Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס
18 בנובמבר 2011
אתילן גליקול מבוססי שיטה vitrification עבור עוברי עכבר מתואר. זהו יתרון לשיטות אחרות בפשטותו ורעילות נמוכה עובריים, ולכן יכול להיות ישים באופן נרחב זנים רבים של עכברים, כולל עכברים טבועה ו גנים שונה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לשמר בהקפאה עוברי עכברים בחנקן נוזלי ולהפשיר אותם לצורך התאוששות של עכברים חיים. זה מושג על ידי טבילה תחילה של עוברי עכברים במדיום שיווי משקל, העברתם למדיום זיגוג בצינור קריו, ולאחר מכן הנחתם במיכל חנקן נוזלי. ניתן להפשיר עוברים מאוחרים יותר בתווך אוסמוטי גבוה ולדגור במדיום תרבית עד שהם מועברים לנקבות המקבלות.
בסופו של דבר, התוצאות מראות הישרדות של יותר מ-90% מהעוברים לאחר הפשרת הזגוגית, ושיעורי לידה בין 30% ל-70% לאחר החזרת העוברים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שגליקול הקריופרוטקטנט החדיר פחות רעיל לעוברים מאשר חומר קריופרוטקטנט קונבנציונאלי. מדגים את ההליך יהיה טכנאי מהמעבדה שלי לפני תחילת פרוטוקול זה.
הכן שני עוברי עכברי תאים בתרבית המתקבלת על ידי הזדווגות טבעית או טכניקות IVF קונבנציונליות לצינור קריו לאחסון בסופו של דבר, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת הקפאת עוברים EF S 40. לאחר מכן הכינו צלחת פטרי מפלסטיק בגודל 35 מילימטר או 60 מילימטר עם 50 מיקרוליטר טמפרטורת החדר. EFS 20.
השתמש בנימי זכוכית כדי להעביר עד 30 עוברים למנה. היזהר להימנע מהעברת מדיום התרבית. כמו כן, כדי להבטיח התייבשות של העוברים, הניחו אותם בתחתית הטיפה.
לאחר כ-60 עד 90 שניות, השתמש בצינור נימי כדי לשאוב עוברים מיובשים. עם מורפולוגיה מכווצת. העבירו את העוברים הללו לתמיסת EFS בצינור הקריו, והעבירו כמה שפחות EFS 20.
לאחר העברת העוברים, אפשר להם להתיישב ב-EFS 40 למשך דקה אחת לפני הקפאתם בחנקן נוזלי. לפני הפשרת העוברים מניחים בצלחת תרבית לפחות שתי טיפות של מדיום תרבית עובר באוסמולריות גבוהה של 10 מיקרוליטר, כגון מדיום M 16. לאחר מכן מכסים את הטיפות לחלוטין בסיליקון או בשמן מינרלי, ומניחים את המנה בחממת פחמן דו חמצני עד לשימוש.
לאחר מכן, יש לחמם את תמיסת ה- TS one ל -37 מעלות צלזיוס תוך לבישת מסכת פנים וכפפות קריו. הוציאו את העוברים ממיכל החנקן הנוזלי. כעת פתח במהירות את צינור הקריו והשליך כל חנקן נוזלי למיכל או לכל מיכל מתאים.
לאחר מכן המתן 30 שניות. כעת הוסף 850 מיקרוליטר TS חם תמיסה אחת לצינור הקריו. יש לשאוב בעדינות ולהוציא את התמיסה כ -10 פעמים כך שהיא מומסת באופן שווה.
לאחר מכן העבירו את כל הנפח לצלחת פטרי מפלסטיק 60 מילימטר. או צפו בזכוכית ממתינה שלוש דקות עד שהעוברים יתאזנו לטמפרטורת החדר שם הם אמורים להישאר למשך שארית ההליך. אין להשתמש במכשיר חימום.
בדוק במהירות את העוברים בצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לדעת איך הם נראים בתחילת הדגירה הזו. לאחר כשתי דקות של דגירה, יש להטביע את העוברים על ידי ניעור עדין של המנה עד שהמדיום נמרח על פני המנה. בדקה האחרונה של הדגירה, הוציאו שלוש טיפות נפרדות של 50 מיקרוליטר של תמיסת TS שתי בצלחת.
בתום שלוש הדקות, השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שהעוברים התכווצו מעט. אם העוברים עדיין נפוחים, המשיכו בדגירה למשך דקה עד שלוש דקות נוספות. כעת, הרימו את העוברים עם נימי זכוכית והעבירו אותם לטיפה הראשונה של TS שתיים.
המתן שלוש דקות והעביר את העוברים לטיפה השנייה. ואחריו הטיפה השלישית. לבסוף, שלפו את צלחת המדיום העוברי המוכנה המאוחסנת באינקובטור, והשתמשו בנימי זכוכית כדי להעביר את העוברים לטיפה הראשונה של המדיום.
אם נבדקים תחת סטריאוסקופ, העוברים צריכים לשחזר לאט לאט את המורפולוגיה הרגילה שלהם. כעת, החזירו את המנה לחממה למשך כעשר דקות. ואז לשטוף את הסוכרוז שהועבר מ-TS שתיים.
העבירו את העוברים לטיפה הבאה של מדיום התרבית. המשיכו לגדל את העוברים בחממת ה-CO2 עד שהם מועברים ל-UC של הנקבות המקבלות. לאחר זיגוג והתאוששות בין 300 ל-480 עוברים משלושה זני עכברים שונים, השרידות הייתה גבוהה מאוד.
לאחר ההפשרה, שיעור העוברים שהראו מורפולוגיה תקינה היה בין 93% ל-99% ומתוכם לפחות 84% התפתחו לציסטות בלסט. אל תשכח שעבודה עם חנקן דולף עלולה להיות מסוכנת ביותר ואמצעי זהירות כדי למנוע מגע ישיר ולמזער חשיפה למרחקים קצרים לדליפה. תמיד יש ליטול חנקן על ידי ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטת ויטריפיקציה המבוססת על אתילן גליקול לשימור בהקפאה של עוברים של עכברים. טכניקה זו יתרונית בשל פשטותה ורעילותה הנמוכה לעוברים, מה שהופך אותה למתאימה עבור זני עכברים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של הרבייה
- אמבריולוגיה
רקע
- ויטריפיקציה היא שיטה המשמשת לשימור דגימות ביולוגיות בטמפרטורות נמוכות.
- קריו-פרוטקטורים קונבנציונליים עלולים להיות רעילים לעוברים.
- אתילן גליקול הוא חלופה פחות רעילה לשימור עוברים.
- ניתן להחיל שיטה זו על עכברים בעלי רביית פנים (inbred) ועכברים שעברו שינוי גנטי.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה פשוטה ויעילה להקפאה (cryopreservation) של עוברים בעכברים.
- הערכת שיעורי ההישרדות והלידה של עוברים לאחר ויטריפיקציה והפשרה.
- מתן פרוטוקול שניתן לאמץ באופן נרחב במעבדות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טבילת העוברים בתמיסות השוואת ריכוז (equilibration) וויטריפיקציה.
- אחסון העוברים בחנקן נוזלי לצורך שימור בהקפאה.
- תהליך ההפשרה כולל העברה של העוברים לתמיסה היפרו-אוסמוטית.
- גידול העוברים עד להבשלתם להעברה לנקבות מקבלות.
תוצאות עיקריות
- נצפו שיעורי הישרדות של מעל 90% לאחר הפשרה.
- שיעורי הלידות נעו בין 30% ל-70% לאחר העברת עוברים.
- העוברים הראו התאוששות מורפולוגית תקינה לאחר הפשרה.
- תועדו שיעורים גבוהים של התפתחות לשלב הבלסטוציסט.
מסקנות
- השיטה המבוססת על אתילן גליקול יעילה להקפאה (cryopreserving) של עוברי עכבר.
- טכניקה זו ממזערת את הרעילות העוברית בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- זוהי אפשרות בת-ביצוע עבור זני עכברים שונים במחקר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הקפאה עמוקה (cryopreservation) יציבה של עוברי עכברים בעלי גיוון גנטי מהווה בסיס לרציפות של מחקרים תרגומיים ולגמישות בשרשרת הפיתוח הביופרמצבטית. ויטריפיקציה מבוססת אתילן גליקול מאפשרת שיעור הישרדות גבוה של עוברי עכברים וישימות רחבה למגוון זנים, ובכך תומכת בניהול בר-הרחבה של מושבות ובשימור משאבים גנטיים. שיטה זו מפחיתה סיכונים ביולוגיים ומסירים חסמים תפעוליים בגישה למודלים פרה-קליניים לאורך תוכניות הגילוי והפיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ארכוב מאובטח ואחזור מהיר של מודלים של עכברים מהונדסים גנטית לצורך מחקרים מונחי-השערה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי הבטחת גישה עקבית למערכות in vivo מתוקשפות.
- מסייע במיון הפורטפוליו באמצעות שמירה על אספקה זמינה של רקעים גנטיים מגוונים לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק עוברים סטנדרטיים בעלי חיוניות גבוהה לצורך סריקת פנוטיפ ופיתוח בדיקות בהמשך התהליך.
- מבטיח הדירות ויכולת הרחבה ביצירת קהלים פרה-קליניים ממלאים קפואים.
- מפחית שונות בקלטים ביולוגיים, ובכך תומך בתהליכי עבודה מהימנים להערכת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- שומר על מודלים גנטיים רלוונטיים למחלה לצורך השוואה לאורכית והשוואה בין מחקרים.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי הגנה על זנים קריטיים.
- תומך בהחלטות קידום מבוססות ניהול סיכונים על ידי הבטחת זמינות המודלים למחקרי אישור.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול ויטריפיקציה זה משלב בין שלבי יצירת המודל, ניהול המושבות ותחילת המחקר הפרה-קליני, ובכך מאפשר מעבר חלק מהנדסה גנטית לתיקוף in vivo.
- ביולוגיית גילוי: משמרת מודלים גנטיים מתוקפים לבדיקה חוזרת של היפותזות ולניתוח מסלולים.
- סריקה: מספקת עוברי איכות גבוהה לפיתוח בדיקות הדירות (reproducible) ומסעות סריקה.
- אנליטיקה: מספקת מדדי הישרדות והתפתחות כמותיים להערכת ביצועי השימור בהקפאה (cryopreservation).
- מחקר תרגומי: מבטיחה המשכיות של המודל לצורך התאמת סמנים ביולוגיים ומחקרים תרגומיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת שימור בהקפאה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר על פני תוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית על ידי שמירה על נאמנות המודל.
- ערך תפעולי: מייעל את ניהול המושבות באמצעות הקפאה (cryopreservation) והשבה הניתנות לשחזור וניתנות להרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי הבטחת זמינות המודל.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום מהיר של מטרות מאומתות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות טכנית בטיפול בעובריים ובפרוטוקולים של שימור בהקפאה (cryopreservation).
- נדרשת גישה לאחסון בחנקן נוזלי ולתשתית להפשרה מבוקרת.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח התאוששות עקבית ושימוש בהמשך התהליך.
- ניתן להתאימו למגוון רחב של זני עכברים עם אופטימיזציה של הפרוטוקול לפי הצורך.
- אמצעי בטיחות הם חיוניים בעבודה עם חומרים קריוגניים.
