זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משולבת חוקרים נדידת תאים סרטן ופלישה על פלטפורמה אחת בזמן אמת, מתן אפשרות היעילה הדירים בקלות ללמוד ניידות תא ו מורפולוגיה.

ניידות תאים סרטניים חיונית ליזום גרורות. לכן, חקירה של תנועת תאים ויכולת פולשנית של תאים סרטניים הוא עניין רב. שיטה משולבת זו לחקר נדידת תאים סרטניים ופלישתם, בפלטפורמה אחת בזמן אמת, מספקת אפשרות ניתנת לשחזור וחסכונית בזמן לחקר ניידות התאים והפתולוגיה.

שיטה זו יכולה לספק תובנה על פלישת תאים סרטניים, באמצעות מטריצה חוץ-תאית, ו ניתן להחיל אותה על סוגי תאים אחרים. כדי להשיג זמן גירוד אופטימלי, ודא שצפיפות הזריעה עברה אופטימיזציה ואל תאריך את תקופת הדגירה לאחר שמונוליית התאים הגיעה ל-100 אחוזי התכנסות. כדי לקבוע את המספר האופטימלי של תאים זרעים עבור מקדחת הגירה, מקם את התאים במגוון של צפיפות ב- triplicate בצלחת של 96 קיר.

מקם את הלוחית בתמונה של התא החי ובחר סריקות לוח זמנים מרשימת המשימות בתוכנת התמונה. בחלונית הגדרת המגירה, קבעו את מיקומי הלוח ולחצו על 'הוסף כלי שיט' לבחירת סוג הלוח. בחלונית הגדרת הסריקה, בחר או ערוך את תבנית הסריקה בהתאם להגדרת לוח הניסיון והגדר את סוג הסריקה כסטנדרט.

לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ציר הזמן ובחר הגדרת מרווחי זמן. לאחר מכן קבעו הוספת סריקות כל שעתיים למשך 24 שעות ולחצו על הלחצן 'החל'. לאחר 24 שעות, פתח את הגדרת המגירה כדי לאפשר את הצלחת הניסיונית להיבחר, ולחץ על הסר כלי.

בחרו שלוש עד שש תמונות מייצגות, והצבו אותן באוסף תמונות חדש. לקביעת הגדרת עיבוד מתאימה, השתמשו בהתאמות פילוח, בניקוי ובמסננים להחלת מסיכת קונפלונס מתאימה, ולהשתמש בזרם תצוגה מקדימה הכל'כדי להציג את דיוק המסיכות. הפעל את עבודת הניתוח ולקבוע צפיפות תאים ממוטבת, על פי משוער 100 אחוז confluence נגד הזמן, בתוך שש עד שמונה עשרה שעות, תלוי מתי ההגירה החלה.

לאחר מכן, החל את כלי ניתוח עיבוד הקונפלונס על תמונות ניגודיות פאזה בהבחנה גבוהה שנאספו באופן אוטומטי כדי ליצור עקומת התפשטות תאים כנגד הזמן. לפני תחילת ההתמדה, מצפים את הצלחת לתרמיל הפלישה עם 50 מיקרוליטר של ג'ל מטריצה חוץ-תאית, מדולל במדיום תרבות תאים קר כקרח, לריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, מניחים את הצלחת באינקובטור של תרבות התאים למשך הלילה.

למחרת אחר הצהריים, שאפו בעדינות את המדיום העודף, וצלו את התאים בצפיפות האופטימללית, בטריליקט, לתוך הבאר המתאימה של הצלחת החוץ-תאית מצופה המטריצה, ולתוך צלחת נוספת של 96 בארות לא מצופות. לאחר מכן, מניחים את הצלחות באינקובטור תרבות התאים בן לילה. למחרת בבוקר, מניחים את צלחת מסמן הנדידה לא מצופה לתוך מחזיק צלחת הבסיס של כלי השריטה, ולהשתמש dowels המנחה בזהירות למקם את החלק העליון של המחזיק על הבסיס.

לחץ והחזק את הידית השחורה תוך הרמת בלוק הסיכה בזהירות כדי להפוך את השריטות. השריטות בכל באר צריכות להיות גלויות בעין בלתי, כמו גם מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת פעם או פעמיים עם מדיום תרבות מחומם מראש כדי להסיר תאים מנותקים או גיליונות תא.

לצורך ההתדגם של הפלישה, גרד את הצלחת המצוהה כפי שהוכח. לאחר הסרת תאים וסדינים מנותקים, השתמשו בקופסה קרירה ומצוננת מראש כדי לצייד את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לפני שאתם שאפו בזהירות את המדיום הקר. לאחר מכן, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של ג'ל מטריצה חוץ תאית מדולל לתוך הבאר המתאימה וממקמים את הצלחת לתוך החממה לתרבות התא במשך שלושים דקות.

בועות נפוצות כאשר עובדים עם ג'ל מטריצה חוץ תאית, אבל הם יכולים להיות מסולקים על ידי שאפתנות 70 אחוז אתנול. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיום טרי וחם, עם או בלי תרכובת הבדיקה, לבירות המתאימות של צלחת הבדיקה של הנדידה או הפלישה, והכנסו את הצלחת לפלטפורמת ההדמיה של התא החי. כדי לנקות את כלי השריטה, הנח את בלוק הסיכה העליון בסירות כביסה בודדות של 45 מיליליטר, המכילות 5 אחוז חומר ניקוי אחד, אחוז אחד של חומר ניקוי 2, מים מזוקקים סטריליים או 70 אחוז אתנול למשך חמש דקות לכביסה לפני הנחת כלי השריטה בחזרה לצלחת הבסיס שלו, לאחסון בסביבה נטולת אבק.

להדמיית בדיקות הפצע, לאחר שאפשרו לצלחת לצייד במשך חמש דקות, בחרו את סוג הכלי 'כמישור יומן התמונה, והגדירו את סוג הסריקה כפצע שריטה. בחר או ערוך את תבנית הסריקה, בהתאם להגדרת לוחית הניסוי, ותזמן 24 שעות של סריקה חוזרת כל שעה עד שעתיים במשך 72 שעות, או עד שהפצעים ירפאו כפי שהוכח. לאחר שכל הפצעים החלימו, הפסיקו את הסריקה ובחרו שלוש עד שש תמונות מייצגות, המשתרעות על פני מגוון אחוזי קול, כולל תמונות מיד לאחר ביצוע הפצע, וסגירה של פצעים ב-10 וב-50 אחוזים.

כדי לקבוע הגדרת עיבוד מתאימה, החל מסיכת פצע שריטה מתאימה ומסכת קונפלונס כפי שהוכח, ולהשתמש בזרם תצוגה מקדימה כדי להציג את הדיוק של המסכות. לאחר מכן, להשיק את עבודת הניתוח. בהגדה, רוחב הפצע הוא המרחק הממוצע בין יריעות התא לצד הפצע.

הפציעה היא ההתכנסות בתוך האזור הפצוע. מהתכנסות הפצע הראשונית האידיאלית צריכה להיות קרובה לאפס אחוזים. צפיפות הפצע היחסית ומיעמד הפצע מצביעים על מהירות התאים הכובשים את אזור פצע השריטה.

נתונים אלה כמעט חופפים בשתי שורות תא מייצגות אלה. קווי תאים שונים מדגימים יכולות שונות מאוד של ריפוי פצעים, המצביעות על יכולות העברה דיפרנציאליות בין קווי התא. לדוגמה, lamellipodia נצפו בקו זה תא אדנוקרצינומה השד בחזית הנדידה בתחילת הנדידה, ואילו זה mucin 1-לייצר סרטן השד קו התא לא הפגין שום סימן של נדידת תאים באותה נקודת זמן.

יתר על כן, צפיפות הפצע היחסית של קו אדנוקרצינומה השד היה רווי לאחר 50 שעות, ואילו צפיפות הפצע היחסית של קו התאים של סרטן השד המייצר mucin 1 לא השתנה עם הזמן, מדגיש את פנוטיפ פולשני מאוד של תאי אדנוקרצינומה ולא פולשניות של mucin 1 מייצר תאים סרטניים בשד. תאי אדנוקרצינומה גם התנהגו בצורה שונה בעת פלישה דרך ג'ל מטריצה חוץ תאית, המדגים מורפולוגיה מוארכת עם בלטים מובילים, ובראיות הגירה, פעימה בחזית הנדידה הודמיה. כאשר ציפוי, זכור כי אם תאים מעטים מדי הם זרע, השריטה לא ייווצו כראוי, ואם תאים רבים מדי הם זרע, יהיה צפיפות.

בעקבות הליך זה, ניתן להוסיף טיפולי מסלול, המאפשרים להתאים שיטה זו להקרנת מסלול תפוקה גבוהה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבצע בדיקות אלה בפלטפורמה אחת, שהיא בעלת תפוקה גבוהה, ומאפשרת לחוקרים לנטר את התאים שלהם בזמן אמת, ולא בנקודות קצה ניסיוניות. חומר החיטוי המשמש לחיטוי כלי השריטה עלול להיות מסוכן.

הקפד לאסוף ולהיפטר מהפתרונות בהתאם ל- MSDS הרלוונטי, ולקווי ההדק הרגילים של המתקן שלך.