Name: תא להתאמה אישי עבור נדידת תאים מדידות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: למד שיטה להתאמה אישית של נדידת תאים בתגובה לסוכנים כימוטקטיים וכימורפולסיביים. פרוטוקול זה מפשט מחקר ריפוי פצעים ומאפשר התאמה לצרכים שונים בביולוגיה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים תוכנית הודעה Creative של אוניברסיטת קלמסון NSF CBET1254609 למתן המימון לפרויקט זה.

1. הפקת לשכת microchannel ליצור מפל ריכוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך חתיכת עובש אקריליק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג חתיכת אקרילי בעובי הרצוי. משתמשים בדרך כלל 1/16 אינץ &#39;בעובי גליונות אקריליק. גיליונות עבים קשים לחתוך היטב דק מאוד סדינים אין את החוזק המכאני הנדרש, מה שגרם להם לשבור או עיוות תוך כדי התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת קובץ CAD עם הצורה הרצויה של היצירה אקריליק לייצר חלל בתוך polydimethylsiloxane (PDMS). התאם את רוחב הערוץ וארך כדי להשיג את השיפוע הרצוי רלוונטי פרוטוקולי ניסוי פרט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה, להשתמש פיסת אקריליק של הממדים הבאים: שני ריבועים (0.254 ס&quot;מ x 0.254 ס&quot;מ) המחוברים באמצעות ערוץ רחב 0.127 ס&quot;מ (0.254 ס&quot;מ) (איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבא את קובץ CAD לתוך המכשיר חיתוך לייזר ולמקם היצירה אקריליק חותך לייזר על פי manuהפרוטוקול של facturer. הערה: לחילופין, 3D-להדפיס את היצירה מעיצוב CAD. היתרון של שיטה זו הוא כי חומרים חלופיים יכולים לשמש עבור העובש; עם זאת, החלטת השחזור יכולים להיות ירידה עם הדפסת 3D לעומת חיתוך ליזר. </li></ol></li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig1.jpg" /> איור 1: תכנון בעזרת מחשב (CAD) ייצוג microchannel הקאמרית. תמונה זו מתארת ​​את ציור CAD של הוסף אקריליק הדרושים ליצירת תא microchannel. 1 א) להציג לראש ציור CAD, 1B) הצד לנוכח CAD ציור עם מידות בסנטימטרים, 1C) נוף לראש CAD ציור עם מידות בסנטימטרים <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; יציקת polydimethylsiloxane (PDMS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסירה לשקול, לערבב 10 חלקים לפי משקל של אלסטומר בסיס מסחרי (למשל Sylgard 184) עם חלק 1, לפי משקל, סוכן מסחרי אלסטומר אשפרה (למשל Sylgard 194). בדרך כלל, לערבב 10 גרם של מאגר אלסטומר עד 1 גרם של סוכן אלסטומר אשפרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים לשלב את הבסיס סוכן ריפוי עם micropipette למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת פעמון ואקום ומניחים הסירה לשקול עם PDMS בריק במשך 30 דקות כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את הוואקום ולהסיר את הסירה לשקול. יוצקים את PDMS על גבי מחוץ לחתוך אקריליק בצלחת פטרי קטנה. ודא כי PDMS מכסה לחלוטין את הכנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר PDMS כדי לרפא לילה (לפחות 18 שעות) בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת הכנס מן PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לרפא את PDMS, להסיר את המכסה על ידי חיתוך PDMS בזהירות סביב חתיכת אקרילי עם אזמל. </li></ol&gt; </li></ol> 2. ציפוי התאים בתא microchannel <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיקור לתא עבור תאי ציפוי. הערה: בעוד PDMS ניתן לעקר באמצעות אתילן אוקסיד או טכניקות אחרות, טיפול UV מהיר הוא מהיר, זול, ומספיק מחקרי תרבית תאים. משך טיפול UV הקצר לא לפגוע שלמות מבנה או מכאני של יצירת PDMS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון תרבית תאים סטנדרטי, מכסה לחלוטין את החדר עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת פטרי ברדס זרימה למינרית עם המכסים מעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סתום את מכסה המנוע ולהדליק את האור האולטרה סגול. לחשוף לאור UV למשך 1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את מכסה המנוע זרימה למינרית ולחכות 15 דקות כדי לחדש את זרימת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף לתאי פעמיים עם בופר פוספט סטרילית (PBS). השתמש 1 מ&quot;ל של PBS עבור כל שטיפה. הסר PBS ולאפשר תאים לייבוש למשך הלילה עם המכסים מעל. הערה: לחילופין, במקוםשל שימוש במנדף זרימה למינרית, להשתמש בתיבת קאמרית UV לעיקור אם אחד זמין. להפוך את תיבת UV על ידי הצבת מקור אור UV בחלק האחורי של קופסת קרטון מרופדת בנייר אלומיניום. רדיד האלומיניום משקף את האור כדי לאפשר גם תאורה של המדגם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי ציפוי ב קאמרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות trypan כחול ו hemocytometer. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של השעית תא 400 μL של 0.4% Trypan כחולים ומערבבים בעדינות. החל 100 μL של פתרון זה hemocytometer על ידי מילוי שני התאים בעדינות מתחת coverslip הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ עם מטרה 10X להתמקד הרשת על hemocytometer. השתמשתי מונה נקודות יד לספור את התאים בלא הכתם חיים בתוך קבוצה אחת של 16 ריבועים על hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים בכל 4 סטים של 16 ריבועים. קח את ספירת תאי הממוצע מן 4 סטים של 16 ריבועים ולהתרבות על ידי 5x10 4. המספר הסופי זהו number של תאים / מ&quot;ל ​​ההשעיה תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2,500 תאים היטב אחד בכל תא. זה מתרגם ל צפיפות התאים ליד ומחוברות של ~ 30,000 / 2 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים לשבת בתא במשך 60 דקות לפני הוספת מדיה (הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco, 10% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין, סטרפטומיצין). </li></ol></li></ol> 3. Dextran ספוג בלוקים Agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת גוש agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 3% agarose לתוך תבנית מודפס 3D (2 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose כדי לחזק בתא ואקום למשך 30 דקות כדי להסיר בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבלוק agarose מן התבנית. הערה: לחילופין, יוצקים 3% agarose לתוך צלחת קטנה פטרי בעובי של 2 מ&quot;מ. חותכים בלוק 2 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ באמצעות אזמל או כלי חיתוך אחרים. זה לא מדויק כמו מערכת העובש אבל זה יכול להיות קצת יותר קל לעשות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגמרי submergדואר לחסום agarose בתמיסה של הריכוז הרצוי של גורם chemotactic. כדי להעריך את היווצרות מפל ריכוזים, שטוף את התא הראשון עם dextran ניאון. הריכוז ועל משקל מולקולרי של dextran צריך להתאים לזה של גורם או סמים מסיסים של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הלילה לחסום agarose. </li></ol> 4. זמן לשגות של דיפוזיה Dextran להעריך את מפל ריכוזי הפקטור המסיס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גוש agarose ספוג dextran בתוך באר ריבוע קטן של החדר microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תא microchannel במערכת הדמיה תא או להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי אחר עם יכולת זמן לשגות. להתחיל את הזמן לשגות פי הוראות היצרן. הערה: התוצאות המוצגות נלקחים עם מסנן GFP, 50% אור, 4/10 pH, והגדלה 4X. </li></ol> 5. זמן לשגות של גדילת התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים בתא microchannel בקצה אחד שלתָא. הנה, להשתמש 3T3 פיברובלסטים. להוסיף 2,500 תאים היטב אחד בבית הבליעה microchannel. ספירת תאים כמתואר 2.2.1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים לשבת בתא במשך 60 דקות לפני הוספת מדיה (הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco, 10% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין, סטרפטומיצין). שמור על תא microchannel עם תאים מצופה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. נדידת תאי הדרך ניתן לצפות בערוץ עם מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת סמן או להשתמש פגם מיקרוסקופי בתא כסמן כדי לשמש נקודת זינוק לכמת את המרחק המהלכים מול התא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור שיפוע ידי הצבת ג&#39;ל agarose (8 מ&quot;מ 3 בלוק) המכיל את גורם הגדילה מרוכז,-attractant הכימותרפיה, סמים, או גורם אחר שנבדק (כאן, 40% FBS נמצא בשימוש כדוגמה) בקצה אחד של microchannel תָא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח זמן לשגות תמונות של חזית התא נעה. הנה, התוצאות מראות תמונות של התא הלוך ושובNT כי נלקחו כל 12 שעות באמצעות מערכת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתמונות של חזית התא לכמת שיעור צמיחת תאים. לחשב את שיעור הצמיחה באמצעות הראשון פונקצית polyfit MATLAB (roipoly) כדי ליצור מסכה מצולעים שהוגדרה על ידי מול התא, קירות הערוץ, ואת סמן הפנייה. ממד המסכה הזאת להניב מרחק הגירה של החזית שממנו המהירות מול התא ממוצעת מחושבת. מחקרים אחרים לא מנוצלים בשיטה דומה 8. הערה: השווה את הקצה מול צמיחת תאים על כל מסגרת לריכוז של הגורם המסיס באותו מרחק. השיפוע גורם ריכוז המסיס מחושב באמצעות קירוב מודל דיפוזיה 1D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות הניאון של תאים באמצעות מכתים Phalloidin ו DAPI. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים לפני צביעה עם Phalloidin. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> paraformaldehyde 4% חם ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספיק 4% paraformaldehyde לכסות תאים. שמור את התאים בparaformaldehyde למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעמים עם PBS במשך 15 דקות בכל פעם. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS מתאי ולהוסיף פתרון מספיק permeabilizing (0.1% Triton X-100 ב PBS) כדי לכסות תאים. השאר פתרון במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמים עם PBS במשך 5 דקות בכל פעם. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS מתאי ולהוסיף פתרון לחסימת (1% אלבומין בסרום שור ב PBS) במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור פתרון חסימה ולשטוף 2 פעמים עם PBS במשך 5 דקות בכל פעם. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודה זו, להגן על תאים מפני אור עם רדיד אלומיניום כאשר לא בשימוש. הסר PBS מתאי ולהוסיף Phalloidin 488 בדילול 1:50 ב PBS עבור H 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 פעמים PBS במשך 5 דקות לכל לשטוף. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים. ואז להסיר PBS מתאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) מדולל 1: 1,000 ב PBS לתאים במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר DAPI ולשטוף תאים פעמים עם PBS במשך 5 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לשטוף האחרון ולהוסיף מספיק PBS לכסות תאים. תאים יכולים להיות צילמו עכשיו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+fabricated+in+poly+%28dimethylsiloxane%29+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li>
<li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dynamic+temporal+and+spatial+concentration+gradients+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices.</a> Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).</li>
<li>Darby, I., Hewitson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Differentiation+in+Wound+Healing+and+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis.</a> Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).</li>
<li>Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+study+fibroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskel%22%5BJournal%5D)">A new approach to study fibroblast migration.</a> Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).</li>
<li>Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+Factors%2C+Matrices%2C+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324, 1673-1677 (2009).</li>
<li>Zengel, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21592329">µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies.</a> BMC Cell Biol. , (2011).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576901">Boyden Chamber Assay.</a> Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).</li>
<li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+revised%3A+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models%5BTitle%5D)+AND+%22JCB%22%5BJournal%5D)">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models.</a> JCB. 203 (4), 691-709 (2013).</li>
<li>Saadi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+concentration+gradients+in+2D+and+3D+environments+using+a+microfluidic+ladder+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber.</a> Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).</li>
<li>Cammer, M., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+Responses+by+Macrophages+to+a+Directional+Source+of+a+Cytokine+Delivered+by+a+Micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette.</a> Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).</li>
<li>Wells, C. M., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+migration+using+the+Dunn+chemotaxis+chamber+and+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+migration+chip+for+chemotaxis-based+microfluidic+selection+of+heterogeneous+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Wright, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+open+microfluidic+devices+for+chemotaxis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies.</a> Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).</li>
<li>Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+with+arbitrary+shapes+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+devices%3A+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), 013412(2011).</li>
<li>Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chambers+for+cell+migration+and+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Tech%3A+Rev+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research.</a> Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).</li>
<li>Tang, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTang%2C+SK+%22Basic+microfluidic+and+soft+lithographic+techniques.+Optofluidics%3A+Fundamentals%2C+Devices+and+Applications%22">Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications</a>. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. , McGraw-Hill, 2010. (2010).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+multicompartment+device+for+neuroscience+research%29%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microfluidic multicompartment device for neuroscience research).</a> Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).</li>
<li>Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Device+for+Studying+Multiple+Distinct+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains.</a> JoVE. (69), (2012).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תא microchannel שלנו עשוי לשמש מספר רב של מטרות, כולל קביעת שיעור נדידת תאים בתגובה גורמי גדילה chemoattractants ומדידת קצב הדיפוזיה של תרופה ממטריקס פולימר. אפשר לנצל תא microchannel שלנו לגדל תאים ומקום chemoattractant בקצה אחד של החדר. התאים גדלים בתגובה chemoattractant, ואת נדידת תאים ניתן לכמת על ידי לקיחת תמונות זמן לשגות כי ניתן לנתח על מנת לקבוע את שיעור נדידת תאים. נציג תוצאות של שיטה זו מוצגות באיור 3, כאשר שיעור הצמיחה היה נחוש בדעתו להיות 13.4 מיקרומטר...

על מנת שתהליכים חיוניים כגון ריפוי פצעים, תגובות חיסוניות והתפתחות עוברית יתרחשו, חייבת להתרחש נדידת תאים. נדידת תאים כוללת אינטראקציה בין תאים לתאים שכנים, המטריצה החוץ-תאית ורמזים כימיים מסיסים (מושכים או דוחים). כדוגמה, בתהליך ריפוי פצעים, פיברובלסטים ממלאים תפקיד אינטגרלי בפיברוגנזה ובהתכווצות הפצע, כאשר התאים מגויסים לאתר הפציעה כדי לסנתז קולגן על מנת ליצור את המטריצה החוץ-תאית3. נחקרו מנגנונים רבים מאחורי נדידת פיברובלסטים לאתר פצע, והם כוללים גורמים מכניים, פיזיים, חשמליים וכימו-טקטיים שונים4. פיברובלסטים מגיבים טוב במיוחד לשיפועי ריכוז שונים של גורמי גדילה. גורמי גדילה שונים אלה פועלים יחד כדי לייעל את התחדשות הרקמות5. תוך התבוננות בתגובה הכימוטקטית של פיברובלסטים לריכוזי גורמי גדילה, ניתן לחקור את דפוס הנדידה הכיוונית של פיברובלסטים וכיצד הם מכוונים את עצמם סביב מכשולים פיזיים על מנת להגיע ליעדם. לכן, מטרות מחקר זה היו קודם כל לפתח מערכת שבה ניתן לעקוב אחר צמיחת פיברובלסטים בהנחיית מחסומים פיזיים ושנית למדל את צמיחת הפיברובלסטים כשהם מנווטים במערכת.
נכון לעכשיו, בדיקת תא בוידן היא המערכת הנפוצה ביותר למדידת נדידת תאים6. תא בוידן מורכב מצלחת רב-בארית בת שני תאים, כאשר כל באר עשויה להכיל מדיום עם או בלי כימיקום7. קרום פילטר מספק ממשק נקבובי בין שני התאים בכל באר; זה יוצר מחסום כך שתאים לא יכולים לעבור אלא אם כן זה על ידי הגירה פעילה. בדרך כלל, עבור תא בוידן מתווסף חומר משיכה כימי לתא התחתון, והמערכת מורשית להתאזן ליצירת שיפוע בין הבאר העליונה והתחתונה4. בעיה אחת עם מבחן תא בוידן היא ששיפועים תלולים נוצרים בסופו של דבר לאורך ציר יחיד בניצב לפני השטח של הממברנה. זה גורם להבדל בריכוז הכימותרפיה בין הבארות העליונות והתחתונות להיות נמוך ממה שהיה צפוי בתחילה. בשל אילוץ זה, בדיקת תא בוידן מקשה על מתאם בין תגובות תאים ספציפיות עם מאפייני שיפוע מסוימים, כגון השיפוע והפרש הריכוז. ללא מדידות אלה, קשה לחקור שילוב אותות מרובי שיפועים.
כדי לטפל בחלק מהאילוצים של מבחן תא בוידן, פותחו מבחני מיקרופלואידיקה ליצירת שיפועי ריכוז הניתנים להתאמה אישית1. שיטות סטנדרטיות ליצירת מערכות מיקרופלואידיות דורשות חדרים נקיים לטכניקות ליטוגרפיות. טכניקות אלו יכולות להיות קשות ללמידה, במיוחד במסגרת כיתה סטנדרטית. לפיכך, תכננו מערכת תאים למדידת נדידת תאים שניתן לבצע ללא שימוש בחדר נקי. באמצעות המערכת שלנו, ניתן לכוונן את בארות הבדיקה לגודל מועדף, ולייצר שיפוע ריכוז ליניארי של שיפוע מותאם אישית. זה מאפשר מדידה מדויקת של כימוטקסיס מתנועה אקראית. העיצוב הוא מערכת זולה וקלה לשימוש למידול צמיחת תאים בתגובה לגירויים כימיים שונים.

<table><tbody><tr><td>ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184</td> ערכת פולי <td>761036 סיגמא-אולדריץ</td><td></td>' <td>(דימתילסילוקסן) ערכת 2 חלקים כולל בסיס אלסטומר סיליקון וחומר ריפוי אלסטומר סיליקון</td></tr><tr><td>יריעות אקריליק</td><td>ארה"ב פלסטיק</td><td>44200</td><td></td></tr><tr><td>כלי פטרי חד פעמיים&nbsp;</td><td>בז&nbsp;</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצאין איזותיוציאנט וכו'; dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20s-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Type I, Low EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's</td><td>Medium Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>רכיבי מדיה תאית</td></tr><tr><td>בקר עוברי סריום</td><td>פישר מדעי</td><td>16000036</td><td>רכיבי מדיה תאית</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>פישר סיינטיפיק סיינטיפיק</td><td></td><td>15140148 רכיבי מדיה תאית</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP24384</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Cell Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AME3300</td><td>מכשיר המשמש לצילום תמונות זמן-lapse</td></tr><tr><td>Versa</td><td>Laser Universal Laser Systems, Inc.&nbsp;</td><td>מספר דגם: VLS2.30</td><td>חותך לייזר המשמש לחיתוך פלסטיק</td></tr></tbody></table>

תא להתאמה אישי עבור נדידת תאים מדידות

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

נדידת תאים היא חלק חיוני של מערכת חיסונית, צמיחה, וריפוי פצעים. נדידת תאים היא תהליך מורכב הכרוך אינטראקציות בין תאים, תאי מטריקס, וגורמים כימיים מסיסים ובלתי מסיס (למשל, chemoattractants). שיטות תקן למדידת ההגירה של תאים, כגון assay הקאמרית בוידן, עבודה על ידי ספירת תאים משני צדי מחיצה. טכניקות אלו קלות לשימוש; עם זאת, הם מציעים שינוי גיאומטרי קטן עבור יישומים שונים. לעומת זאת, מכשירי microfluidic יכולים לשמש כדי לצפות נדידת תאים עם מילויי ריכוז להתאמה אישיים של גורמי מסיסי 1, 2. עם זאת, שיטות להכנת מבחנים מבוססים מיקרופלואידיקה יכולות להיות קשות ללמוד. כאן אנו מתארים שיטה קלה ליצירת תאי תרבית תאים למדוד נדידת תאים בתגובה הדרגתית ריכוז כימי. המייל הסלולרי שלנושיטה קאמרית הגירה יכולה ליצור הדרגתי ריכוז ליניארי שונה על מנת ללמוד נדידת תאים עבור מגוון רחב של יישומים. שיטה זו היא יחסית קלה לשימוש והיא מבוצעת בדרך כלל על ידי סטודנטים לתואר ראשון. תא microchannel נוצר על ידי צבת הוסף אקריליק בצורה של חדר microchannel הסופי היטב לתוך צלחת פטרי. אחרי זה, פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) נמזג על גבי להכניס את. את PDMS הורש להקשיח ואז להכניס הוסר. זה אפשר ליצירת בארות בכל צורה או גודל רצוי. תאים עשויים להיות שיצטרפו בעתיד תא microchannel, וסוכני מסיסים ניתן להוסיף אחת הבארות על ידי השריית גוש agarose ב הסוכן הרצוי. בלוק agarose מתווסף באחת הבארות, ואת הזמן לשגות תמונות שניתן לנקוט של חדר microchannel על מנת לכמת נדידת תאים. וריאציות שיטה זו יכולה להיעשות עבור יישום נתון, מה שהופך גדולות בשיטה זוhly להתאמה אישית.

איור 2 מציג את התנועה של חזית התא מעבר לתעלה בתגובת שיפוע של בסרום שור העובר להציב בקצה השני של הערוץ מהמקום שבו התאים מצופים. חזית התא מוצגת 48 שעות (איור 2 א), 72 שעות (איור 2 ב), 96 שעות (איור 2 ג), ו -120 שעות ציפוי פוסט (איור 2 ד). התנועה של חזית התא הייתה במעקב עם הזמן לשגות תמונות אלה, ושיעור הגירת מרחק וצמיחה חושבו על ידי פונקצית polyfit MATLAB. כלומר, התוצ...

פרוטוקול זה מפרט שיטה להתאמה אישית למדוד נדידת תאים בתגובת chemoattractants שעשוי לשמש גם כדי לקבוע את קצב הדיפוזיה של תרופה מתוך פולימר מטריקס.

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לספק דרך פשוטה לחקר ההשפעות של חומרים כימותקטיים (משכי תאים) וחומרים כימורפולסיביים (דוחים תאים) על נדידת תאים. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחומי האינטראקציה התאית, כגון השפעותיהם של גורמי גדילה שונים על ריפוי פצעים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להתאימה בקלות ליישומים שונים, והיא פשוטה לשימוש עבור חוקרים בכל רמות המיומנות.את הפרוצדורה ידגימו אניקה צ'ודרי, סטודנטית לתואר ראשון, וטיילר הארווי, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. ראשית, צרו קובץ CAD עם הצורה הרצויה של המיקרו-ערוץ. התאימו את רוחב ואורך הערוץ כדי להשיג את המדרג (gradient) הנדרש.כאן, ריבועים של 2.254 centimeter מחוברים על ידי תעלה ברוחב 0.127 centimeter. לאחר מכן, השג חתיכת אקריליק בעובי הרצוי כדי ליצור את העומק המתאים של המיקרו-תעלה. רוחב דף אקריליק של כ-one sixteenth of an inch הוא אידיאלי, שכן דפים עבים יותר קשים לחיתוך ודפים דקים מאוד עלולים להישבר או להתעוות במהלך התהליך.ייבאו את קובץ ה-CAD למכשיר חיתוך בלייזר והניחו את פיסת האקריליק על משטח החיתוך. לאחר מכן, גזרו את התא, בהתאם לפרוטוקול היצרן. הניחו את גזירת האקריליק הטריה בצורת משקולת בתוך צלחת פטרי קטנה וכסו אותה עד למועד השימוש.בתוך כלי שקילה, הוסיפו עשרה חלקים של בסיס אלסטומר עם חלק אחד של חומר מעבט, וערבבו באמצעות מיקרופיפטה במשך חמש דקות. העבירו את התערובת לתא ואקום, ובצעו שאיבה למשך 30 דקות כדי להסיר בועות אוויר כלואות מה-PDMS. בסיום, כבו את הוואקום והוציאו את כלי השקילה.שפכו את ה-PDMS לאחר ניקוי הגזים מעל גזירה מאקריליק בצורת משקולת בתוך צלחת פטרי קטנה. ודאו שה-PDMS מכסה את הרכיב המוכנס לחלוטין. הניחו ל-PDMS להתקשח למשך 18 שעות לפחות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן חתכו בזהירות את ה-PDMS מסביב לחלק האקרילי באמצעות סכין נישטר והסִירו את הרכיב המוכנס.בתוך מabilis תרביות סטנדרטי, הנח את תא המיקרו-ערוצים בתוך צלחת פטרי, כאשר הצד עם התכונות פונה כלפי מעלה, וכסה אותו לחלוטין ב-70% ethanol. לאחר מכן, סגור את המabilis והדלק את נורת ה-UV. חשוף את התא לאור UV למשך שעה עד שעתיים.לאחר החשיפה, פתחו את מapay-laminar flow hood והמתינו 15 דקות עד להחזרת הזרימה במכסה. לאחר מכן, הסירו את ה-70% ethanol ושטפו את התאים פעמיים עם PBS סטרילי. השתמשו ב-1 ml PBS לכל שטיפה.לאחר השטיפה האחרונה, הסירו את ה-PBS והניחו לתאים להתייבש למשך לילה כאשר המכסים פתוחים. קצרו את סוג התאים לבדיקה והוסיפו 100 microliters של תרחיף התאים ל-400 microliters של trypan blue בריכוז 0.4% וערבבו בעדינות. העבירו 100 microliters של תמיסה זו להמוציטומטר על ידי מילוי עדין של שני התאים תחת כיסוי הזכוכית.השתמשו במיקרוסקופ עם עדשה אובייקטיבית של 10x כדי למקד את המבט על הסריג של ההמוציטומטר. לאחר מכן, השתמשו במונה ידני כדי לספור את התאים החיים והבלתי-נצמדים בתוך כל ארבעת המجموعות של 16 ריבועים בהמוציטומטר. חלקו את מספר התאים הכולל ב-4 והכפילו מספר זה ב-50,000 כדי לקבל את מספר התאים למיליליטר של תרחיף התאים.בהתבסס על חישוב זה, הוסיפו 2500 תאים ו-100 microliters של מצע לתוך באר אחת בכל תא. הניחו לתאים להישאר בתא למשך 60 דקות ולאחר מכן הוסיפו מצע נוסף. כדי להתחיל, הוסיפו agarose למים וחממו את התמיסה במיקרוגל למשך דקה אחת, או עד שה-agarose נמס לחלוטין והתמיסה שקופה.המתינו שהתמיסה תתקרר במשך 15 עד 30 שניות לפני המזיגתה לפטריה. כדי להסיר בועות, הכניסו את הפטריה לתא ואקום והמתינו שהאגרוז יתמצק תחת ואקום למשך 30 דקות. לאחר ההתמצקות, חתכו מהפטריה בעזרת סכין מנתחים קוביית אגרוז בגודל 2 מילימטר על 2 מילימטר על 2 מילימטר.טבול את הקובייה באופן מלא בתמיסה המכילה את הריכוז הרצוי של הגורם הכמוטקטי, והשרה את בלוק האגרוז למשך לילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הנח את בלוק האגרוז המכיל את הגורם הכמוטקטי בקצה הרחוק של תא המיקרו-ערוץ. השתמש בסימון, כגון חרוזי פוליסטירן מיקרוסקופיים או פגם מיקרוסקופי בתא.כדי לזהות את מיקום ההתחלה היחסי של התאים. השתמשו בתוכנת הדימיון כדי לצלם תמונות בשיטת time-lapse של חזית התאים הנעה מדי שעה במשך 12 שעות. סדרת התמונות המוצגת כאן מתעדת את תנועת חזית תאים לאורך התעלה בתגובה למדרג ריכוזים של fetal bovine serum שהוצב בקצה opposite של התעלה.מרחק הנדידה נמדד על בסיס המרחק של חזית הצמיחה מפגם מיקרוסקופי במכשיר. ממדידות אלו נמצא כי מהירות חזית התאים הממוצעת היא 13.4 micrometers per hour. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בארבע שעות, בתוספת זמן המתנה של 18 שעות לאשפרת ה-PDMS, ו-12 שעות נוספות עבור דימוי נשף הזמן (time lapse imaging).לאחר פיתחו, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים ברמות מיומנות שונות, כולל סטודנטים לתואר ראשון עם ניסיון מעבדתי מועט, לחקור בקלות ריפוי פצעים ונדידת תאים in vitro. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להוציא בזהירות את התבנית האקרילית מתבנית ה-PDMS כדי להבטיח ייצור מוצלח של תא מיקרו-ערוץ. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לייצר תא מיקרו-ערוץ פשוט למחקר נדידת תאים בתגובה לרמזים כימיים שונים.בעקבות הליך זה, ניתן ללמוד רמזים אחרים כגון מספר מדרגי ריכוז כימיים מסיסים, סובסטרטים, גזירה של נוזלים ושדות חשמליים, במטרה לחקור את השפעתם על הגירה של תאים. זכרו כי עבודה עם חותכי לייזר עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה, כגון השתלמות מתאימה ושימוש בציוד מגן אישי.

a-customizable-chamber-for-measuring-cell-migration

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מכשיר microfluidic מידור לחקר נדידת תאי גזע סרטני מתואר. פלטפורמה חדשנית זו יוצרת microenvironment סלולרי קיימא ומאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של תנועת תאים חייה. מאוד ניעתי תאים סרטניים מבודדים ללמוד מנגנונים מולקולריים של חדירה אגרסיבית, שעלולים לגרום לטיפולים יעילים יותר בעתיד.

הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה

Assay מסלול תנועתיות phagokinetic הוא שיטה המשמשת כדי להעריך את התנועה של תאים. באופן ספציפי, assay מודד chemokinesis (תנועתיות תאים האקראיות) לאורך הזמן באופן כמותי. Assay מנצל את יכולתם של תאים ליצור מסלול למדידת התנועה שלהם על coverslips colloidal מצופה זהב.

הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

שיטה להרכבה של שיפועים ודבק מסיסים בתא מיקרוסקופי למחקרי נדידת תאי חיים מתוארת. הסביבה המהונדסת משלבת משטחי antifouling ופסי דבק עם שיפועי פתרון ולכן מאפשרת אחת כדי לקבוע את החשיבות היחסית של רמזי הדרכה.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

שיטה כמותית ללימודי הגירה ספונטנית של תאים בmicroenvironment מרותק חד ממדי מתוארת. שיטה זו מנצלת את ערוצי microfabricated והוא יכול לשמש כדי לחקור הגירה של מספר הגדול של תאים בתנאים שונים בניסויים אחת.

חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated

חקירה של נדידה מוקדמת של תאי אנדותל (EEC) חשובה להבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות מסוימות וכדי לזהות אסטרטגיות חדשות להתערבות טיפולית. הפרוטוקול הבא מתאר טכניקות להערכת נדידת תאים שהותאמו לחקר EEC.

הערכה של נדידת תאי האנדותל לאחר חשיפה לכימיקלים רעילים

המחקר מדווח על שתי שיטות שונות לניתוח של הפלישה תא והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן, במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ ריפוי פצע וזמינותו. הפרוטוקולים עבור שני ניסויים אלה מתוארים, היתרונות והחסרונות שלהם מושווים.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

פרוטוקול זה מתאר של assay הפוכה הפלישה אנכי יכול לשמש כדי לכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים בתוך תפאורה תלת מימדי תוך שמירה על microenvironment תא. Assay הזה מתאים תאים נדירים ו/או רגישים.

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משולבת חוקרים נדידת תאים סרטן ופלישה על פלטפורמה אחת בזמן אמת, מתן אפשרות היעילה הדירים בקלות ללמוד ניידות תא ו מורפולוגיה.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

פרוטוקול להערכה כמותית של נדידת תאים תלת מימדיים בתוך ולתוך הממשק של הידרוג'לים גרגירים מוצג כאן.

כימות נדידת תאים תלת מימדית בתוך ובתוך ביו-חומרים הידרוג'ל גרגירים

היכולת למדוד את הקינטיקה של שחרור שלפוחית ​​יכול לעזור לספק תובנה כמה יסודות עצבית. כאן השתמשנו בזמן אמת הדמיה של שלפוחית ​​שכותרתו עם צבע אדום ניאון FM 4-64 למדוד את קצב שחרור שלפוחית ​​presynaptic בתרבויות נוירונים בהיפוקמפוס.

מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

למד שיטה להתאמה אישית של נדידת תאים בתגובה לסוכנים כימוטקטיים וכימורפולסיביים. פרוטוקול זה מפשט מחקר ריפוי פצעים ומאפשר התאמה לצרכים שונים בביולוגיה תאית.

תא להתאמה אישי עבור נדידת תאים מדידות

גלה סרטונים נוספים