב עם לוציפראז, ומייצר ביולומינסנציה.

השתמש בקורא מיקרו-פלטות כדי למדוד את עוצמת האור, המשקפת ישירות את פעילות γ-secretase, אנזים חיוני במצבים נוירופתולוגיים.

ספרו תאי NG או CG בעזרת המוציטומטר. לאחר מכן, זרעו את התאים ב-20,000 תאים לבאר על מיקרו-לוחות של 96 בארות בנפח סופי של 200 מיקרוליטר לבאר במצע הגידול. העבירו את המיקרו-צלחות לחממת פחמן דו חמצני לחות, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הדגירה של הלילה, הסר 100 מיקרוליטר של מצע גידול מכל באר.

הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של מצע גידול המכיל 2 מיקרוגרם למיליליטר של טטרציקלין עם 0.2% דימתיל-סולפוקסיד, שני מיקרו-מולרי CL 387, 785, שני מיקרו-מולרי DAPT או מעכבי ErbB1/ErbB2 קשורים אחרים. דגרו את התאים המטופלים במיקרו-פלטות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, הסר 150 מיקרוליטר לבאר של מצע גידול מהמיקרו-פלטות.

לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר לבאר של מגיב בדיקת לוציפראז. לאחר מכן, העבירו את המיקרו-לוחות לקורא מיקרו-פלטות זוהר ושמרו אותם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. קבע את הזוהר הנפלט מהגחלילית באמצעות תוכנית מוגדרת מראש המאוחסנת בקורא המיקרו-לוחות הזוהר.