תא להתאמה אישי עבור נדידת תאים מדידות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק דרך פשוטה לחקור את ההשפעות של חומרים כימוטקטיים וכימותרפיים על נדידת תאים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האינטראקציה התאית כגון ההשפעות של גורמי גדילה שונים על ריפוי פצעים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ניתנת להתאמה אישית בקלות עבור יישומים שונים ופשוטה לשימוש עבור חוקרים בכל רמות המיומנות.

ידגימו את ההליך אניקה צ'אודהורי, סטודנטית לתואר ראשון, וטיילר הארווי, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, צור קובץ CAD עם הצורה הרצויה של המיקרו-ערוץ. התאימו את הרוחב והאורך של הערוץ להשגת מעבר הצבע הנדרש.

כאן, ריבועים של 2.254 סנטימטר מחוברים על ידי תעלה ברוחב 0.127 סנטימטר. לאחר מכן, השג חתיכת אקריליק בעובי הרצוי על מנת ליצור את העומק הנכון של המיקרו-ערוץ. רוחב יריעות אקריליות של כשישה עשר אינץ' הוא אידיאלי מכיוון שקשה לחתוך יריעות עבות יותר ויריעות דקות מאוד עלולות להישבר או להתעוות במהלך התהליך.

ייבא את קובץ ה-CAD למנגנון חיתוך לייזר והנח את החלק האקרילי על משטח החיתוך. לאחר מכן גזרו את החדר, על פי פרוטוקול היצרן. מניחים את גזרת האקריליק הטרייה בצורת משקולת בצלחת פטרי קטנה ומכסים אותה עד שיהיה צורך.

בסירת שקילה מוסיפים עשרה חלקים של בסיס אלסטומר, עם חלק אחד של חומר הריפוי ומערבבים בעזרת מיקרו פיפטה למשך חמש דקות. העבירו את התערובת לתא ואקום, ומשכו ואקום למשך 30 דקות כדי להסיר בועות אוויר כלואות מה-PDMS. בסיום, כבה את הוואקום והסר את סירת השקילה.

יוצקים את ה- PDMS הנטול גז על גבי גזרת אקריליק בצורת משקולת בצלחת פטרי קטנה. ודא שה-PDMS מכסה לחלוטין את התוספת. אפשר ל-PDMS להתרפא לפחות 18 שעות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן חתוך בזהירות את ה-PDMS סביב החלק האקרילי בעזרת אזמל והסר את התוספת.

בארון תרבית תאים סטנדרטי, הנח את תא המיקרו-ערוץ בצלחת פטרי, הצד כלפי מעלה וכסה אותו לחלוטין באתנול 70%. לאחר מכן סגרו את מכסה המנוע והדליקו את נורת ה-UV. חשוף את החדר לאור UV למשך שעה עד שעתיים.

לאחר החשיפה, פתח את מכסה הזרימה הלמינרי והמתן 15 דקות עד שמכסה המנוע יחזור לזרימה. לאחר מכן, הסר את האתנול 70% ושטוף את התאים פעמיים עם PBS סטרילי. השתמש ב- PBS מיליליטר אחד לכל שטיפה.

לאחר הכביסה הסופית, הסר את ה-PBS ואפשר לתאים להתייבש למשך הלילה כשהמכסים כבויים. קצרו את סוג התא לבדיקה והוסיפו 100 מיקרוליטר מתרחיף התא ל-400 מיקרוליטר של 0.4% טריפן כחול וערבבו בעדינות. מרחו 100 מיקרוליטר של תמיסה זו על ההמוציטומטר על ידי מילוי עדין של שני התאים מתחת להחלקת כיסוי הזכוכית.

השתמש במיקרוסקופ עם מטרה של פי 10 כדי להתמקד ברשת על ההמוציטומטר. לאחר מכן השתמש במונה ספירה ידני כדי לספור את התאים החיים והלא מתמשכים בכל ארבע הקבוצות של 16 הריבועים על ההמוציטומטר. חלקו את מספר התאים הכולל בארבע והכפילו את המספר הזה ב-50,000 כדי לקבל את מספר התאים למיליליטר של תרחיף תאים.

על סמך חישוב זה, הוסף 2500 תאים ו -100 מיקרוליטר מדיה לבאר אחת בכל תא. הניחו לתאים לשבת בתא למשך 60 דקות ולאחר מכן הוסיפו מדיה נוספת. כדי להתחיל, מוסיפים אגרוז למים ומחממים את התמיסה במיקרוגל למשך דקה, או עד שהאגרוז נמס לחלוטין והתמיסה צלולה.

הניחו לתמיסה להתקרר במשך 15 עד 30 שניות לפני שמוזגים לצלחת פטרי. כדי להסיר בועות, הכניסו את צלחת הפטרי לתא ואקום והניחו לאגרוז להתמצק בוואקום למשך 30 דקות. לאחר ההתמצקות, חותכים קוביית אגרוז של שני מילימטר על שני מילימטר עם אזמל מצלחת הפטרי.

טבלו לחלוטין את הקובייה בתמיסה המכילה את הריכוז הרצוי של גורם הטקטיקה הכימותרפית, והשרו את גוש האגרוז למשך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הניחו את בלוק האגרוז המכיל את גורם טקטיקת הכימותרפיה בקצה הרחוק של תא המיקרו-ערוץ. השתמש בסמן, כגון מיקרו-חרוזי פוליסטירן או פגם מיקרוסקופי בתא.

כדי לזהות את מיקום ההתחלה היחסי של התאים. השתמש בתוכנת ההדמיה כדי לצלם תמונות של חזית התא הנע מדי שעה למשך 12 שעות. סדרת התמונות המוצגת כאן מתעדת את תנועת חזית התא על פני התעלה בתגובה לשיפוע של נסיוב בקר עוברי הממוקם בקצה הנגדי של התעלה.

מרחק הנדידה נמדד על סמך המרחק של חזית הגידול מפגם מיקרוסקופי במכשיר. ממדידות אלה, המהירות הקדמית הממוצעת של התא נמצאה כ-13.4 מיקרומטר לשעה. לאחר השליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע שעות, עם 18 שעות נוספות של זמן המתנה לריפוי PDMS, ו-12 שעות נוספות להדמיית זמן-lapse.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים ברמות מיומנות שונות, כולל סטודנטים לתואר ראשון עם ניסיון מעבדתי מועט לחקור בקלות ריפוי פצעים ונדידת תאים במבחנה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להסיר בזהירות את התוספת האקרילית מתבנית ה-PDMS על מנת להבטיח ייצור מוצלח של תא מיקרו-ערוץ. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לייצר תא מיקרו-ערוצים פשוט לחקר נדידת תאים בתגובה לרמזים כימיים שונים.

בעקבות הליך זה, ניתן לחקור רמזים אחרים כגון שיפועים כימיים מסיסים מרובים, מצעים, שדות נוזלים וחשמליים על מנת לחקור את ההשפעה שיש להם על נדידת התאים. אל תשכח שעבודה עם חותכי לייזר עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון קבלת הכשרה מתאימה ושימוש בציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.