ויזואליזציה של תפקודי נשימה מיטוכונדריאלי באמצעות ציטוכרום C מונואמין / succinate dehydrogenase (COX / SDH) תיוג פעמיים Histochemistry

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר הדמיה ישירה של מחסור באנזימי נשימה מיטוכונדריאלים בקטעי רקמות קפואות טריות. זה מושג על ידי איסוף תחילה של קטעי קריוסטט מהאיבר המעניין. השלב השני של ההליך הוא ביצוע כימיה של קוקס היסטו, ואחריה כימיית SDH Histo.

לבסוף, חלקי הרקמות מיובשים, מותקנים והכיסוי מחליק. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות את כמות התפקוד הלקוי של המיטוכונדריה באמצעות כמות הצביעה הכחולה של התאים. Hi.Today אנחנו הולכים לדבר על הטכניקה ההיסטוכימית של Cox SCH עם תיוג כפול.

ובעוד שניתן ליישם שיטה זו לחקר מחלות מיטוכונדריה, היא יכולה גם לספק תובנה לגבי הזדקנות והפרעות הקשורות לגיל. לאחר הסרת המוח מבעל חיים שהוקרב בהתאם להיתר אתי, הקפיאו אותו במהירות על קרח יבש. ניתן לשמור רקמות קפואות במינוס 80 מעלות צלזיוס, עטופות בנייר אלומיניום עד שהן מוכנות לחתך.

הכן את הרקמה להקפאה על ידי הנחת המוח על צ'אק קריוסטט והקפתו בתרכובת הטמעה. הנח במהירות את הצ'אק לתוך הקריוסטט ואסוף חלקים של 14 מיקרון במינוס 21 מעלות צלזיוס. הפשירו את החלקים על מגלשות באמצעות בלוק חימום, ולאחר מכן הניחו למגלשות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך שעה.

הנח את השקופיות בתא מכתים עם רצועות נייר רטובות. מכיוון שזמני התגובה חשובים בבדיקה זו, מומלץ לעבד מקסימום 10 שקופיות לכל ניסוי מתחת למכסה המנוע הכימי. הכן דגירה, מדיום המכיל dab וציטוכרום C ב- PBS ומערבולת.

הוסף במהירות שני מיקרוגרם של CDEs בקר למדיום וערבב היטב על ידי מערבולת. כדי לפרק את כל גרגרי ה-CDEs שעדיין עובדים מתחת למכסה המנוע, מרחו 150 עד 200 מיקרוליטר של מדיום דגירה על כל שקופית באמצעות קצה הפיפטה כדי לפזר באופן שווה על כל החלקים. דגרו על המגלשות למשך 40 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר 40 דקות, הסר את מדיום הדגירה מהשקופיות. שטפו את השקופיות ארבע פעמים ב-PBS למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר שטיפת השקופיות, החזירו אותם לתא מכתים עם רצועות נייר רטובות הפועלות מתחת למכסה מנוע כימי.

הכן את תמיסת ה-NBT ב-PBS תוך הקפדה על הגנה על ה-PMS מפני מערבולת אור, התמיסה מרחה במהירות 150 עד 200 מיקרוליטר של תמיסת NBT על כל שקופית באמצעות קצה הפיפטה כדי לפזר באופן שווה על כל החלקים. דגרו את השקופיות למשך 40 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס לאחר 40 דקות, הסירו עודפי תמיסה מהשקופיות. שטפו את השקופיות ארבע פעמים ב-PBS למשך 10 דקות בכל פעם.

יבש את המגלשות למשך שתי דקות כל אחת בריכוזים הבאים של אתנול. 70%70%95%95%ו-99.5%לבסוף, אפשר 10 דקות בצעד נוסף של 99.5%. הנח שקופיות בקסילן למשך 10 דקות, הרכיב עם LAN והחל פתקי כיסוי.

הניחו למגלשות להתייבש למשך הלילה או לפחות שעה עד שעתיים באזור מאוורר כאן. קטעי מוח מסוג פרא והזדקנות מוקדמת. הר. עכברי DNA Mutator סומנו ברצף לפעילויות COX ו-SDH.

פעילות קוקס רגילה המסומנת על ידי הצביעה החומה הכהה נראית בהיפוקמפוס של עכברים מסוג בר. ליקויים בקוקס שצוינו על ידי הצביעה הכחולה התגלו בהיפוקמפוס מעכברים מוטטורים MT DNA בשבועות 12 ו-46. הייתה ירידה נוספת בפעילות קוקס בגיל 46 שבועות בעכברי מוטציה M-T-D-N-A, מה שמרמז על החמרה נרחבת בתפקוד לקוי של שרשרת הנשימה.

זמני דגירה לא מספקים של 10 ו-25 דקות הביאו לשקיעה מופחתת של תוצר תגובת החום. זמני הדגירה המקוצרים אפשרו את היווצרות התוצר הסופי של הפוראן הכחול במהלך הדגירה של SDH, מה שמרמז באופן מטעה על נוכחות תאים עם מחסור ב-COX מכסה החלקה. השקופיות במהלך הדגירה של COX גרמו גם להיווצרות ושקיעה לא מדויקות של תוצר תגובת ה-DAB.

למרות שניתן לתייג פעילויות קוקס ו-SDH בנפרד כפי שמוצג כאן, התיוג הרציף הוכיח את עצמו כיתרון באיתור תאים עם תפקוד לקוי של המיטוכונדריה. דוגמה לבקרת ספציפיות לפעילויות COX ו-SDH במוח מעכבר מסוג בר מראה תיוג שלילי. אז אל תשכח שעבודה עם הכימיקלים בתווית הכפולה של קוקס SCH היא הפרוטוקול הכימי מסוכן ביותר ואמצעי זהירות כמו לבישת בגדי מעבדה מתאימים ומסכה הפועלת מתחת למכסה המנוע הכימי, וגם סילוק מדיום הדגירה צריכים להיעשות בכל פעם שאתה מבצע את הבדיקה הזו.