לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה
7 בנובמבר 2013
עיוות מכאנית מהירה של תאים התפתחה שיטה למסירה תאית של מקרומולקולות וננו מבטיחה, ללא וקטור. פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים כיצד להשתמש במערכת עבור מגוון רחב של יישומים.
המטרה הכללית של ניסוי הנפילה היא להחדיר מקרו-מולקולות לתאי מטרה ללא שימוש בווקטורים, באמצעות הפרעה מכנית. דבר זה מושג תחילה על ידי הנחת סוג תאי המטרה בתליה יחד עם חומר ההחדרה הרצוי, וטעינתם למאגר של התקן מיקרופלואידי שתוכנן במיוחד. כשלב שני, ההתקן המיקרופלואידי מועמד תחת לחץ והתאים נדחפים דרך מערך של ערוצים מיקרופלואידיים הדוחסים את התאים כדי להקל על הפרעה זמנית של הממברנה.
בשלב הבא, התאים עוברים אינקובציה בנוכחות חומר המסירה המיועד כדי להקל על מעבר דיפוזיבי של החומר אל תוך ציטופלזמת התא, בזמן שקרום התא עובר תיקון. התוצאות המתקבלות מראות מסירה יעילה של מקרו-מולקולות באמצעות ציטומטריית זרימה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אלקטרופורציה וליפו-פקשן (lipo-fection), הוא יכולתה לטפל בסוגי תאים ובחומרים מאתגרים שלא ניתן להחדיר ביעילות באמצעות שיטות אחרות. שיטה זו יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגי, כגון כיצד לשפר את תכנות התאים מחדש (cell reprogramming). להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על הטיפול והאבחון של סרטן, מכיוון שהמערכת מאפשרת מניפולציה של תאי חיסון כדי להגביר את יעילותם נגד גידולים.
כדי להתחיל, ייצרו או רכשו את התקן המיקרופלואידי, את מחזיק ההתקן, את מאגרי הנוזלים מפלסטיק ואת טבעות האיטום (O-rings) המוצגים כאן ומפורטים בטקסט של הפרוטוקול המצורף, ולאחר מכן מלאו חלקית שלושה מכלים נסגרים ב-70% ethanol. הניחו את ההתקנים במכל הראשון, את המאגרים וטבעות האיטום במכל השני ואת המחזיקים במכל השלישי. לאחר מכן, מלאו את המכלים עד סופם ב-70% ethanol.
בשלב הבא, הנח את המיכל המכיל את המאגרים ואטמי ה-O-rings, וכן את המיכל המכיל את התומכים, לאמבט אולטרסאונד למשך חמש עד 10 דקות לפני השימוש. פעולה זו תסייע בהסרת חלקיקי זיהום מניסויים קודמים בזמן שהרכיבים עוברים סוניקציה; במקביל, נקה את משטח העבודה בתוך קבינת בטיחות ביולוגית באמצעות 70% ethanol. לאחר מכן, סטריליז את כל החומרים הדרושים, כולל שלושת המיכלים ופינצטה, על ידי ניגובם עם 70% ethanol, והנח אותם בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית כדי להתחיל בהרכבה.
ראשית, הניחו שתיים עד שלוש מגבונים נטולי סיבים באזור העבודה. לאחר מכן, הוציאו את מאגרי הפלסטיק ממיכל האתנול באמצעות פינצטה והניחו אותם על המגבונים כדי להקל על הספיגה וההתאדות של האתנול מהשטח הפנימי שלהם. הקישו בעדינות על המאגרים כדי לסייע בהסרת תמיסת האתנול.
במידת הצורך, השתמש בגז בלחץ כדי לרוקן לחלוטין את המאגרים. לאחר שהמאגרים התייבשו, הכנס את טבעות ה-O-rings לחריצים המתאימים במאגרים. לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי להניח את השבב כשהפנים כלפי מעלה במחזיק המכשיר.
ודאו שהשבב מונח בצורה שטוחה בתוך התומך והתאימו את מיקומו במידת הצורך באמצעות הפינצטה. אם המכשיר אינו יושב כראוי בתומך שלו, קיים סיכון שהוא יישבר במהלך השלבים הבאים. לאחר מכן, הניחו בעדינות את מאגרי הנוזלים על התומך ויישרו אותם עם התפסים.
ודאו שטבעות ה-O-rings אינן נופלות מהחריצים שלהן. במהלך תהליך זה, לחצו בעדינות על המאגרים עד שיישמעו נקישה המעידה על התבייתותם במקומם. ודאו ששני צדי המאגרים מאובטחים ושהשבב נראה במיקום הנכון.
אין ללחוץ על המאגריים בכוח רב מדי, שכן הלחץ עלול לשבור את השבבים עבור תאים ראשוניים או תאי היצמדות. עבור שורות תאים, יש להוסיף את התאים יום עד יומיים לפני הניסוי, כך שהם לא יעברו 80% confluence.
ביום הניסוי. מיד לפני תחילת הניסוי, קצרו את התאים וסספנדו אותם במדיום או בבופר אחר לפי הצורך, בריכוז של בין מיליון ל-10 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, העבירו בזהירות את סספנדת התאים דרך מסננת תאים בנקבים של 40 מיקרון כדי למנוע מצב שבו גושים של תאים ומטריקס יסתימו את המכשיר.
לאחר הסינון, ערבבו 300 µL של תרחיף התאים עם הריכוז הרצוי של חומר המסירה במבחנה נפרדת. לצורך הדגמה זו, מוסיפים 2 µL של dextrin בריכוז 5 mg/mL ו-2 µL של נוגדן ביקורת איזוטופ Alexa 488 לכל 50 µL של תרחיף תאים.
בשלב הבא, ערבבבב בעדינות 100 µL מהתאים באמצעות פיפטינג. לאחר מכן, באמצעות טיפים לטעינת ג'ל, העבר בפיפטה את התאים ואת חומר ההעברה לאחד ממאגרי הנוזלים, חבר צינור לחץ למאגר המלא והדק את החיבור ביד כדי להבטיח איטום תקין. לאחר מכן, כוון את לחץ האוויר בבקר ל-70 PSI כדי לשלוט במהירות שבה התאים נעים דרך המכשיר.
יש לבצע אופטימיזציה של הלחץ עבור השילוב הספציפי של התא והשבב המיקרופלואידי המשמש בכל ניסוי. לאחר שהכל מוכן, הרימו את המכשיר לגובה העיניים וכוונו אותו כך שהנוזל במאגר יהיה גלוי למבט. לאחר מכן, לחצו על שסתום כפתור הלחיצה כדי להפעיל לחץ על המאגן ולהתחיל את זרימת התאים.
עקבו אחר המהירות שבה הנוזל זורם מהמאגר. אם זרימת הנוזל מואטת באופן משמעותי ביחס לקצב הזרימה הראשוני, סביר שההתקן המותקן סתום ויש להחליפו. השקע (shear) המוגבר שנגרם כתוצאה מהחסימה יביא למות תאים ברמה גבוהה מהרגיל.
כאשר מפלס הנוזל נמצא במרחק של כשני מילימטרים מתחתית המאגר, סובב במהירות את הווסת ל-0 PSI כדי להפסיק את הזרימה. חשוב להפסיק את זרימת האוויר לפני שהמאגר יתרוקן, אחרת הדגימה עלולה להידחף החוצה ממאגר האיסוף. לאחר מכן, אסוף את התאים שעובדו ממאגר המוצא והעבר אותם למבחנת מיקרו-צנטריפוגה.
בטמפרטורת החדר, התאים המדורגים ימשיכו לספוג חומר למשך עד 10 דקות. לאחר 10 דקות, יש להעביר את התאים לצלחת עם מצע גידול נוסף או להמשיך להשתמש בתאים בהתאם לצרכים הניסויים. חזור על שלבים אלה כדי לאסוף את כמות התאים המטופלים הדרושה, והחלף את השבבים במידה והם נחסמים, תוך השלכה של המכשירים החסומים עבור כל דגימה עוקבת.
שנו את כיוון הזרימה כדי למזער את השפעות הסתימה. עם סיום איסוף התאים, נתקו בעדינות את המאגרים מהתושבת הראשית על ידי דחיפת זרועות התפסים הצידה. לאחר מכן, הניחו כל חלק המיועד לשימוש חוזר במיכל האחסון המתאים ומלאו אותם ב-70% ethanol טרי.
לבסוף, העבירו את כל השבבים המשומשים למכל נפרד לצורך סילוק נאות. נמדדו יעילות ההחדרה והחיוניות של תאי hela. לאחר סדרת ניסויים, נבחנו שלושה שבבים מיקרופלואידיים שונים בטווח מהירויות של עד 600 millimeters per second.
בדיסות אלו הראו כי מהירויות זרימה מוגברות שיפרו את ההחדרה של דקסטרין בעל משקל מולקולרי של 3 kilodalton המסומן פלואורסצנטית אל תוך התאים בכל אחד מהשבבים שנבדקו. בנוסף, מהירויות מוגברות גרמו גם לירידה של כ-20% בחיוניות התאים במכשירים שנבדקו. שיעור מוות זה של תאים הוא נמוך יחסית, ולעתים קרובות הוא גבוה בהרבה במכשירים שתוכננו באופן שאינו הולם.
ספיגת הדקסטרין המצומד ל-Pacific blue אל אוכלוסיית תאי הביקורת המוצגת משמאל היא תוצאה של קישור פני שטח מוגבל ואפקטים אנדוציטיים. התאים נחשפו לחומר ההעברה למשך אותו פרק זמן שבו נחשפו התאים המטופלים. מימין מוצגת אוכלוסיית תאים חיים שעברו דרך ההתקן המיקרופלואידי בזמן שהיו חשופים לאותו ריכוז של דקסטרין כמו תאי הביקורת.
התאים באזור המוצל נחשבים לכאלו שלא הגיעו ליעדם, והתאים מימין לקו מוגדרים ככאלו שהגיעו ליעדם. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בפחות משעה אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו בדיקות לאחר הניתוח, כדי לענות על שאלות נוספות כגון יעילות ההגעה ותפקוד החומר לאחר פיתוחו.
טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הרפואה הרגנרטיבית לחקור תכנות תאים בתאים ראשוניים של מבוגרים באמצעות הולכה ישירה של חלבונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן ההקמה והתפעול של מערכת הסחיבה העצמית (self squeezing system) עבור היישום הרצוי שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להחדרה של מקרו-מולקולות לתאי מטרה ללא שימוש בווקטור, באמצעות דפורמציה מכנית מהירה. הפרוטוקול מפרט את השימוש במכשיר מיקרו-פלואידי כדי לסייע לתהליך זה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- מיקרופלואידיקה
- טכניקות להחדרה תוך-תאית
רקע
- פירוק מכני מציע גישה חדשנית להחדרת חומרים לתאים.
- שיטה זו יכולה להתמקד בסוגי תאים מאתגרים שקשה להעביר להם טרנספקציה.
- יש לה יישומים פוטנציאליים בטיפול בסרטן ובמניפולציה של תאי מערכת החיסון.
- ציטומטריית זרימה משמשת להערכת יעילות ההחדרה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להחדרה תוך-תאית יעילה של מקרו-מולקולות.
- שיפור ההבנה של טכניקות לתכנות מחדש של תאים.
- הגברת היעילות הטיפולית של תאי מערכת החיסון נגד גידולים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור ועיקור של התקן מיקרופלואידי.
- הכנת תרחיפי תאים וחומרי הובלה.
- הפעלת לחץ על ההתקן המיקרופלואידי כדי להשרות דפורמציה של התאים.
- ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה להערכת הצלחת ההובלה.
תוצאות עיקריות
- הושגה העברה מוצלחת של מקרו-מולקולות לתאי מטרה.
- בדיקת Flow cytometry אישרה ספיגה תאי-פנימית יעילה.
- השיטה הראתה יתרונות על פני טכניקות העברה מסורתיות.
- הודגשו יישומים פוטנציאליים בטיפול בסרטן.
מסקנות
- שיטה מכנית זו להחדרה מהווה חלופה מבטיחה עבור סוגי תאים מאתגרים.
- היא פותחת נתיבים חדשים למחקר במניפולציה תאית ובטיפול.
- נדרשים מחקרים נוספים כדי למטב את הטכניקה עבור יישומים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הספקה תוך-תאית ללא וקטורים נותרת צוואר בקבוק קריטי בפיתוח טיפולי, במיוחד עבור תאי חיסון ראשוניים וסוגי תאים שקשה להחדיר אליהם חומרים (hard-to-transfect). פלטפורמת לחיצה מיקרופלואידית זו מאפשרת הספקה ציטזולית ישירה של מקרו-מולקולות וננו-חומרים ללא שינוי כימי או באפרים מיוחדים, ובכך מפחיתה עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות. על ידי שיפור יעילות ההספקה במערכות מאתגרות, השיטה תומכת בביטחון חיזוי בשלבי גילוי מוקדמים ומקטינה סיכונים במסלולים תרגומיים עבור יישומים של אימונותרפיה ורפואה רגנרטיבית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה תפקודית של היפותזות טיפוליות בתאי חיסון ראשוניים ובמודלים של תכנות מחדש.
- ערך תפעולי: מספק מערכת הדירה נטולת באפר להחדרת פקטורי שעתוק, נוגדנים או חומצות גרעיניות לצורך הערכת מעורבות המטרה.
- ערך ניבוי: תומך בהחלטות לגבי המשך או הפסקת הניסוי (go/no-go) על ידי אישור החדרה תוך-תאית של מולקולות אפקטוריות לפני ביצוע בדיקות תפקודיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות מבוססות ציטומטריה של זרימה (flow-cytometry) של יעילות ההחדרה על פני סוגי תאים וריכוזי חומרים שונים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות באמצעות קצבי גזירה מבוקרים וגיאומטריית המכשיר, הממזערת שונות בסריקות בקיבולת גבוהה (high-throughput).
- מוכנות הבדיקה: מספקת נתוני אחוז החדרה ומדדי חיוניות המאפשרים דירוג של תרכובות או חומרים בתהליכי זיהוי מובילים (lead identification).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין מודולציה של תאי חיסון בקנה מידה של גילוי להערכה פרה-קלינית של יעילות אנטי-גידולית מוגברת.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאשר הובלה ציטוסולית של חלבונים אימונו-מודולטוריים, ובכך מפחית את ההסתמכות על מערכות ביטוי אנדוגניות.
- מערכות רלוונטיות למחלה: תומך בבדיקות בתאי T ראשוניים, תאים דנדריטיים ותאי גזע הרלוונטיים לאימונותרפיה של סרטן ולרפואה רגנרטיבית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשרת בחינת השערות בביולוגיה מוקדמת, יצירת דגימות מוכנות לבדיקה לצורך סריקה, ותיקוף מנגנוני לפני מחקרים in vivo.
- ביולוגיה של גילוי: מקל על תיקוף מטרות על ידי העברת רכיבי CRISPR, siRNAs או נוגדנים כדי לאשש מעורבות של מסלולים בהפעלה חיסונית או בהכרעת גורל התא.
- סריקה: מעביר ספריות של נאנו-חומרים או פפטידים לתאי מערכת החיסון לצורך ספיגה וסריקה פונקציונלית תחת תנאי גזירה סטנדרטיים.
- אנליטיקה: מספק נתונים של יעילות הובלה ואחוזי חיוניות הנגזרים מציטומטריה של זרימה כנקודות קצה כמותיות להשוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מאפשר בדיקות פרה-קליניות של תאי חיסון מהונדסים עם מטענים מועברים להערכת פעילות של הריגת גידולים במודלים של תרביות משותפות.
- שימוש חוזר ארגוני: עיצוב הפלטפורמה מאפשר שימוש חוזר בסוגי תאים ובמטענים שונים באמצעות אופטימיזציה של לחץ ושבב בלבד, מה שתומך בפריסה ניתנת להרחבה בשלבי הגילוי ופיתוח תהליכים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית תוצאות שליליות שגויות בתיקוף של מטרות על ידי השגת הובלה לתאים ראשוניים ולתאים שאינם מתחלקים, שבהם שיטות מבוססות נגיפים או ליפידים נכשלות.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בצימוד של המטען, בבופרים מיוחדים או בייצור נגיפי, ובכך מפשט את זרימת העבודה ומפחית את העלות לכל תנאי.
- ערך אסטרטגי: מגביר את הביטחון במועמדים למודולטורים חיסוניים בשלבים מוקדמים על ידי אישור הובלה תוך-תאית לפני ביצוע מחקרים בבעלי חיים הדורשים משאבים רבים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של ביולוגים התלויים בהובלה, כגון cytokine engagers או טיפולים בגורמי שעתוק, בהתבסס על ריכוזים ציטוסוליים שניתן להשיג.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול במכשירים מיקרופלואידיים, הכנת תרחיפי תאים וויסות לחץ כדי למנוע סתימות או מוות מסיבי עקב כוחות גזירה.
- תלוי בגישה לשבבים מיקרופלואידיים, ויסות לחץ, מערכות מאגרים וציטומטריה של זרימה לקריאת התוצאות; תואם לזרימות עבודה סטנדרטיות במCבטחת ביולוגית.
- מחייב סטנדרטיזציה של ריכוז התאים (1–10 מיליון/mL), סינון מוקדם דרך מסנני 40 µm וזמן הדגרה (≤10 min לאחר ההחדרה) לצורך הדירות בין משתמשים ואתרים שונים.
- דורש אופטימיזציה של הלחץ (למשל 70 PSI) ומהירות הזרימה עבור כל סוג תא ותכנון שבב כדי לאזן בין יעילות ההחדרה לבין החיוניות, כאשר אובדן החיוניות הוא בדרך כלל <20% בתנאים אופטימליים.
- מוגבל על ידי סתימות פוטנציאליות מצברים או פסדתיים, מה שמחייב סינון תאים והחלפה סדירה של השבבים; הביצועים משתנים בהתאם לגודל התא, קשיחות הממברנה והמשקל המולקולרי של המטען.
