Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשמר בהקפאה עוברי עכברים בחנקן נוזלי ולהפשיר אותם לצורך התאוששות של עכברים חיים. זה מושג על ידי טבילה תחילה של עוברי עכברים במדיום שיווי משקל, העברתם למדיום זיגוג בצינור קריו, ולאחר מכן הנחתם במיכל חנקן נוזלי. ניתן להפשיר עוברים מאוחרים יותר בתווך אוסמוטי גבוה ולדגור במדיום תרבית עד שהם מועברים לנקבות המקבלות.

בסופו של דבר, התוצאות מראות הישרדות של יותר מ-90% מהעוברים לאחר הפשרת הזגוגית, ושיעורי לידה בין 30% ל-70% לאחר החזרת העוברים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שגליקול הקריופרוטקטנט החדיר פחות רעיל לעוברים מאשר חומר קריופרוטקטנט קונבנציונאלי. מדגים את ההליך יהיה טכנאי מהמעבדה שלי לפני תחילת פרוטוקול זה.

הכן שני עוברי עכברי תאים בתרבית המתקבלת על ידי הזדווגות טבעית או טכניקות IVF קונבנציונליות לצינור קריו לאחסון בסופו של דבר, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת הקפאת עוברים EF S 40. לאחר מכן הכינו צלחת פטרי מפלסטיק בגודל 35 מילימטר או 60 מילימטר עם 50 מיקרוליטר טמפרטורת החדר. EFS 20.

השתמש בנימי זכוכית כדי להעביר עד 30 עוברים למנה. היזהר להימנע מהעברת מדיום התרבית. כמו כן, כדי להבטיח התייבשות של העוברים, הניחו אותם בתחתית הטיפה.

לאחר כ-60 עד 90 שניות, השתמש בצינור נימי כדי לשאוב עוברים מיובשים. עם מורפולוגיה מכווצת. העבירו את העוברים הללו לתמיסת EFS בצינור הקריו, והעבירו כמה שפחות EFS 20.

לאחר העברת העוברים, אפשר להם להתיישב ב-EFS 40 למשך דקה אחת לפני הקפאתם בחנקן נוזלי. לפני הפשרת העוברים מניחים בצלחת תרבית לפחות שתי טיפות של מדיום תרבית עובר באוסמולריות גבוהה של 10 מיקרוליטר, כגון מדיום M 16. לאחר מכן מכסים את הטיפות לחלוטין בסיליקון או בשמן מינרלי, ומניחים את המנה בחממת פחמן דו חמצני עד לשימוש.

לאחר מכן, יש לחמם את תמיסת ה- TS one ל -37 מעלות צלזיוס תוך לבישת מסכת פנים וכפפות קריו. הוציאו את העוברים ממיכל החנקן הנוזלי. כעת פתח במהירות את צינור הקריו והשליך כל חנקן נוזלי למיכל או לכל מיכל מתאים.

לאחר מכן המתן 30 שניות. כעת הוסף 850 מיקרוליטר TS חם תמיסה אחת לצינור הקריו. יש לשאוב בעדינות ולהוציא את התמיסה כ -10 פעמים כך שהיא מומסת באופן שווה.

לאחר מכן העבירו את כל הנפח לצלחת פטרי מפלסטיק 60 מילימטר. או צפו בזכוכית ממתינה שלוש דקות עד שהעוברים יתאזנו לטמפרטורת החדר שם הם אמורים להישאר למשך שארית ההליך. אין להשתמש במכשיר חימום.

בדוק במהירות את העוברים בצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לדעת איך הם נראים בתחילת הדגירה הזו. לאחר כשתי דקות של דגירה, יש להטביע את העוברים על ידי ניעור עדין של המנה עד שהמדיום נמרח על פני המנה. בדקה האחרונה של הדגירה, הוציאו שלוש טיפות נפרדות של 50 מיקרוליטר של תמיסת TS שתי בצלחת.

בתום שלוש הדקות, השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שהעוברים התכווצו מעט. אם העוברים עדיין נפוחים, המשיכו בדגירה למשך דקה עד שלוש דקות נוספות. כעת, הרימו את העוברים עם נימי זכוכית והעבירו אותם לטיפה הראשונה של TS שתיים.

המתן שלוש דקות והעביר את העוברים לטיפה השנייה. ואחריו הטיפה השלישית. לבסוף, שלפו את צלחת המדיום העוברי המוכנה המאוחסנת באינקובטור, והשתמשו בנימי זכוכית כדי להעביר את העוברים לטיפה הראשונה של המדיום.

אם נבדקים תחת סטריאוסקופ, העוברים צריכים לשחזר לאט לאט את המורפולוגיה הרגילה שלהם. כעת, החזירו את המנה לחממה למשך כעשר דקות. ואז לשטוף את הסוכרוז שהועבר מ-TS שתיים.

העבירו את העוברים לטיפה הבאה של מדיום התרבית. המשיכו לגדל את העוברים בחממת ה-CO2 עד שהם מועברים ל-UC של הנקבות המקבלות. לאחר זיגוג והתאוששות בין 300 ל-480 עוברים משלושה זני עכברים שונים, השרידות הייתה גבוהה מאוד.

לאחר ההפשרה, שיעור העוברים שהראו מורפולוגיה תקינה היה בין 93% ל-99% ומתוכם לפחות 84% התפתחו לציסטות בלסט. אל תשכח שעבודה עם חנקן דולף עלולה להיות מסוכנת ביותר ואמצעי זהירות כדי למנוע מגע ישיר ולמזער חשיפה למרחקים קצרים לדליפה. תמיד יש ליטול חנקן על ידי ביצוע הליך זה.