תא לכידת באמצעות מכשיר microfluidic

המכשירים כפי שהכנו אותם, נארזים בערכות של 10 או 20, וכשהם מגיעים, הם נשלחים קרים בקופסה והערכה מכילה את כל הרכיבים שאתה צריך כדי להריץ. הניסוי בערכה הוא חבילה עם כל המזרקים והבלמים, שיכולים להישאר בטמפרטורת החדר. יש גם עותק של הפרוטוקול שאנחנו הולכים לעקוב אחריו בניסוי הזה.

יש גם קופסת קירור, המכילה את המכשירים עצמם ואת כל המאגרים הפועלים שצריך לקרר. בדרך כלל, ערכות נארזות בקבוצות של 10 או 20. כאשר אינן בשימוש, יש לקרר את הערכות.

כל מזרק וכל רכיב בערכה מסומנים בקפידה והתוויות תואמות את הטבלה בפרוטוקול שאנו עוקבים אחריו. כך שאין אי בהירות באיזה מזרק או רכיב ערכה יש להשתמש בשלבים הבודדים. לאחר פירוק המכשירים והכנסתם לארון בטיחות ביולוגי, נבצע את ההליך של בידוד הנויטרופילים ולייזציה שלהם ליישומים גנומיים במורד הזרם, מכיוון שהצלת החיים שנקבל תשמש לבידוד או, או שנחלץ את ה-RNA מהליזאט של התא.

בשל כך, אנו רוצים לוודא שהאזור שלנו נקי, לא רק במובן הסטרילי, אלא גם נקי מכל רנ"א שנמצא בדרך כלל בסביבה. לכן חשוב מאוד לנגב את כל האזור והמכשירים שלך עם הפתרון שמשמיד RNAs. אז בדרך כלל נמחק את כל הכלים ומשטחי העבודה שלנו עם RNA SAP או RNA, שתוכלו להשיג ממספר יצרנים.

המכשיר הגיע ארוז בנרתיק איטום חום. כל מכשיר אטום ומקודד ברקוד זה. אתה צריך, אתה צריך לרשום את הברקוד הזה אם אתה עובד עם דגימות קליניות כלשהן.

אז המכשיר לא אטום, הכיסוי הוסר והוא מונח במכשיר סעפת החזקת המשאבה. דגימת הדם בה אנו משתמשים היא דגימה של דם מלא. אנחנו הולכים להזרים אותו דרך המזרק הסטנדרטי של מיל BD, וזה מסומן מזרק אחד.

בדרך כלל מה שנעשה הוא, המזרק מוסר מהאריזה והפקק מוריד בזהירות מצינור הדם. ומה שאתה עושה זה להפיל 700 מיקרוליטר או 0.7 מיל דם ולהזריק חצי מזה או 350 מיקרוליטר לתוך צינור של 1.5 מיל. תודה. בדרך זו, הדם שלך יכול להיות מועבר הלאה להמשך עיבוד.

צינור הדם שלך יכול לעבור הלאה ובכל זאת נשאר לך עוד דם במקרה של כשל במכשיר. אז עכשיו מה שאנחנו הולכים לעשות זה להעמיס את המזרק שיש בו דם, הלאה, על המחט הזו, שמחוברת לחתיכת צינור עם המכשיר הזה. אנחנו רוצים להיות מאוד עם, עם מכשיר הבידוד המיקרופלואידי.

אנו רוצים להיזהר מאוד לא להכניס בועות אוויר למכשיר או שהמכשיר יתקלקל. אז בדרך כלל מה שאנחנו עושים זה לקחת את המזרק ואנחנו לוחצים כלפי מטה על הבוכנה ומוסיפים את הנוזל למשטח העליון של המכשיר, מוודאים שהוא מחובר לגמרי לפני שפלטנו את כל הנוזל. אנו עוצרים ואנו מוציאים בזהירות את גוף המזרק מהמחט ובעצם ממלאים את קצה המחט או, או, את מחבר הפיתוי של המחט עם המאגר הנותר שנמצא במזרק זה.

אנחנו נפטרים מזה. לאחר מכן ניקח את המזרק שלנו עם דם ונכניס אותו פנימה, לתוך מרכז הפיתוי הזה. יש להיזהר שלא לשפוך את הדם ולהיזהר שלא להכניס בועות אוויר.

מצא שעדיף להשתמש בקימו המחזיק את גוף המזרק ואת הצינור למקרה שנשפך דם. פעם אחת, ברגע שהמזרק מחובר לבית הצינור או למחט, אנו נותנים לו כמה ברזים חדים כדי להסיר בועות אוויר, שעלולות להיות במחבר. לאחר מכן מזרק זה נטען על משאבת המזרק ולאחר מכן את, והוא מאובטח באמצעות בורג הנעילה.

משאבת המזרק מופעלת והיא כבר מוגדרת מראש לתנאי הזרימה שלנו. אנחנו הולכים להזרים את הדם הזה דרך המכשיר במהירות של 30 מיקרוליטר לדקה. לאחר שגוף המזרק נטען לתוך משאבת המזרק, אנו הולכים ללחוץ על הכפתור בזרוע הבוכנה הניתנת להזזה ולהחליק אותה כלפי מטה עד שהיא נוגעת בחלק העליון של הבוכנה ומתחיל לדחוף נוזל החוצה דרך קצה זה.

זה קצה קהה, מחט נירוסטה. ברגע שנדע שהמערכת מוכנה, נלחץ על הפעלה. כדי להתחיל את זרימת הדם, אתה לוחץ על עצור כדי לעצור אותו ואז אתה לוקח צינור צנטריפוגה נקי של 1.5 מיל או צינור פנדור ואנחנו הולכים לנתק בזהירות.

נתק רק אחד, נתק את הצינור מיציאת אחת של המכשיר. לאחר ניתוק הצינור הזה מהחשמל, נכניס אותו לצינור הפנדור של 1.5 מיל. נלחץ על Run כדי להתחיל שוב את זרימת הדם.

וכאשר אנו רואים טיפת דם נוצרת, אנו עוצרים את המשאבה ומכניסים אותה לתוך הכניסה שזה עתה פתחנו במכשיר. נלחץ על הפעלה כדי להתחיל את זרימת הדם ונכוון טיימר לחמש דקות. אנו רוצים לוודא שהדם ממלא באופן שווה את כל התאים ושאין בועות אוויר ברורות במכשיר.

אם יש בועות אוויר שחוסמות את הזרימה לאחד מהתאים, אתה יכול לקחת זוג פינצטה ולהעביר אותם לאורך התעלות הקטנות, המובילות לתאי הלכידה או לתעלות הקטנות היוצאות מתאי הלכידה. המכשיר הזה מתמלא יפה, כך שלאחר חמש דקות, אתה לוחץ על עצור על משאבת המזרק כדי לעצור את זרימת הדם, אתה משחרר את המהדק למזרק ומוציא אותו ממחזיק משאבת המזרק. לאחר מכן נשתמש במזרק מספר שלוש, הטעון ב-PBS נטול נוקלאז אנחנו הולכים להשתמש, אנחנו בעצם הולכים, שוב נוודא שפני השטח של המכשיר מחוברים כדי למנוע בועות אוויר, נקיש על המזרק כדי ליצור כל אחד, נוודא שכל בועות האוויר נמצאות בחלק העליון של גוף המזרק.

שחרר את הזרוע על משאבת המזרק והכנס את מזרק שלושת הטחנה למשאבה. הדק אותו כלפי מטה ואז דחף את הבוכנה כלפי מטה עד שהיא תיצור קשר עם הבוכנה של המזרק. אנחנו לוחצים על ריצה ואנחנו מחכים לנוזל שיפעיל את המכשיר ואנחנו מחכים לראות טיפה בקצה מחט הנירוסטה.

כשאתה רואה טיפה נוצרת, אתה עוצר את המשאבה. אנחנו הולכים להוציא את הדם, את קצה הנירוסטה שיש בו את הדם. אנחנו הולכים להכניס את מאגר הכביסה וללחוץ על הפעלה.

ואנחנו הולכים לתת לזה להימשך חמש דקות. ואתה צריך לקחת מגבון נקי ופשוט לנגב כל כמות קטנה של דם, שעשויה להיות בכניסה או ביציאה לאחר חמש דקות של הפעלת מאגר כביסה דרך המכשיר, המכשיר צריך להיות נקי לחלוטין מכל דם ואתה יכול לראות שבעצם לא יישאר דם אדום במכשיר, המכשיר ייראה ברור. אז מה שאנחנו הולכים לעשות זה שאחרי חמש הדקות, אנחנו הולכים לעצור את מאגר הכביסה מלפעול.

ושוב, אנחנו הולכים להוריד את המזרק ממשאבת המזרק. אנחנו הולכים לכסות את צינור המיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיל, ממש על צינור היציאה הגמיש. ואנחנו הולכים להרים בזהירות את הצינור, את צינור המיקרו-צנטריפוגה, למשוך את צינור הפסולת החוצה מהמכשיר.

אנחנו הולכים לזרוק את זה למיכל ביולוגי. בערכה צינור יציאה חדש, שעשוי למעשה מטפלון. יש לו שוב, קצה נירוסטה עליו.

אנחנו הולכים להחליף את צינורות השקע הישנים בצינור השקע החדש הזה. אנחנו הולכים לקחת את צינורות היציאה האלה וננסה לכופף אותם סביב צורת U או V. ואז גם עם הערכה יש עמוד מגרסת קאיה, זה גוזז DNA ובעצם הופך את חיי התא שלך להומוגניזציה.

אז אנחנו הולכים, אנחנו הולכים לפתוח את המכסה הסגול של עמוד המגרסה ולהניח את צינור היציאה לתוך עמוד המגרסה של קיי. אנחנו הולכים להוציא מהערכה את המזרק מספר שתיים, שאומר, עבור RLT אנחנו הולכים להשתמש בו. זהו מזרק BD סטנדרטי של מיל אחד למזרק עם קצה קהה בגודל 22, נירוסטה.

אנחנו הולכים להשתמש בזה כדי להזריק 350 מיקרוליטר של RLT סטנדרטי מקיוג'ן למכשיר. מכיוון שלמכשיר יש נפח מת של כ-50 מיקרוליטר, מה שאנחנו רוצים לעשות זה להזריק את ה-RLT, אבל מאחורי ה-RLT, אנחנו רוצים להזריק פקק אוויר, כדי לשחרר את הנפח המת של המכשיר לתוך עמוד מגרסת הצ'י. אז הדרך שבה נעשה את זה היא שניקח את המזרק שלנו, נמשוך, נשאב 350 מיקרוליטר אוויר ואז אחריו 350 מיקרוליטר או 0.35 מיל של RLT וה-RLT נמצא עכשיו בתחתית המזרק.

התנגד לפיתוי להפוך את המזרק ולהזריק את האוויר. האוויר נמצא שם כדי לוודא שאנחנו מכניסים את כל ה-RLT לעמודת המגרסה של קיי שלנו. אנחנו הולכים לשלוף את הצינור ממאגר הכביסה.

אנחנו הולכים להכניס את המזרק שלנו עם ה-RLT ואנחנו הולכים להזריק לאט את ה-RLT לתוך המכשיר במשך תקופה של כ-30 שניות, כדי לוודא שצינור היציאה פולט את הפסולת שלו לתוך עמוד מגרסת הצ'י. ברגע שמתחיל להזריק אוויר למכשיר, אתה לוחץ כלפי מטה על הפלומור ומחכה שכל הנוזל ישתחרר לתוך עמוד ה-Kay Shredder. אנו מכסים את עמוד המגרסה של קיי ואנו מסובבים אותו על פוגה מיקרו-מרכזית עם איזון ב-15,000 סל"ד או מקסימום סל"ד על נתיך מיקרו-מרכזי ספסל למשך שתי דקות.

אז אחרי שסובבנו את העמודה במשך שתי דקות, אנחנו הולכים להוציא ממנה את הדגימה, שנמצאת עכשיו ב-RLT ואנחנו הולכים למקם אותה באחד מבקבוקוני הקריו הסגולים שסופקו. אם אתה עובד עם דגימה קלינית, דגום את בקבוקוני הקריו האלה, תתייג אותו בתחילת הניסוי. הנה הליזאט בבקבוקון הקריו.

בקבוקון קריו זה מונח מיד במקפיא AC C מינוס 80 מעלות ומאוחסן למשלוח או למיצוי RNA מאוחר יותר. אז זהו פרוטוקול חלופי לבידוד נויטרופילים. במקום לליז את התאים עם מאגר RLT, אנו הולכים לצבוע אותם בכתם היסטולוגי סטנדרטי.

כתם. אז אנחנו מוציאים את המכשיר האטום מהשקית ופורקים אותו שוב, רושמים את מספר האצווה על המכשיר ומניחים את צלחת הפטרי. במחזיק צלחת פטרי.

אנחנו הולכים לקחת את המזרק של מיל אחד ממזרק השקית מספר אחת שלו, אנחנו הולכים להעמיס עליו 700 מיקרוליטר דם ולהזריק מחצית ממנו 350 מיקרוליטר לתוך צינור DPH. נשים את זה בצד. קח את המזרק הרביעי, שיש לו את הצינור שבו נשתמש כדי לבחור, להזריק את הדם למכשיר.

הולך להחזיק את בסיס המחט מקצה הצינור בצורה כימית. הסר את גוף המזרק ומלא את הפיתוי. המתאם יחצץ וישליך את המזרק הזה.

נכניס את המזרק המכיל דם למחט באמצעות המגבון הכימי כדי לאסוף כל זליגה. נקיש על המזרק כדי להסיר בועות אוויר בחיבור בין המחט לגוף המזרק. נעמיס את המזרק למשאבת המזרק, נפעיל את הצינור על ידי לחיצה כלפי מטה על הזרוע הנעה של משאבת המזרק.

ננתק את הצינור מאחד השקעים של המכשיר, מכשיר הלכידה, ונכניס אותו לתוך צינור עינור של 1.5 מיל. ואז נתחיל להזרים דם על ידי לחיצה על משאבת המזרק. נחכה שתיווצר טיפת דם בקצה הנירוסטה.

ברגע שהטיפה נוצרת אתה לוחץ על עצור לטפוח את הדם הזה, הכנס אותו למכשיר ולחץ על הפעלה. עכשיו קבענו טיימר לחמש דקות. אוקיי, לאחר שזרם במכשיר במשך חמש דקות, לחץ על עצור על משאבת המזרק ושחרר את המזרק.

ואנחנו הולכים להחליף את המזרק הזה במזרק של שלושה מיל המכיל את מאגר הכביסה שלנו, שהוא רק XPBS אחד. שוב, אנחנו רוצים לוודא שהחלק העליון של המכשיר מחובר ואז אנחנו הולכים להסיר את קצה המחט המכיל דם או פלוס לרוץ. התחל להקדים את המכשיר.

אנחנו הולכים ליצור טיפות, אנחנו מכניסים אותן למכשיר ולוחצים על Run טפיחה על כל דם בכניסה או בצינור היציאה וניתן לזה לזרום במשך חמש דקות לאחר שלב הכביסה. שוב, נעצור את משאבת המזרק ונוציא את המזרק ממחזיק המשאבה. כדי לבצע שמירה סטנדרטית על ה-GIM, אנו הולכים קודם כל לתקן את התאים ולייבש אותם באמצעות 100% מתנול.

אז אנחנו, יש לנו מזרק, מזרק של שלושה מיל טעון מראש במתנול. שוב, אנחנו הולכים להפעיל את המזרק, לוודא שמתנול זורם, לעצור את משאבת המזרק, להכניס אותו למכשיר וללחוץ על הפעלה. אנחנו הולכים לתקן אותם בתמיסת המתנול הזו למשך שתיים עד ארבע דקות.

אז אחרי שתיים עד ארבע דקות של קיבוע ומתנול, אנחנו עוצרים את המשאבה, משחררים את המזרק עם מתנול, וכאן אנחנו הולכים להעמיס מזרק, מזרק של שלושה מיל המכיל eem sustain סטנדרטי eem sustain מסיגמא מדולל אחד עד חמישה במים נטולי יונים. לאחר שדיללנו, העמסנו למזרק ובקצה המזרק אנו מחברים פילטר של 0.8 מיקרון כדי לסנן את כל החלקיקים שייכנסו פנימה, מה שבסופו של דבר יסתום את המכשיר. הכתם למשך חמש עד 10 דקות.

ואז נשטוף במים של דיון הראשון. אז אחרי חמש עד 10 דקות של צביעה, נעצור את משאבת המזרק ונחליף את המזרק עם מאגר הצביעה עם המזרק המכיל מים נטולי יונים, אנחנו בעצם הולכים לשטוף עד שנראה, הצבע הכחול של ה-SAI נשטף מהמכשיר. לאחר שטיפת עודפי הג'ים מהמכשיר, אנו מפסיקים את תמיסת הכביסה.

ואז מה שאנחנו הולכים לעשות זה להוציא את מזרק המים מהכניסה. לאחר מכן ניקח את צינור היציאה של המכשיר. אנחנו הולכים לאחוז בצינור הזה בסוף עם הפינצטה שלנו.

זהו צינור טיגון גמיש ואנחנו הולכים להכניס אותו בחזרה לכניסה של המכשיר. זה אוטם את המכשיר ושומר על התאים לחות והמורפולוגיה שלהם שלמה. כעת עמיתי לעבודה, ד"ר ג'ון הונג צ'אנג, יציג פרוטוקול חלופי לבידוד של ארבעה לימפוציטים חיוביים CD, ואחריו צביעה אימונו-פלואורסצנטית ישירות בתוך המכשיר המיקרופלואידי.

אז שמי שונג הונג והיום אני הולך להדגים לכם צביעת תאים במכשיר מיקרופלואידי, בשלב זה כבר יכולה להראות לכם כיצד להשתמש במכשיר לבידוד זיקה חיסונית מיקרו פליק כדי לבודד באופן ספציפי תאי דם מדם מלא חסר תקדים. למטרתו, הוא רוצה להדביק את התאים ולקבל תכולת חלבון ו-DNA מאותם תאים מבודדים. ובכן, לצורך המחקר שלי, אני מעוניין לקבל את התאים ואז לקבל את ספירת התאים, למשל, לקבל ספירת CD של ארבעה תאים מדם מלא, ולהשתמש בזה כאינדיקטור למטרות אבחון.

אז המכשיר שמשתמש בו דומה מאוד למכשיר של קן. הוא עשוי מתא ישר P-D-M-S-A. הגיאומטריה שונה במקצת, כך שפרמטרי הפעולה שונים במקצת, בעוד שבאופן כללי הליך הפעולה הכולל דומה מאוד.

אז אני הולך לדלג על כל שלבי לכידת התאים ושטיפתם ולקפוץ ישירות לשלב צביעת התאים בהליכי ספירת התאים. אז הנה יש לי מכשיר שכבר חצאי תאים שנלכדו מדם מלא והמכשיר כבר נשטף עם PBS. אז התאים היוצאים כבר נשטפו החוצה מהמכשיר והכנתי מבעוד מועד תערובת נוגדנים המשמשת במיוחד לסימון התאים מבודדים לתוך המכשיר.

אז ריכוז הנוגדנים שהשתמשנו בו כאן עבר אופטימיזציה לצביעת התאים בעוצמה פלואורסצנטית גבוהה מאוד במיקרוסקופ פלואורסצנטי. אז ההליך די פשוט. אנו מעמיסים את המזרק המלא בתמיסת הנוגדנים על משאבת המזרק ולאחר מכן מוודאים שקצב הזרימה מוגדר לפרמטרים הנכונים הדרושים לנו.

ואז נתחיל את משאבת המזרק, נצפה בקצה הצינור, נוודא שהתמיסה כבר יוצאת כך שלא תהיה יותר בועה בצינור. ואז אנחנו יכולים לחבר את הצינור למכשיר המיקרופלואידי שלכדנו תאים. אז עכשיו נוגדנים זורמים לתוך המכשיר כדי להכתים את התאים שבודדנו לתוכם, במכשיר, קצב הזרימה כאן, אני משתמש בחמישה מיקרוליטר לדקה, אבל בהתאם לגיאומטריה של המכשיר שם, יכולים להיות פרמטרי זרימה שונים שאתה רוצה להשתמש בהם למטרה שלך.

ואנחנו נמשיך לזרום את תמיסת הנוגדנים למשך חמש דקות, וזה מספיק לנפח מספיק כדי להחליף את כל התמיסה בתוך תעלת המיקרופו. אז אחרי הזרקת נוגדנים, נעצור את הזרימה. אז אנחנו, אנחנו צפים בנוגדנים במהירות של חמישה מיקרוליטר לדקה למשך חמש דקות כדי להחליף את כל התמיסה בתוך המיקרו-ערוץ.

לאחר מכן אנו עוצרים את הזרימה ונותנים למכשיר לדגור ולטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. אז זה צריך להיעשות בחושך כדי שהנוגדן לא יכבה בזמן שהתאים, הנוגדנים הפלואורסצנטיים יכולים להרוות בזמן שהתאים מודגרים עם נוגדן מכתים. אז לאחר צביעה בדרך כלל של 15 דקות עד 30 דקות, פשוט ננתק את הצינור מהמכשיר ונחליף את מזרק הנוגדנים במזרק חיץ כדי לשטוף את הנוגדן הלא קשור מהמכשיר.

אז תמיסת הכביסה כאן מכילה 1% BSA בתמיסת PBS. BSA משמש לחסימת אי קשירה של נוגדנים על פני השטח ואנחנו נעשה את אותו הדבר. אז ראשית אנו מכוונים את קצב הזרימה במשאבת המזרק כדי לוודא שזה קצב הזרימה הנכון שרצינו ואז נפעיל את משאבת המזרק ונוודא שאכן יוצא נוזל מהצינור לפני שנחבר אותו למכשיר.

המטרה של זה היא שלא תישאר בועה כמו שאריות בצינור. אז כשאנחנו מזריקים, שום בועה לא נכנסת למכשיר שלנו. אז אנחנו פשוט מחברים את הצינור למכשיר ונותנים לו לזרום עוד חמש דקות כדי להחליף את כל השטיפה, את כל הנוגדן הלא קשור מהמכשיר.

לאחר שלב הכביסה, נתקן את התאים עם 1% PFA. המטרה היא שניתן יהיה לאחסן את המכשיר למשך מספר שבועות עד מספר שבועות אם ניתן לבצע את ההדמיה באופן מיידי. אז ההליך די פשוט.

זה דומה למה שעשינו בעבר. אנו מעמיסים את המזרק על המשאבה, מכוונים את קצב הזרימה לזה שרצינו, ואז אנו מפעילים את משאבת המזרק ואנו מחברים את הצינור למכשיר שלנו כדי להזריק את תמיסת ה-IDE, שהיא הקיבוע למכשיר שלנו כדי לתקן את התאים. שוב, נתנו לו לזרום במשך כחמש דקות.

אז PFA מחליף את כל המאגר במכשיר כדי לתקן את כל התאים במכשיר. אז לאחר שלב תיקון ה-PFA, אנחנו פשוט מורידים את מזרק ה-PFA ועכשיו המכשיר מוכן להדמיה. במקרים מסוימים, אנשים רוצים שיהיה להם צביעת גרעין כדי להראות אותו עם צביעת סמן פני התא שלהם.

אז למטרה זו יבצע צביעת גרעין באמצעות DPI בסוף. אז אנחנו פשוט טוענים את מזרק ה-DPI מופעל, מפעילים את משאבת המזרק ומזרימים DPI למכשיר שלנו. אז עכשיו הגרעין ייצבע בתאים האלה כדי להראות את מיקום התאים.

וזה, תמונת צביעת ה-DPI יכולה להיות מכוסה מאוחר יותר עם צביעת סמן פני השטח כדי להראות היכן התאים נמצאים. אז בסוף צביעת ה- DPI, עלינו לשטוף שוב את רצועת L DPI P עם תמיסת חיץ. אז שוב, אנו משתמשים ב-PBS המכיל 1% BSA כדי לשטוף את ה-dpi היוצא.

והמבצע דומה למה שעשינו בעבר. אנחנו פשוט מחברים את מזרק המאגר למכשיר שלנו וניתן למאגר לזרום לתוך המכשיר כדי לשטוף את ה-dap הלא מאוגד. אז זה כל ההליך של צביעת תאים במכשיר מיקרו נוזל.

ואחרי כל הליכי הצביעה, המכשירים מוכנים להדמיה. ומכיוון שעשינו תיקון PFA, ניתן לאחסן את המכשירים גם לכמה שבועות. אם לא ניתן היה לבצע הדמיית תמונה באופן מיידי.