Name: Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: למד שיטת קיפאון זרעוני עוברי עכברים בחנקן נוזלי באמצעות אתילן גליקול. שיטה זו מציעה שרידות של מעל 90% ושיעורי לידה של 30-70%, עם רעילות נמוכה לעוברים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נערך בשיתוף פעולה עם פרויקט BioResource הלאומי, משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה, יפן.

התוכנית הכוללת של הניסוי מוצג באיור. 1. 1. מגיב הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המדיום הבסיס (כאן המכונה PB1) בתוך בקבוק זכוכית 100 מ"ל לפי התרשים הבא להלן: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.4 </td><td> 136.98 </td><td> 800.0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.6 </td><td> 2.68 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136.1 </td><td> 1.47 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 0.12 H 2 O </td><td> 358.14 </td><td> 8.04 </td><td> 288.1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6 שעות 2 O </td><td> 203.3 </td><td> 0.49 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><t><td> 180.2 </td><td> 5.56 </td><td> 100.0 </td></t></tr><tr><td> Na pyruvate </td><td> 110 </td><td> 0.33 </td><td> 3.6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0.9 </td><td> 13.2 </td></tr><tr><td> פניצילין G </td><td></td><td></td><td> 6.0 (בערך) </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את Ficoll-סוכרוז (FS) פתרון: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את כימיקלים הבא 14 מ"ל של תמיסת PB1 בתוך שפופרת 50 מ"ל. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6.0 גרם </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 3.424 גרם </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42.0 מ"ג </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים Ficoll 70 ו סוכרוז בתמיסה PB1 ולנער היטב עד שהיא נמסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בדיקת פירוק מוחלט לעיל, להוסיף BSA על פני הפתרון ולשמור אותו4oC עד BSA הוא נמס לגמרי (&gt; 4 שעות או למשך הלילה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתרון איזון (EFS20) והפתרון vitrification (EFS40) בתוך שפופרת 50 מ"ל: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EFS20: 20% (v / v) אתילן גליקול, 24% (w / v) Ficoll, ו 0.4 mol / L סוכרוז ב PB1 עם BSA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EFS40: 40% (v / v) אתילן גליקול, 18% (w / v) Ficoll, ו 0.3 mol / L * סוכרוז ב PB1 עם BSA * לקבלת עוברים מהלחץ BALB / c או ICR, להגדיל את הריכוז של סוכרוז כדי סוכרוז mol / L 0.9 משום שהם רגישים יותר cryodamage 6. </li></ul><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 פתרון </td><td> EFS40 פתרון </td></tr><tr><td> אתילן גליקול </td><td> 1 מ"ל </td><td> 2 מ"ל </td></tr><tr><td> FS פתרון </td><td> 4 מ"ל </td><td> 3 מ"ל </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי סינון באמצעות filte 0.45 מיקרומטרr. הפוך את aliquots ב 5 צינורות פוליסטירן מ"ל ולאחסן ב 4 ° C. הם יכולים לשמש במשך כ 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון הפשרה העובר המכיל 0.75 סוכרוז M (TS1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 7.7 גרם סוכרוז ב PB1 (מוכן בשלב 1.1) ולהביא את הנפח הכולל עד 30 מ"ל. מערבבים על ידי ניעור עדין עד סוכרוז הוא נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 90 מ"ג של ארגון ה-BSA על פני השטח את הפתרון ולהשאיר אותו לעמוד עד שהיא נמסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot ולאחסן ב 4 ° C. הם יכולים לשמש במשך כחודש 1. </li></ol> הערה: TS1 יכול גם להיות מוכנים מ M2 זמינים מסחרית. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 7.7 גרם סוכרוז ב M2 ולהביא את הנפח הכולל עד 30 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים על ידי ניעור עדין עד סוכרוז הוא נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot ולאחסן בבית 4oC. הם יכולים לשמש במשך כחודש 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (TS2 הפשרה פתרוןהמכיל 0.25 סוכרוז M): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 10 מ"ל TS1 עם נפח של 20 מ"ל PB1 או M2, לפי העניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot ולאחסן ב 4 ° C. הם יכולים לשמש במשך כחודש 1. </li></ol></li></ol> 2. Vitrification של 2-תא עוברי עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 תאים עכבר עוברי על ידי הזדווגות טבעית או קונבנציונלית טכניקות הפריה חוץ גופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 50 EFS40 μl לתוך cryotube. להלן, לבצע את שאר ההליך vitrification בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 Aliquot μl של EFS20 על החלק התחתון של 35 מ"מ או 60 מ"מ צלחת פטרי פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עד 30 עוברים אל EFS20 באמצעות זכוכית נימי עם כמות מינימלית בלבד של המדיום לתרבות. הפעלת טיימר 2 דקות. הערה: עוברים מקום בחלק התחתון של הירידה. זה גורם להתייבשות יעיל של עוברים. בדוק את המורפולוגיה של העוברים על ידי stereomicroscope. עוברים מיובש להראות מורפולוגיה מצומק, כפי שמוצג באיור. 2A.אם הם לא מספיק מיובש, לחכות עוד 1 או 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב דקות על 1.5, להרים את העוברים מירידה EFS20 עם סכום מינימלי בלבד של הפתרון. העברת אותם EFS40 ב cryotube שהוכנו 2.1 צעד. הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להתאים את התזמון של מרים עוברים כך שכל העוברים ניתן להעביר לתוך EFS40 ב 2 דקות בערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את cryotube ישירות לתוך חנקן נוזלי (LN 2). </li></ol> 3. הפשרה מזוגגת 2 תא עוברי עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הפשרה, להכין צלחת עם 10 טיפות של μl בינוני העובר תרבות עוברי התאושש (ראה שלב 3.13). מכסים את צלחת עם שמן ומניחים CO 2 באינקובטור עד לשימוש. הערה: למרות כל אמצעי התקשורת לתרבות העובר שגרתי ניתן להשתמש בניסוי זה, אנו ממליצים התקשורת עם osmolarity גבוה כגון בינוני M16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם TS1 ל 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים מסכה על הפנים cryogloves. פתח את 2 LN tank ולאחזר cryotube המכילות עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח במהירות את החלק העליון של הצינור וזורקים LN 2. חכו 30 שניות כדי למנוע TS1 מן המקפיא בבית לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 1000ul להוסיף 850 μl של TS1 (37 ° C) לתוך הצינור ומערבבים את הפתרון על ידי pipettings עדין (כעשר פעמים ב 25 שניות) עד הפתרון הוא מומס שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את כל נפח של הצינור אל צלחת פטרי פלסטיק 60 מ"מ (או זכוכית שעון) (איור 3A). הערה: עוברים יש לטפל בטמפרטורת החדר (22-25 ° C) עד שהן ממוקמות 2 CO 3.14 חממה בכל שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל טיימר 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 2 דקות בערך ב TS1, לנער בעדינות את המנה עד בינוני המכיל עוברים משתרע על פני השטח של צלחת (איור 3B). הערה: זה יעזור העוברים לרדת למטה משום שהם צפים קרוב לפני השטח, כאשר הועבר TS1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציב שלושה 50 טיפות של μl TS2 על הדואר צלחת (איור 3 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3 דקות בתוך TS1, לבדוק את המורפולוגיה של העוברים על ידי stereomicroscope, הם צריכים להיות מכווץ מעט. ראה את המורפולוגיה של העוברים קודם לכן (איור 2B) ומאוחר יותר (איור 2C) ב TS1. הערה: אם עוברים הם עדיין נפוחות, לשמור אותם במשך יותר TS1 1 עד 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העוברים ולהעבירם ירידה הראשון של TS2 (איור 3D). התחל טיימר 3 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 דקות, העברת עוברים לירידה השני ולאחר מכן ירידה השלישי (איור 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים למדיום תרבות מוכנים בשלב 3.1. עוברים הם בצורת באיור. 2D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת בתוך CO 2 באינקובטור. כ -10 דקות מאוחר יותר, העברת עוברים לירידה הבא של המדיום תרבות לשטוף את סוכרוז כי בוצעה על מ TS2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך התרבות חממה CO2 עד החזרת העוברים. הערה: העברת embryos על oviducts של נקבות הנמען ביום הפשרה. תרבות לונג במבחנה עלולה להפחית את הכדאיות של עוברים בכמה זנים של עכברים. </li></ol> 4. נציג תוצאות: במבחנה - ובפיתוח-vivo של עוברים לאחר ההפשרה מוצג לוחות 1 ו -2. היתרונות של פרוטוקול זה הן שרידות גבוהה של עוברים לאחר ההפשרה ואת הישימות שלו רחב זנים שונים של עכברים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> זן </td><td> מספר כולל של צינורות </td><td> מספר עוברי מזוגגת </td><td> ששוחזרו (מס '(%)) </td><td> נורמלי מורפולוגית (מס '(%)) </td><td> פיתוח ל blastocysts (מס '(%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / CA </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> טבלה 1. בפיתוח חוץ גופית של מזוגגת-מופשר עוברים זנים עכבר משותף <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מצב של עוברים </td><td> מספר הנמען נקבות </td><td> מספר עוברי העבירה </td><td> השרשה אתרים (מס '(%)) </td><td> חיים צאצאים (מס '(%)) </td></tr><tr><td> טרי </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> מזוגגת </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> טבלה 2. בפיתוח-vivo של מזוגגת-מופשר עוברי עכברים C57BL/6J. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1. התכנית הכוללת של הניסוי כולל איזון, vitrification, ואת הפשרת עוברים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> באיור 2. המורפולוגיה של העוברים בכל שלב ההפשרה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> באיור 3. הפשרה בהליך של עוברים. כל ההליכים מתבצעים בטמפרטורת החדר. (א), הוסף 850 μl של TS1 (37 ° C) לתוך cryotube ולהעביר את כל נפח של הפתרון cryotube על צלחת פלסטיק. בשלב זה, עוברים את המראה הנפוח, כפי שמוצג באיור. 2B. (ב), מורחים את הפתרון על פני השטח של צלחת ידי ניעור עדין. (ג), מקום three 50 טיפות של μl TS2 על צלחת הפלסטיק. (ד), מעבירים את העוברים לירידה הראשון של TS2. לאחר 3 דקות, עוברים את המראה shurunken כפי שמוצג באיור. 2C. (ה), להעבירם סדרתיly לתוך TS2 הנותרים טיפות ואז המדיום לתרבות.

<ol><li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196%C2%B0+and+-269%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li>
<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196%C2%B0C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li>
<li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mamm.+Ova.+Res%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li>
<li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution%2C+without+appreciable+loss+of+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fert%22%5BJournal%5D)">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li>
<li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li>
<li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li>
<li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li>
<li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li>
<li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li>
</ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

מאז הדו&quot;ח הראשון של vitrification העובר עכבר ידי Rall ו פאהי ב -1985 2, שיפורים טכניים שונים נעשו כדי להגדיל את השרידות של עוברים לאחר ההפשרה. אחד השינויים המוצלחים ביותר הושג על ידי שימוש אתילן גליקול כמו cryoprotectant בגלל רעילות נמוכה שלה גבוהה קרום חדירות. יתרונות אלה מאפשרים לנו להתמודד עם העוברים הקפאה בטמפרטורת החדר 4; vitrification שיטות אחרות דורשות העובר מסירת בטמפרטורות קריר הם לא תמיד ישים כמה זנים של עכברים כולל BALB / c 6. אתילן גליקול first vitrification מבוססי פותחה על ידי קסאי et al. בשנת 1990 5,7. בגלל השיטה המקורית היתה אופטימיזציה עבור קשיות כמו מכולות, יש לנו את הפרוטוקול שונה מעט עבור cryotubes, אשר נגיש יותר בקלות במעבדות עמידים יותר בפני נזקים פיזיים. לכן, השיטה vitrification המתוארת כאן עשויה להיות האפליקציהlicable למעבדות רבות תוך שימוש בעכברים כמודל מחקר. השיטה זהה יכול לשמש גם עבור עוברי עכברים בבית morula ושלבי הבלסטוציסט 8 ו - 9 עוברים חולדה. עם זאת, מצאנו לאחרונה כי איכות cryotubes עשויים להשפיע על שיעורי ההישרדות של עוברים לאחר הקפאה, הפשרה. לכן, חשוב לבחון את פני השטח הפנימי של cryotubes עבור החלקות שלה לפני עוברי vitrifying (לדוגמא: לראות את לוח ריאגנטים ספציפיים וציוד). שיטות Vitrification יש יתרונות רבים על פני שיטות קונבנציונליות הקפאה איטית, אבל הם מטבעם יש חיסרון ביחס לצורך תחבורה. כאשר עוברים מזוגגת צריך להישמר ב -120 מעלות צלזיוס מתחת לשמור על יכולת הקיום שלהם, משלחים יבשים משמשים בדרך כלל עבור תחבורה בטוחה שלהם. משלוחים יבש הם מגושמת וכבדה, ואת שלהם הלוך ושוב הוא יקר, במיוחד עבור תחבורה בינלאומי. עכשיו אנחנו כרגע מפתחים שיטה vitrification חדשאשר עוברים מזוגגת ניתן לאחסן בטמפרטורת קרח יבש (כ -80 ° C) לפחות 7 ימים 10. שיטה זו צריכה להיות vitrification של הדור הבא.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> שור בסרום אלבומין </td><td> מרק Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> אתילן גליקול </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 ° 12 שעות 2 </sUB&gt; O </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6 שעות 2 O </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן pyruvate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 בינוני </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2 בינוני </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Cryotube </td><td> Sumitomo הבקליט </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;קריוגני Vial&quot; </td></tr></table>

cryopreservation של עוברי עכברים ידי vitrification אתילן גליקול מבוסס

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation של עוברי עכברים בסיס טכנולוגי התומך מדעים ביו, כי זנים רבים של עכברים הופקו על ידי שינויים גנטיים המספר גדל בעקביות שנה אחר שנה. הפיתוח הטכני שלה התחיל עם שיטות הקפאה איטית בשנות ה -1970 1, לאחר מכן על ידי שיטות vitrification שפותחה בסוף שנות ה 1980 2. באופן כללי, הטכניקה האחרונה היא יתרון זריזות שלו, הפשטות, ושרידות גבוהה של עוברים התאושש. עם זאת, cryoprotectants הכלול הם רעילים ועלולים להשפיע על התפתחות העובר הבאים. לכן, השיטה לא יושמה על זנים מסוימים של עכברים, גם כאשר הפתרונות הם מקורר 4 ° C כדי למתן את האפקט הרעיל במהלך הטיפול העובר. לכל BioResource RIKEN המרכז, יותר מ 5000 זנים עכבר עם רקע גנטי שונה פנוטיפים מתוחזקים 3, ולכן יש לנו אופטימיזציה te vitrificationchnique שבה אנחנו יכולים cryopreserve עוברים מן זנים שונים של עכברים, עם היתרונות של הישרדות גבוה העובר לאחר vitrifying ו מפשיר (או המסה, ליתר דיוק) בטמפרטורת הסביבה 4. כאן, אנו מציגים שיטה vitrification עבור עוברי עכבר אשר שימש בהצלחה במרכז שלנו. הפתרון cryopreservation מכיל אתילן גליקול במקום DMSO למזער את רעילות עוברים 5. הוא מכיל גם Ficoll ו סוכרוז למניעת devitrification והתאמה האוסמוטי, בהתאמה. עוברים ניתן לטפל בטמפרטורת החדר והועברו לתוך חנקן נוזלי תוך 5 דקות. בגלל השיטה המקורית היתה אופטימיזציה עבור קשיות כמו מכולות, יש לנו את הפרוטוקול שונה מעט עבור cryotubes, אשר נגיש יותר בקלות במעבדות עמידים יותר בפני נזקים פיזיים. כמו כן, אנו מתארים את הליך הפשרת עוברים מזוגגת בפירוט כי זה קריטי STEp עבור התאוששות יעיל של עכברים חיים. מתודולוגיות אלה יהיה מועיל חוקרים וטכנאים הזקוקים לשימור זנים העכבר לשימוש מאוחר יותר בצורה בטוחה וחסכונית.

אתילן גליקול מבוססי שיטה vitrification עבור עוברי עכבר מתואר. זהו יתרון לשיטות אחרות בפשטותו ורעילות נמוכה עובריים, ולכן יכול להיות ישים באופן נרחב זנים רבים של עכברים, כולל עכברים טבועה ו גנים שונה.

Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס

שימור בהקפאה (Cryopreservation) של עוברי עכברים הוא בסיס טכנולוגי התומך במדעי הביו-רפואה, כיוון שזנים רבים של עכברים הופקו באמצעות הנדסה גנטית...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא שימור בהקפאה של עוברי עכבר בחנקן נוזלי והפשרתם לצורך השגת עכברים חיים. הדבר מושג תחילה על ידי טבילת עוברי העכבר במדיום הרגלה (equilibration medium), העברתם למדיום ויטריפיקציה בתוך מבחנה לקריו (cryo tube), ולאחר מכן הנחתם במיכל חנקן נוזלי. בשלב מאוחר יותר ניתן להפשיר את העוברים במדיום אוסמוטי גבוה ולהדגירה במדיום תרבית עד להעברתם לנקבות מקבלות.בסופו של דבר, התוצאות מראות הישרדות של יותר מ-90% מהעוברים לאחר הפשרה מוויטריפיקציה, ושיעורי לידה שבין 30% ל-70% לאחר השאת עוברים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהקריו-פרוטקטנט החדיר glycol הוא פחות רעיל לעוברים מאשר קריו-פרוטקטנטים קונבנציונליים. טכנאי מהמעבדה שלי ידגים את הפרוצדורה לפני תחילת פרוטוקול זה.הכינו שני עוברים של עכבר בשלב שתי התאים בתרבית, שהושגו באמצעות הזיווג טבעי או בטכניקות IVF קונבנציונליות, בתוך מבחנה להקפאה (cryo tube) לצורך אחסון עתידי, והוסיפו 50 µl של תמיסת הקפאת עוברים EF S 40. לאחר מכן, הכינו צלחת פטרי פלסטית של 35 מילימטרים או 60 מילימטרים עם 50 µl של EFS 20 בטמפרטורת החדר.השתמשו בנימי זכוכית כדי להעביר עד 30 עוברים אל הצלחת. היזהרו להימנע מהעברת מדיום התרבית. כמו כן, כדי למנוע התייבשות של העוברים, מקמו אותם בתחתית הטיפה.לאחר כ-60 עד 90 שניות, השתמשו בצינור קפילרי כדי לשאוב את העוברים המיובשים, בעלי מורפולוגיה מכווצת. העבירו עוברים אלו לתוך תמיסת EFS בתוך מבחנת הקריו, תוך העברת כמות מינימלית ככל האפשר של EFS 20.לאחר העברת העוברים, יש לאפשר להם להתייצב ב-EFS 40 למשך דקה אחת לפני הקפאתם בחנקן נוזלי. לפני הפשרת העוברים, יש להניח בצלחת תרבית לפחות שתי טיפות של 10 µL של תמיסת תרבית עוברים בעלת אוסמולריות גבוהה, כגון תמיסת M 16. לאחר מכן, יש לכסות את הטיפות לחלוטין בשמן סיליקון או בשמן מינרלי, ולהניח את הצלחת באינקובטור פחמן דו-חמצני עד למועד השימוש.בשלב הבא, חממו את תמיסת ה-TS one ל-37 °C תוך כדי חבישת מסכת פנים וכפפות קריו. הוציאו את העוברים ממיכל החנקן הנוזלי. כעת, פתחו במהירות את מבחנה הקריו ושפכו כל שארית של חנקן נוזלי בחזרה למיכל או למכל מתאים אחר.לאחר מכן המתן 30 שניות. כעת הוסף 850 µl של תמיסת TS one חמה למבחנה לקריו. שאב והזרק בעדינות את התמיסה כ-10 פעמים כדי שתהיה מומסת באופן אחיד.לאחר מכן, העבירו את כל הנפח לצלוחית פטרי פלסטית בקוטר 60 מילימטר או לזכוכית שעון. המתינו שלוש דקות עד שהעוברים יגיעו לשיווי משקל עם טמפרטורת החדר, שבה הם יישארו למשך שאר הפרוצדורה. אין להשתמש במכשיר חימום.בחנו במהירות את העוברים בצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי להתרשם ממראם בתחילת דגירה זו. לאחר כד שתי דקות של דגירה, השקיעו את העוברים על ידי ניעור עדין של הצלחת עד שהתווך יתפשט על פני שטח הצלחת. בדקה האחרונה של הדגירה, הוציאו שלוש טיפות נפרדות של 50 µL מתמיסת TS two לתוך צלחת.בסיום שלוש הדקות, השתמשו במיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שהעוברים התכווצו מעט. אם העוברים עדיין נפוחים, המשיכו את הדגירה למשך דקה עד שלוש דקות נוספות. כעת, הסירו את העוברים באמצעות קפילרה מזכוכית והעבירו אותם לטיפה הראשונה של TS two.המתינו שלוש דקות והעבירו את העוברים לטיפה השנייה. לאחר מכן, העבירו אותם לטיפה השלישית. לבסוף, הוציאו מהאינקובטור את צלחת מצע גידול העוברים שהוכשרה, והשתמשו בקפילרית זכוכית כדי להעביר את העוברים לטיפה הראשונה של המצע.בבדיקה תחת סטראוסקופ, העוברים אמורים להחזיר בהדרגה את המורפולוגיה התקינה שלהם. כעת, החזירו את הצלחת לאינקובטור למשך כ-10 דקות. לאחר מכן, שטפו את הסוכרוז שעבר מ-TS two.העבירו את העוברים לטיפה הבאה של תוצר תרבית. המשיכו בגידול העוברים באינקובטור CO2 עד להעברתם ל-uc של נקבות רקבלנט. לאחר ויטריפיקציה והשבה של בין 300 ל-480 עוברים משלושה זני עכברים שונים, שיעור ההישרדות היה גבוה מאוד.לאחר ההפשרה, שיעור העוברים שהראו מורפולוגיה תקינה היה בין 93% ל-99%, ומבין עוברים אלו לפחות 84% התפתחו לבלסטוציסטים. זכרו כי עבודה עם חנקן נוזלי עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע מגע ישיר ולמזער חשיפה מקרוב לחנקן. יש להשתמש בחנקן תמיד תוך ביצוע נוהל זה.

cryopreservation-mouse-embryos-ethylene-glycol-based

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר וידאו זה אנו מציגים הפגנה צעד אחר צעד כיצד לאסוף ביציות cryopreserve אוגר עם שלאחר ההפשרה שיעור גבוה הישרדות. ההליך אותו יכול גם להיות מיושם בהצלחה להקפיא להפשיר עוברי עכבר בשלבים שונים של פיתוח preimplantation.

איסוף cryopreservation של ביציות ועוברים אוגר עכבר

עוברים Preimplantation ניתן cryopreserved לאחר מיקום בפתרון cryoprotective hypertonic לגרום להתייבשות הסלולר. לאחר איזון, היווצרות קרח קריסטל מושרה בפתרון המקיף את העובר. התייבשות נוספת מתרחשת כאשר העובר הוא מקורר לאט לטמפרטורות שמתחת לאפס לפני צולל לתוך חנקן נוזלי לאחסון.

Cryopreservation של עוברים Preimplantation של בקר, כבשים ועזים

כאן אנו מדגימים את החדש שפותח אני • ערכת cryo עבור cryopreservation זרע העכבר. שני תאים בשלב התפתחות העובר עם זרע קפוא מופשר השתפר באופן עקבי 5 זנים עכבר עם השימוש בערכה זו. במשך 1.5 שנים, 49 קווי עכבר מהונדסים גנטית היו בארכיון ידי cryopreservation זרע עם • אני cryo ערכה ולאחר מכן התאושש בהצלחה על ידי הפריה חוץ גופית.

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

בסרטון זה, אנו מתארים את הליך הוויטריפיקציה של עוברי ארנבים שנקטפו בשלב ההתפתחות הרצוי באמצעות אתילן גליקול ודימתיל סולפוקסיד כהגנה קריוגנית וקש קריוגני כמערכת הנשא. לעוברים המזוגגים יש שיעור הישרדות גבוה וניתן לאחסן אותם לתקופה ממושכת עד לשימוש.

ויטריפיקציה של עוברי ארנב באמצעות קש קריוגני: טכניקת קירור מהירה במיוחד לשימור עוברי ארנבים לאחסון לטווח ארוך

סרטון זה מדגים את הליך הפשרת עוברי ארנב מזוגגים ואת צעדי מדידת הזהירות להתאוששות אופטימלית של העוברים.

הפשרת עוברי ארנב: הליך התחממות לשחזור עוברי ארנב שמורים בהקפאה לצורך החזרת עוברים

העברת עובר ברחם, חצוצרות משתמשת בצומת הרחם-חצוצרות כמחסום כדי למנוע את יצוא העובר שעלול להתרחש בעת ביצוע העברה ברחם. זכרים שעוקרו נדרשים להשיג מקבלי pseudopregnant לעוברים. שני הטכניקות הם דנו.

העברת רחם-תובל עובר ועיקור במודל העכבר

MicroSecure Vitrification פותחה כמערכת התקני ויטריפיקציה סגורה אספטית לא מסחרית התואמת לשיטות הייצור והטיפול ברקמות של ה-FDA. עקב הוצאת קשיות עובר סתומות הידרופוביות מהתעשייה, הליך הזיגוג שונה כך שיכלול אטם פנימי לפני פקק הכותנה הפנימי הסטנדרטי.

Vitrification MicroSecure השתנה: כספת, פשוט מאוד נוהל Cryopreservation אפקטיבי עבור blastocysts אנוש

טכניקות הרבייה בסיוע (אמנויות) הן בהערכה רציפה כדי לשפר את התוצאות ולהפחית את הסיכונים הקשורים. כתב יד זה מתאר הליך מינימלית פולשני העברת העובר עם פרוטוקול הקריוגנית יעיל המאפשר שימוש בארנבים כמודל בעלי חיים אידיאלי של רבייה אנושית.

העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב

כאן אנו מציגים פרוטוקול זמן לשגות morphometric לעקוב האינטנסיביות של הבלסטוציסט התכווצות והתרחבות re במהלך התערבויות previtrification ושחזור פוסט-התחממות כדור הארץ. היישום של הפרוטוקול אפשרי במבחנה מעבדות הפריה מצויד מיקרוסקופים בצילום מואץ והוא מומלץ בפיתוח של שיטת ויטריפיקציה הבלסטוציסט אופטימלית.

פרוטוקול Morphometric להערכה אובייקטיבית של הבלסטוציסט התנהגות במהלך ויטריפיקציה והשלבים התחממות כדור הארץ

כאן, אנו מציגים שיטה ששונתה עבור הקפאת הזמנות של עוברי תא אחד, כמו גם פרוטוקול כי זוגות השימוש של עוברים הקפאת להקפיא ואלקטרופורציה עבור הדור היעיל של עכברים מהונדסים גנטית.

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מרית מונטווידאו לזיגוג עוברים לפני השרשה של עכברים וכבשים, המורכב ממרית תוצרת בית ושימוש בתמיסות תוצרת בית. העוברים מתאזנים במהירות בשתי תמיסות קריופרוטקטנטיות בריכוז הולך וגובר, נטענות על המרית, טובלות בחנקן נוזלי, ולבסוף נאטמות בקשית של 0.5 מ"ל.

מרית מכשיר מונטווידאו לזיגוג של עוברי יונקים

למד שיטת קיפאון זרעוני עוברי עכברים בחנקן נוזלי באמצעות אתילן גליקול. שיטה זו מציעה שרידות של מעל 90% ושיעורי לידה של 30-70%, עם רעילות נמוכה לעוברים.

Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס

גלה סרטונים נוספים