Name: לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: למד שיטת מיקרופלואידיקה להעברת מולקולות גדולות לתאי מטרה באמצעות עיוות מכני מהיר. השיטה מאפשרת מניפולציה של תאי חיסון לטיפול בסרטן וניתוח זרימה מוודא יעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לט Shatova לדיון מועיל על עיצוב ניסיוני וניתוח נתונים. הסיוע והמומחיות של ג Paradis, כוח האדם של cytometry זרימת הליבה במכון קוך, ואת צוות של המעבדה לטכנולוגית מיקרוסיסטמס במכון טכנולוגית של מסצ&#39;וסטס הכירו בהכרת תודה. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות המענקים RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, וחלקית על ידי מכון הלאומי לסרטן סרטן מרכז תמיכה (Core) מענקי P30-CA14051 וMPP-09Call-לנגר-60.

1. אחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את מאגרי המים, בעלים, O-טבעות ומכשירי microfluidic ב70% אתנול. השתמש במכל (לדוגמא צנצנת או כוס) שיש לו מכסה כדי למנוע אידוי וזיהום על ידי חלקיקי אבק או בחוץ. הנח את המכשירים במכולה אחת (1), מאגרים וטבעות אטימות במכל שני (2), והמחזיקים בשלישי (3). </li></ol> שים לב: השימוש באתנול 70% לאחסון הוא לשמור על סטריליות. אם המרכיבים היחידים של הפתרון הם אתנול ומים (כלומר אין סוכני denaturing), כל רכיבי המערכת צריכים להיות תואמים באופן מלא ולא לבזות לאורך זמן. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי פתרון אתנול במכולות (2) ו (3) לפני כל שימוש כדי למנוע זיהום צולב פני ניסויים ולמזער את הנוכחות של חלקיקים לא רצויים שיכול לגרום לסתימה. </li></ol> 2. ניסוי הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיכלי מקום (2) ו (3) באמבטית אולטרסאונד עבורr דקות 5-10 לפני כל שימוש. מסייע בהסרה כל חלקיקים מזהמים מניסויים קודמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סביבת עבודה נקייה בארון בטיחות ביולוגי עם 70% פתרון אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את כל החומרים (3 מכולות, ופינצטה) עם פתרון אתנול 70% לפני הצבתם בתוך ארון הבטיחות הביולוגי. </li></ol> 3. עצרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקבע 2-3 מגבונים נמוך מוך באזור העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מאגרי פלסטיק מהמכל שלהם עם פינצטה והעלית אותם במגבונים כדי להקל על אידוי של פתרון אתנול ממשטחים פנימיים. לטפוח בעדינות את המאגרים על פני השטח או לפוצץ באוויר דרך אותם כדי להקל על ההסרה של תמיסת אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס O-טבעות לתוך החריץ המתאים שלהם במאגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בעל ושבבים ממכולות בהתאמה ולאפשר אתנול להתאדות (~ 1-2 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בפינצטה כדי למקם את הפנים כלפי מעלה הרצוי שבב (כלומר חורים את גישה) במחזיק. הרם את בעלעם השבב לeyelevel לוודא השבב שוכב בבעל ולהתאים במידת צורך עם פינצטה. חשוב: אם המכשיר אינו מתאים כראוי במחזיק בה, קיים סיכון שהיא תישבר במהלך השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, מניחים בעדינות את המאגרים על בעל וליישר אותם עם הסרטונים. היזהר שO-טבעות לא נופלים מהחריצים שלהם במהלך תהליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות ללחוץ כלפי מטה על המאגרים, עד שהם לוחצים למקומו. ודא ששני הצדדים של המאגרים מאובטחים, וכי השבב נראה בתנוחה הנכונה. </li></ol> 4. הכנת תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים חסיד (קווים ראשוניים או שהוקמו): תאי פלייט 1-2 ימים לפני הניסוי כזה שהם לא מחוברים יותר מ -80% ביום של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום תאים בתרחיף (ב PBS או מדיה רלוונטית) ולשאוף לריכוז פעילות של 1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר x ל1.0 10 7 cells / מיליליטר. הערה: לא נצפה בשל ריכוז תא שינויים משמעותיים בביצועי מסירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תאים ואת חומר המשלוח הרצוי בצינור נפרד כדי להשיג את ריכוז חומר המבוקש לצורך הניסוי. חשוב: בגלל שיטת ההצגה המתוארת מסתמכת על דיפוזיה כדי להקל על הגשה, ריכוז חומר גבוה יותר יניבו משלוח גבוה יותר. במידת האפשר, מומלץ להשתמש בפתרון 1 מיקרומטר של החומר הרצוי לניסויים ראשוניים. ריכוז זה אז יכול להיות טיטרציה למטה בניסויים עתידיים במידת צורך. הריכוז הנמוך ביותר שדווח בשימוש עם מכשיר זה הוא 10 ננומטר 21. </li></ol> 5. מבצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת פיפטה של ​​תאים וחומרי אספקה ​​למאגר (יש עיצוב הנוכחי קיבולת μl מקסימום 150). הערה: רוב עיצובי המכשיר הם הפיכים לחלוטין ולכן כיוון הזרימה בצינורות לא משנה. עשויות להיות עמוסות דוגמאות לכל אחד משני המאגרים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינורות לחץ למאגר המלא ולהדק את האום כדי להבטיח אטימה נאותה (הדוק אצבע הוא לעתים קרובות מספיק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את לחץ לרמה הרצויה על הרגולטור. זה מקובע את המהירות שבה התאים לנסוע דרך המכשיר. שים לב שתא הזרימה אינה מתחילה עד שהכפתור נלחץ. </li></ol> הערה: בעבודה קודמת, חנקן או אוויר דחוס שעבד באותה מידה כמו הגז המוביל. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את המכשיר לגובה עיניים ולכוון אותו כך שהנוזל במאגר הוא לעין בקלות. הערה: עקוב אחר עמודת הנוזל לכבות את המערכת לפני שהמאגר מתרוקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן לחצים על המאגר ויתחיל תא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשרמת הנוזל היא כ 2 מ&quot;מ מהחלק התחתון של המאגר, להפוך במהירות לרגולטור 0 psi כדי לעצור את הזרימה. חשוב: אם אחד לא מצליח לעצור את הזרימה לפני המאגר מתרוקן, אחד סיכונים ולהוציא המדגם מcollectioמאגר n. כמו כן שימו לב שאם עמודת הנוזל לא נעה בקצב ניכר, או הואטה באופן משמעותי ביחס לקצב הזרימה הראשוני שלה (למשל 3x איטי יותר), המכשיר המותקן הוא כנראה סתום וצריך להיות מוחלף. הפעלת מכשיר סתום יכולה לגרום למוות של תאים גבוהים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים שטופלו מהמאגר המתאים ולמקם אותם בצינור איסוף / הצלחת הרצויה. חשוב: אל לדלל את התאים שנאספו בכל מאגרים בשלב זה כתאי porated ימשיכו ספיגי חומר לעד 10 דקות 20. לאחר חלון זה חלף, לדלל את התאים בתקשורת / החיץ הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף תאים שטופלו יותר או לנסות תנאי ניסוי חלופיים, חזור על שלבים 5.1-5.7 לפי צורך. נזכיר כי השבבים הם הפיכים, יכולה להיות מותקנת ולכן דגימות בכל מאגר. הקפד להחליף שבבים במידת צורך אם הם סותמים. בטל מכשירים סתומים. </li></ol> 6. פירוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; בעדינות לנתק את המאגרים מהמחזיק העיקרי על ידי לחיצה בצד את זרועות קליפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל חלק במכל המתאים האחסון (המפורטים בסעיף 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שבבים המשמשים במכל נפרד לסילוק. </li></ol>

<ol><li>Schaffert, D., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+synthetic+polymer-based+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems.</a> Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).</li>
<li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knocking+down+barriers%3A+advances+in+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).</li>
<li>Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+therapeutics%3A+a+summary+and+pharmacological+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+by+Direct+Delivery+of+Reprogramming+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyvalent+Oligonucleotide+Gold+Nanoparticle+Conjugates+as+Delivery+Vehicles+for+Platinum%28IV%29+Warheads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).</li>
<li>Jiang, Z. -X., Zhang, Z. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+PTPs+with+small+molecule+inhibitors+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).</li>
<li>Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Delivery+of+Quantum+Dots+for+Live+Cell+Labeling+and+Organelle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking.</a> Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+Dots+for+Live+Cells+in+Vivo+Imaging%2C+and+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics.</a> Science. 307, 538-544 (2005).</li>
<li>Dahan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+Dynamics+of+Glycine+Receptors+Revealed+by+Single-Quantum+Dot+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking.</a> Science. 302, 442-445 (2003).</li>
<li>Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+Silica+Nanoparticles+for+Intracellular+Delivery+of+Membrane-Impermeable+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).</li>
<li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).</li>
<li>Joseph, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipids+used+in+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cationic lipids used in gene transfer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-structure-regulated+cell-membrane+penetration+by+monolayer-protected+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles.</a> Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).</li>
<li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+intracellular+protein+delivery+platform+based+on+single-protein+nanocapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules.</a> Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).</li>
<li>Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotube+Molecular+Transporters%3A+Internalization+of+Carbon+Nanotube-Protein+Conjugates+into+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).</li>
<li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).</li>
<li>li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+Gene+Therapy%3A+New+Developments+In+Vivo+and+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro.</a> Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).</li>
<li>Fox, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cells+in+microfluidic+devices%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cells in microfluidic devices: a review.</a> Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).</li>
<li>Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonoporation%3A+Mechanical+DNA+Delivery+by+Ultrasonic+Cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+and+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation.</a> Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).</li>
<li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonendocytic+Delivery+of+Functional+Engineered+Nanoparticles+into+the+Cytoplasm+of+Live+Cells+Using+a+Novel%2C+High-Throughput+Microfluidic+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device.</a> Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).</li>
</ol>

המחברים ארמון שערי, רוברט לנגר, וKlavs פ ג&#39;נסן הם בעלי מניות של SQZ יוטכנולוגיות חברה שמייצרת את מכשירי microfluidic שימוש במאמר זה.

היבטים מסוימים של ההליך המתואר ניסוי (כלומר גורמים אחרים מאשר תכנון שבבים ומהירות הפעלה) ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים בהתאם לסוג התא וחומר מסירת המערכת מוחל. הדיון שלהלן כתובות חלק מהגורמים הנפוצים ביותר שיש לשקול בעת תכנון ניסויים. כדי לשפר את אות המשלוח לתרכובות שכותרתו fluorescently, צריך לטפל במקורות של הקרינה רקע. פני השטח מחייב ואנדוציטוזה, למשל, ניתן לטפל על ידי שטיפת תאי 5-10 דקות לאחר לידה כדי לה...

משלוח של מקרומולקולות להציטופלסמה התא הוא שלב קריטי ביישומים טיפוליים ומחקר. משלוח nanoparticle בתיווך, למשל, הראה פוטנציאל בטיפול גנטי 1,2, תוך מסירת החלבון היא אמצעי מבטיח של משפיע על תפקוד תאי בשני 3 ומעבדה קליניות 4 הגדרות. חומרים אחרים, כגון תרופות מולקולה קטנות, נקודות קוונטיות, או חלקיקי זהב, הם בעלי עניין ביישומים החל תרופות לסרטן 5,6 לתיוג תאיים 7,8, ומולקולה בודדת מעקב 9. קרום התא הוא במידה רבה בלתי חדיר למקרומולקולות. קיימות טכניקות רבות משתמשות בחלקיקים פולימריים 10,11, ליפוזומים 12, או שינויים כימיים 13 כדי להקל על שיבוש קרום או מסירת endocytotic. בשיטות אלה, את כדאיות יעילות משלוח והתא הן בדרך כלל תלויה במבנה של המולקולת דואר יעד וסוג התא. שיטות אלו יכולות להיות יעילים באספקה ​​של חומרים אחידים מבחינה מבנית, כגון חומצות גרעין, אך לעתים קרובות אינו מתאימות עבור המשלוח של יותר מבחינה מבנית מגוונת חומרים, כגון חלבונים 14,15 וננו 7. יתר על כן, מנגנון שיבוש endosome שרוב השיטות אלה מסתמכים על הוא לעתים קרובות לא יעיל, ולכן משאיר את חומר רב לכוד במבני שלפוחית ​​16. לבסוף, שיטות שלעתים קרובות פותחו לשימוש עם שורות תאים הוקמו לא לתרגם גם לתאים ראשוניים. שיטות poration ממברנה, כגון electroporation 17,18 וsonoporation 19, הם חלופה אטרקטיבית ביישומים מסוימים, אך הם ידועים כגורמים לכדאיויות תא נמוכות ויכולים להיות מוגבל על ידי המטען של החומר המסירה היעד. עיוות מכאנית מהירה של תאים, גישת microfluidic למשלוח, יש לאחרונה demonstrated היתרונות שלה על פני שיטות הנוכחיות בהקשר של תא תכנות מחדש 20 ומשלוח nanomaterial 21. שיטה זו מסתמכת על הפרעה מכאנית o קרום התא כדי להקל על הגשת cytosolic של חומרים הנמצאים בחיץ שמסביב. המערכת הוכיחה מאפשרת פוטנציאלי במאתגר בעבר סוגי תאים (למשל תאים חיסוניים ראשוניים ותאי גזע) וחומרים (למשל נוגדנים וצינורות פחמן). בזאת, ההליך הכללי להשתמש במכשירים אלה למסירה תאית של מקרומולקולות היעד מתואר. ההליך הוא להכליל את רוב סוגי תאים וחומרי משלוח, עם זאת, מומלץ שאחד לערוך אופטימיזציה קצרה של תנאים, כמפורט בהנחיות תכנון 20 שדווחו בעבר שלנו, עבור כל יישומים שלא דווחו בעבר. נכון להיום, המערכת כבר שימשה בהצלחה עבור המשלוח של RNA, DNA, חלקיקי זהב, נקודות קוונטיות, צינורות פחמן, חלבוןים, ופולימרים dextran 20,21.

<table><tbody><tr><td>מחזיק מכשיר & מאגר פלסטיק</td><td>SQZ Biotechnologies</td><td>מחזיק</td><td></td></tr><tr><td>LSRמנתח פורטסה</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td>מכונת ציטומטריית זרימה המשמשת במכון קוך מתקני</td></tr><tr><td>ליבה מכשיר מיקרופלואידית</td><td>SQZ Biotechnologies</td><td>Cell Squeeze</td><td></td></tr><tr><td>O-Rings</td><td>McMaster</td><td>9452K311</td><td></td></tr><tr><td>מערכת לחץ להפעלת מכשיר</td><td>SQZ Biotechnologies</td><td>מערכת</td><td></td>לחץ</tr><tr><td>פינצטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמבט</td><td></td><td></td><td></td> אולטרסאונד</tr></tbody></table>

לוחץ תא כחזק, microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

עיוות מכאנית מהירה של תאים התפתחה שיטה למסירה תאית של מקרומולקולות וננו מבטיחה, ללא וקטור. טכנולוגיה זו הראתה פוטנציאל בטיפול ביישומים מאתגרים בעבר, כולל, משלוח לתאים ראשוניים חיסוניים, תכנות מחדש של תאים, פחמן Nanotube, ומשלוח נקודה קוונטית. פלטפורמת microfluidic ללא וקטור זה מסתמכת על הפרעה מכאנית של קרום התא כדי להקל על הגשת cytosolic של חומר היעד. במסמך זה, אנו מתארים את השיטה מפורטת של שימוש למכשירי microfluidic אלה כוללים, הרכבה מכשיר, הכנת תא, ותפעול מערכת. משלוח גישה זו מחייבת אופטימיזציה קצר של סוג המכשיר ותנאי הפעלה ליישומים לא פורסם בעבר. ההוראות שסופקו הן להכליל את רוב סוגי תאים וחומרי אספקה ​​כמערכת זו אינה דורשת מאגרים מיוחדים או צעדי שינוי כימי / הצמידה. עבודה זו מספקת גםשל המלצות על איך לשפר את ביצועי מכשיר וצרות-לירות בעיות פוטנציאליות הקשורות לסתימה, יעילות משלוח נמוכה, וכדאיויות תא.

איור 1 מכיל תיאורים סכמטי של מערכת מסירת microfluidic. איורים 2a-b להמחיש תוצאות טיפוסיות מטיפול בתאי הלה עם עיצובים שונים במכשיר בנוכחות dextran fluorescently מצומדות 3 kDa 20. אם ההליך ואחריו בצורה נכונה, ביצועי מערכת יהיו רגישים לסוג מכשיר ואת מהירות הפעלה. לכן, יש לייעל את התנאים הללו עבור יישום נתון לפני שתמשיך לעוד ניסויים מורכבים. בטווח של תנאי הפעלה שמודגמים באיור, כדאיות תא נשארת מעל 80%, עם זאת, יש לציין שפרמטרים לא טובים המסי...

עיוות מכאנית מהירה של תאים התפתחה שיטה למסירה תאית של מקרומולקולות וננו מבטיחה, ללא וקטור. פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים כיצד להשתמש במערכת עבור מגוון רחב של יישומים.

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

המטרה הכללית של ניסוי הנפילה היא להחדיר מקרו-מולקולות לתאי מטרה ללא שימוש בווקטורים, באמצעות הפרעה מכנית. דבר זה מושג תחילה על ידי הנחת סוג תאי המטרה בתליה יחד עם חומר ההחדרה הרצוי, וטעינתם למאגר של התקן מיקרופלואידי שתוכנן במיוחד. כשלב שני, ההתקן המיקרופלואידי מועמד תחת לחץ והתאים נדחפים דרך מערך של ערוצים מיקרופלואידיים הדוחסים את התאים כדי להקל על הפרעה זמנית של הממברנה.בשלב הבא, התאים עוברים אינקובציה בנוכחות חומר המסירה המיועד כדי להקל על מעבר דיפוזיבי של החומר אל תוך ציטופלזמת התא, בזמן שקרום התא עובר תיקון. התוצאות המתקבלות מראות מסירה יעילה של מקרו-מולקולות באמצעות ציטומטריית זרימה.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אלקטרופורציה וליפו-פקשן (lipo-fection), הוא יכולתה לטפל בסוגי תאים ובחומרים מאתגרים שלא ניתן להחדיר ביעילות באמצעות שיטות אחרות. שיטה זו יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגי, כגון כיצד לשפר את תכנות התאים מחדש (cell reprogramming). להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על הטיפול והאבחון של סרטן, מכיוון שהמערכת מאפשרת מניפולציה של תאי חיסון כדי להגביר את יעילותם נגד גידולים.כדי להתחיל, ייצרו או רכשו את התקן המיקרופלואידי, את מחזיק ההתקן, את מאגרי הנוזלים מפלסטיק ואת טבעות האיטום (O-rings) המוצגים כאן ומפורטים בטקסט של הפרוטוקול המצורף, ולאחר מכן מלאו חלקית שלושה מכלים נסגרים ב-70% ethanol. הניחו את ההתקנים במכל הראשון, את המאגרים וטבעות האיטום במכל השני ואת המחזיקים במכל השלישי. לאחר מכן, מלאו את המכלים עד סופם ב-70% ethanol.בשלב הבא, הנח את המיכל המכיל את המאגרים ואטמי ה-O-rings, וכן את המיכל המכיל את התומכים, לאמבט אולטרסאונד למשך חמש עד 10 דקות לפני השימוש. פעולה זו תסייע בהסרת חלקיקי זיהום מניסויים קודמים בזמן שהרכיבים עוברים סוניקציה; במקביל, נקה את משטח העבודה בתוך קבינת בטיחות ביולוגית באמצעות 70% ethanol. לאחר מכן, סטריליז את כל החומרים הדרושים, כולל שלושת המיכלים ופינצטה, על ידי ניגובם עם 70% ethanol, והנח אותם בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית כדי להתחיל בהרכבה.ראשית, הניחו שתיים עד שלוש מגבונים נטולי סיבים באזור העבודה. לאחר מכן, הוציאו את מאגרי הפלסטיק ממיכל האתנול באמצעות פינצטה והניחו אותם על המגבונים כדי להקל על הספיגה וההתאדות של האתנול מהשטח הפנימי שלהם. הקישו בעדינות על המאגרים כדי לסייע בהסרת תמיסת האתנול.במידת הצורך, השתמש בגז בלחץ כדי לרוקן לחלוטין את המאגרים. לאחר שהמאגרים התייבשו, הכנס את טבעות ה-O-rings לחריצים המתאימים במאגרים. לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי להניח את השבב כשהפנים כלפי מעלה במחזיק המכשיר.ודאו שהשבב מונח בצורה שטוחה בתוך התומך והתאימו את מיקומו במידת הצורך באמצעות הפינצטה. אם המכשיר אינו יושב כראוי בתומך שלו, קיים סיכון שהוא יישבר במהלך השלבים הבאים. לאחר מכן, הניחו בעדינות את מאגרי הנוזלים על התומך ויישרו אותם עם התפסים.ודאו שטבעות ה-O-rings אינן נופלות מהחריצים שלהן. במהלך תהליך זה, לחצו בעדינות על המאגרים עד שיישמעו נקישה המעידה על התבייתותם במקומם. ודאו ששני צדי המאגרים מאובטחים ושהשבב נראה במיקום הנכון.אין ללחוץ על המאגריים בכוח רב מדי, שכן הלחץ עלול לשבור את השבבים עבור תאים ראשוניים או תאי היצמדות. עבור שורות תאים, יש להוסיף את התאים יום עד יומיים לפני הניסוי, כך שהם לא יעברו 80% confluence.ביום הניסוי. מיד לפני תחילת הניסוי, קצרו את התאים וסספנדו אותם במדיום או בבופר אחר לפי הצורך, בריכוז של בין מיליון ל-10 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, העבירו בזהירות את סספנדת התאים דרך מסננת תאים בנקבים של 40 מיקרון כדי למנוע מצב שבו גושים של תאים ומטריקס יסתימו את המכשיר.לאחר הסינון, ערבבו 300 µL של תרחיף התאים עם הריכוז הרצוי של חומר המסירה במבחנה נפרדת. לצורך הדגמה זו, מוסיפים 2 µL של dextrin בריכוז 5 mg/mL ו-2 µL של נוגדן ביקורת איזוטופ Alexa 488 לכל 50 µL של תרחיף תאים.בשלב הבא, ערבבבב בעדינות 100 µL מהתאים באמצעות פיפטינג. לאחר מכן, באמצעות טיפים לטעינת ג'ל, העבר בפיפטה את התאים ואת חומר ההעברה לאחד ממאגרי הנוזלים, חבר צינור לחץ למאגר המלא והדק את החיבור ביד כדי להבטיח איטום תקין. לאחר מכן, כוון את לחץ האוויר בבקר ל-70 PSI כדי לשלוט במהירות שבה התאים נעים דרך המכשיר.יש לבצע אופטימיזציה של הלחץ עבור השילוב הספציפי של התא והשבב המיקרופלואידי המשמש בכל ניסוי. לאחר שהכל מוכן, הרימו את המכשיר לגובה העיניים וכוונו אותו כך שהנוזל במאגר יהיה גלוי למבט. לאחר מכן, לחצו על שסתום כפתור הלחיצה כדי להפעיל לחץ על המאגן ולהתחיל את זרימת התאים.עקבו אחר המהירות שבה הנוזל זורם מהמאגר. אם זרימת הנוזל מואטת באופן משמעותי ביחס לקצב הזרימה הראשוני, סביר שההתקן המותקן סתום ויש להחליפו. השקע (shear) המוגבר שנגרם כתוצאה מהחסימה יביא למות תאים ברמה גבוהה מהרגיל.כאשר מפלס הנוזל נמצא במרחק של כשני מילימטרים מתחתית המאגר, סובב במהירות את הווסת ל-0 PSI כדי להפסיק את הזרימה. חשוב להפסיק את זרימת האוויר לפני שהמאגר יתרוקן, אחרת הדגימה עלולה להידחף החוצה ממאגר האיסוף. לאחר מכן, אסוף את התאים שעובדו ממאגר המוצא והעבר אותם למבחנת מיקרו-צנטריפוגה.בטמפרטורת החדר, התאים המדורגים ימשיכו לספוג חומר למשך עד 10 דקות. לאחר 10 דקות, יש להעביר את התאים לצלחת עם מצע גידול נוסף או להמשיך להשתמש בתאים בהתאם לצרכים הניסויים. חזור על שלבים אלה כדי לאסוף את כמות התאים המטופלים הדרושה, והחלף את השבבים במידה והם נחסמים, תוך השלכה של המכשירים החסומים עבור כל דגימה עוקבת.שנו את כיוון הזרימה כדי למזער את השפעות הסתימה. עם סיום איסוף התאים, נתקו בעדינות את המאגרים מהתושבת הראשית על ידי דחיפת זרועות התפסים הצידה. לאחר מכן, הניחו כל חלק המיועד לשימוש חוזר במיכל האחסון המתאים ומלאו אותם ב-70% ethanol טרי.לבסוף, העבירו את כל השבבים המשומשים למכל נפרד לצורך סילוק נאות. נמדדו יעילות ההחדרה והחיוניות של תאי hela. לאחר סדרת ניסויים, נבחנו שלושה שבבים מיקרופלואידיים שונים בטווח מהירויות של עד 600 millimeters per second.בדיסות אלו הראו כי מהירויות זרימה מוגברות שיפרו את ההחדרה של דקסטרין בעל משקל מולקולרי של 3 kilodalton המסומן פלואורסצנטית אל תוך התאים בכל אחד מהשבבים שנבדקו. בנוסף, מהירויות מוגברות גרמו גם לירידה של כ-20% בחיוניות התאים במכשירים שנבדקו. שיעור מוות זה של תאים הוא נמוך יחסית, ולעתים קרובות הוא גבוה בהרבה במכשירים שתוכננו באופן שאינו הולם.ספיגת הדקסטרין המצומד ל-Pacific blue אל אוכלוסיית תאי הביקורת המוצגת משמאל היא תוצאה של קישור פני שטח מוגבל ואפקטים אנדוציטיים. התאים נחשפו לחומר ההעברה למשך אותו פרק זמן שבו נחשפו התאים המטופלים. מימין מוצגת אוכלוסיית תאים חיים שעברו דרך ההתקן המיקרופלואידי בזמן שהיו חשופים לאותו ריכוז של דקסטרין כמו תאי הביקורת.התאים באזור המוצל נחשבים לכאלו שלא הגיעו ליעדם, והתאים מימין לקו מוגדרים ככאלו שהגיעו ליעדם. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בפחות משעה אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו בדיקות לאחר הניתוח, כדי לענות על שאלות נוספות כגון יעילות ההגעה ותפקוד החומר לאחר פיתוחו.טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הרפואה הרגנרטיבית לחקור תכנות תאים בתאים ראשוניים של מבוגרים באמצעות הולכה ישירה של חלבונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן ההקמה והתפעול של מערכת הסחיבה העצמית (self squeezing system) עבור היישום הרצוי שלכם.

cell-squeezing-as-robust-microfluidic-intracellular-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

תא לכידת באמצעות מכשיר microfluidic

מערכת microfluidic הרומן פותחה באמצעות תופעת שאיבה פסיבית נוזל מבוקר המשתמש מערכת המסירה. מערכת זו microfluidic יש פוטנציאל לשמש במגוון רחב של יישומים ביולוגיים נתון, עלות נמוכה שלה וקלות השימוש, דיוק נפחי, מהירות גבוהה, הדירות ואוטומציה.

מהירות גבוהה Droplet מבוססי משלוח מערכת פסיבי שאיבה מכשירים microfluidic

שילוב הדור monodisperse טיפה עם סידור אינרציה של תאים וחלקיקים, אנו מתארים שיטה כדי לתמצת המספר הרצוי של תאים או חלקיקים בטיפה אחת בשיעורים kHz. אנחנו מדגימים את יעילות פעמיים העולה על אלו של אנקפסולציה לא מסודרת עבור טיפות יחיד ו פעמיים החלקיקים.

קצב העברת נתונים גבוה תא יחיד ו מרובה תאים מיקרו אנקפסולציה

אנחנו פיתחו תרבות תא אוטומטית וחקירת פלטפורמה לניסויי גירוי תא מיקרו בקנה מידה. הפלטפורמה מציעה שליטה פשוטה, תכליתית, ומדויקת בטיפוח ועידוד אוכלוסיות קטנות של תאים, ומחל lysates לניתוחים מולקולריים. הפלטפורמה מתאימה גם למחקרים המשתמשים בתאים ו / או חומרים כימיים יקרים.

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

jetting microfluidic נגד bilayer שומנים ממשק אגל מספק דרך אמינה כדי ליצור שלפוחית ​​עם שליטה על חוסר סימטריה בממברנה, שילוב של חלבונים הטרנסממברני, ואנקפסולציה של חומר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מגוון רחב של מערכות ביולוגיות שבי ביומולקולות הממודרת הן רצויה.

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

פלטפורמת electroporation סייע מערבולת microfluidic פותחה למסירה רציפה של מולקולות מרובות לתוך אוכלוסיות תאים זהות עם שליטה מדויקת ובלתי תלויה מינון. electroporation צעד טיהור תא המטרה שקדמו מבוסס גודל של המערכת סייע לשפר את יעילות אספקה ​​מולקולרית וכדאיויות תא מעובד.

Electroporator למשלוח סדרתית מולקולרי בסיוע וורטקס microscale

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות תאים בודדים עם פלטפורמה מיקרופלואידית, המשתמשת בתפיסת עיצוב מיקרו-באר חדשה כדי לאפשר בידוד תא בודד ביעילות גבוהה ותרבית משובטת לטווח ארוך.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

שבב מיקרופלואידי יוצר כדי לייצר זוגות של נקודות זהב ליצירת בועות טנדם ואיים מצופים פיברונקטין לדפוס תא בודד בקרבת מקום. שדה הזרימה שנוצר התאפיין במהירות תמונת חלקיקים ושימש לחקר השפעות ביולוגיות שונות, כולל נקבוביות קרום התא, עיוות ממברנה ותגובת סידן תוך תאית.

מערכת Microfluidic עם דפוסי Surface לחקירת בועת Cavitation (ים) אינטראקציה דו תא ואת Bioeffects הנובע מהן ברמת התא הבודד

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והתפעול של מכשיר אצוטופלואידי בעלות נמוכה עבור משלוח מולקולרי מהיר לתאים באמצעות sonoporation המושרה על ידי סוכני ניגוד אולטרסאונד.

הרכבה ותפעול של מכשיר אצוטופלואידי לאספקה משופרת של תרכובות מולקולריות לתאים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר תכנון, ייצור ואפיון של מערכת מיקרופלואידית המסוגלת ליישר, לשתק ולדחוס במדויק מאות עוברי Drosophila melanogaster עם התערבות מינימלית של המשתמש. מערכת זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ושחזור של דגימות לניתוח לאחר גירוי וניתן לשנות את קנה המידה שלה כך שיתאים למערכות ביולוגיות רב-תאיות אחרות.

מכניסטימולציה של אורגניזמים רב-תאיים באמצעות מערכת דחיסה מיקרופלואידית בעלת תפוקה גבוהה

למד שיטת מיקרופלואידיקה להעברת מולקולות גדולות לתאי מטרה באמצעות עיוות מכני מהיר. השיטה מאפשרת מניפולציה של תאי חיסון לטיפול בסרטן וניתוח זרימה מוודא יעילות.

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

גלה סרטונים נוספים