Name: זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: חקור שיטה משולבת לניטור הגירה ופלישה של תאי סרטן בזמן אמת באמצעות Imager אוטומטי של תאים חיים. שיטה זו מספקת גישה יעילה וניתנת לשחזור לחקר ניידות תאים ופתולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות תמיכתנו מימון על ידי קרן קבוצת בלומפילד דרך צייד המכון למחקר רפואי (HMRI 13-02). X.Z נתמך על ידי מלגת APA דרך האוניברסיטה של ניוקאסל את המלגה לתואר שלישי HCRA הדגל סמנים ביולוגיים.

הערה: שתי שורות תאים צריך להיות מטופל בנפרד. ההליכים הבאים צריך להיות מוחל על קו תא בודד אחד אם לא צוין.
1. למטב את צפיפות התאים לפני פציעתו
<ol><li>התרבות תאים חסיד ב T75 ס מ2 תרביות רקמה מבחנות עד כ 80% למפגש ב Dulbecco חינם של פנול אדום שונה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 200 מ מגלוטמין ו- 2 µg/mL אינסולין ב 37 ° C עם 5% CO2 ( הדגירה סטנדרטי עבור רוב שורות תאים סרטן, תרבות ניסוחים התנאים תא תלויי-קו).</li>
	<li>להסיר את המדיה התרבות על ידי pipetting לתוך מיכל פסולת. Pipet 2 מיליליטר מראש ומחוממת 0.1% טריפסין-EDTA בקצרה לשטיפה תא טפט של pipet. להוסיף עוד 2 מ"ל של 0.1% טריפסין-EDTA ולמקם את הבקבוקון בתנאים סטנדרטיים הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.</li>
	<li>טפח בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח ניתוק של התאים ולאחר מכן להוסיף 10 מ של מדיה תרבות ומחוממת מראש כדי לעצור את התגובה הפרוטאוליטי.</li>
	<li>העברת התליה תא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל ספין למטה ב x 200 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בזהירות להסיר את תגובת שיקוע מבלי לזעזע את צניפה תא, resuspend עם עוד 10 מ"ל מראש ומחוממת תרבות המדיה.</li>
</ol>2. לספור את מספר הטלפון הנייד באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית (או כל שיטות ספירה)
<ol><li>µL 200 שתדללו של השעיה תא resuspended עם µL 800 1 x פוספט של Dulbecco במאגר מלוחים (DPBS) שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL.</li>
	<li>לצרף בחיישן ספירת תאים מיקרומטר 60 הדלפק תא, החזק את דו-מצבי, למזג את הטיפ התליה תא. לאט לאט לשחרר את הדו-מצבי עד התליה תא בהצלחה הוא נשאב לתוך החיישן. ריכוז התאים מוצג ב תאים למ"ל.</li>
	<li>לחשב את המספר הסלולרי התליה תא 10 מ"ל.</li>
</ol>3. תא יופיצ
<ol><li>צלחת תאים בטווח של תאים צפיפויות (40,000-90,000 תאים/טוב) שהפקידים בצלחת 96-ובכן.</li>
	<li>
למקם את הצלחת םלצה תא חי, לתזמן סריקה כל שעתיים במשך 24 שעות ביממה.
	<ol>
<li>התוכנה, לחץ על לוח הזמנים סריקות מתוך רשימת המשימות. בחלונית הגדרת מגירה, לקבוע את המיקום של הצלחת, לחץ על הוסף כלי ולבחור את סוג הצלחת. בחלונית הגדרת סריקה , לבחור או ערוך את תבנית הסריקה לפי הגדרת צלחת ניסיוני, להגדיר סוג סריקה כמו רגיל.</li>
		<li>לחץ לחיצה ימנית על הזמן, ציר הזמן , בחר להגדיר מרווחי. הגדר להוסיף כל סורק 2 h-לוח זמנים 24 שעות ביממה. לחץ על החל.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. לקבוע את התא אופטימלית זריעה צפיפות עבור וזמינותו ההעברה
<ol><li>סנטהמבצע סריקה לאחר 24 שעות, החל המפגש עיבוד כלי ניתוח לתמונות חדות HD-פאזי שנאספו באופן אוטומטי ולהפיק עיקול התפשטות תא נגד הזמן.
	<ol>
<li>לקבוע 3-6 להחליפן בתמונות ומניחים בתוך אוסף תמונהחדשה.</li>
		<li>לקבוע מסכה נכונה כמו ההגדרה עיבוד.</li>
		<li>ההשקה עבודה ניתוח.</li>
		<li>לקבוע תא ממוטבת צפיפות בהתאם למפגש נגד הזמן (כ 100% זרימה בתוך 6: תרכיזי h תלוי מתי מתחילה וזמינותו ההעברה). הערה: משך הזמן שנדרש כדי לגדול תאי זרימה משתנה בהתאם דילול זריעה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. בימים 1 ו- 2: לקראת העברה, מבחני הפלישה
<ol><li>
יום 1, מעיל את הצלחת על הפלישה וזמינותו. הערה: תמיד צריך להיות מטופל ECM ג'ל על קרח, עם טיפים הונחו במקרר למשך הלילה.<ol>
<li>לדלל ג'ל ECM עם תרבות קר כקרח, למדיה µg 100/מ"ל ולהוסיף 50 µL של ג'ל ECM מדולל/מדיה לתוך בארות המיועד.</li>
		<li>המקום לצלחת-תנאים סטנדרטיים הדגירה למשך הלילה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יום 2, בעדינות תשאף התקשורת עודף. צלחת תאים עם תא ממוטבת צפיפויות לתוך שתי צלחות 96-ובכן המיועדים וזמינותו ההעברה (ללא ציפוי) ואת וזמינותו הפלישה (מצופה) ב- triplicates בעקבות סעיפים 1-3 אחר הצהריים המאוחרות (בפרוטוקול הנוכחי, צפיפויות זריעה ממוטב עבור ZR75-1 מד א-MB-231 היו 90,000/טוב ו 50,000/טוב, בהתאמה).</li>
	<li>למקם צלחות תנאים סטנדרטיים הדגירה למשך הלילה.</li>
</ol>6. יום 3: פצע שריטה
<ol><li>רסס ונגב בכלי גירוד ו- 2 שטיפה סירות עם אתנול 70% לפני הכנסתם אבטחה הקבינט. למלא את הסירה כביסה 1 ו- 2 בדיוק 45 מ ל סטרילי (בלוק) מזוקקים מים ו- 70% אתנול בהתאמה.</li>
	<li>עבור עיקור, במקום לבלוק הצמד בכלי גירוד (למעלה) על שטיפת הסירה 1 ו- 2 למשך 5 דקות.</li>
	<li>
להתחיל עם לוחית assay ההעברה.
	<ol>
<li>להעביר לצלחת המכילה תאים מן החממה וודא כי לא טוב הוא יבש כדי למנוע נזק של הכלי מאפס. הסר את מכסה לוח להכניס לתוך צלחת הבסיס האוחז הכלי מאפס, בזהירות המקום החלק העליון על החלק הבסיסי על ידי המנחה דובלי. הקש להחזיק את ידית שחורה ואני בינתיים בזהירות להרים את הבלוק pin. פערים מכל קידוח הם בדרך כלל גלויים בעין בלתי מזוינת, תחת המיקרוסקופ.</li>
		<li>במהירות להשרות את הסיכות במים; . זה מספיק כדי לנקות בכלי גירוד לפני מגרד את הצלחת assay הפלישה הצלחת ההתקנה הינו זהה. אחרת, חזור על השלבים עיקור עם מים מזוקקים סטריליים ולאחר מכן 70% אתנול למשך 5 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף הזמנים צלחת 1 או 2 עם מדיה תרבות ומחוממת מראש כדי להימנע תאים מנותקת או תא גליונות חיבור מחדש אל הבאר.</li>
	<li>להוסיף 100 µL של התקשורת חם טרי לתוך בארות ייעודית עם או בלי טיפולים.</li>
	<li>
פעולות נוספות עבור הפלישה וזמינותו.
	<ol>
<li>מקם את הצלחת assay הפלישה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות equilibrate, בזהירות תשאף התקשורת קר.</li>
		<li>לדלל ג'ל ECM עם תרבות קר כקרח, למדיה 5 מ"ג/מ"ל, להוסיף 50 µL של ג'ל ECM מדולל לתוך בארות המיועד, תחת סטנדרט הדגירה למשך 30 דקות.</li>
		<li>להוסיף 100 µL של התקשורת חימם-up עם או בלי בדיקות תרכובות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למקם את הצלחת לחיות תאים imager ולתת לו equilibrate עבור 5 דק. בחר סוג אניה כמו צלחת imagelock. להגדיר סוג סריקה כמו לגרד פצע, לבחור או ערוך תבנית לסרוק בהתאם לכיוונון צלחת ניסיוני (1 תמונה/טוב, מצב רחב), לתזמן 24 שעות אני חוזר סריקת כל ה 1-2 עבור 72 h עד הפצעים הגלידו.</li>
	<li>כדי לנקות הכלי מאפס, לשים את הבלוק הסיכה העליונה בכל הפתרונות הבאים (45 מ ל שטיפה סירות) עבור 5 דקות: 0.5% אבקת 1 אבקת 1% (ראה טבלה של חומרים), 2 (ראה טבלה של חומרים), סטרילי אתנול 70% ומים מזוקקים. מניחים בכלי גירוד חזרה אל צלחת הבסיס שלה, חנות בסביבה נטולת אבק.</li>
</ol>7. ניתוח נתונים
<ol><li>הפסק סריקה המשטח המיועד לאחר כל הפצעים הגלידו על-ידי בחירת את הצלחת הניסוי על המגירה ההתקנה ולחיצה להסיר כלי.</li>
	<li>לאסוף 3-6 להחליפן בתמונות המתפרסות על-פני טווח אחוזים סאונד, כולל תמונות ימין לאחר הפצע בוצע, פצע הסגר על-ידי 10% ו 50%.</li>
	<li>כדי לקבוע הגדרה עיבוד מתאים, השתמש פילוח ההתאמה, ניקוי ומסננים כדי להחיל המתאים לגרד פצע את המסכה ואת מסיכת הנהרות. השתמש המקדימה הנוכחית/כל כדי להציג את הדיוק של המסכות.</li>
	<li>הפעל משימת ניתוח.</li>
	<li>נתונים שניתן לנתח בתוך התוכנה או מיוצא לצורך ניתוח נוסף. שלושה מדדים הניתנים על ידי התוכנה ניתן להשתמש כדי להעריך את תמונות HD-פאזי: פצע רוחב (מיקרומטר), פצע הנהרות (%) וצפיפות הפציעה היחסי (%). השוואות יידונו בסעיף הבא.</li>
</ol>

<ol><li>Graham, C. H., Lala, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+placental+invasion+of+the+uterus+and+their+control%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control.</a> Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).</li>
<li>Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+remodelling+through+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue remodelling through branching morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).</li>
<li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10, 683-690 (2014).</li>
<li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis%3A+markers+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).</li>
<li>Breast Cancer: Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. GLOBOCAN. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx">http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx</a> (2012).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis.</a> Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).</li>
<li>Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+cell+line+for+breast+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Choosing the right cell line for breast cancer research.</a> Breast Cancer Research. 13, 215(2011).</li>
<li>Clark, A. G., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+cancer+cell+invasion+and+the+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

ההעברה הפלישה פרמטרים חשובים כדי להעריך את הניידות של תאי הסרטן בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. על-ידי שימוש בכלי גירוד 96 פינים, זה אפשרי לערוך ריפוי מבחני ב 2D and 3D בו זמנית הפצע. מלבד בהנחיה בסריקה אוטומטית באמצעות סביבת התרבות התא יציב עם הפרעה מינימלית, וזמינותו מאפס נערך באמצעות הכלי מאפס 96 פינים מספק עקבי פצעי הזמני, הפעלת ניסויים כי הם עמידים יותר, לשחזור. התבנית 96-ובכן צלחת נותן אפשרויות נוספות של הגדלת מספר שורות תאים או טיפולים תרופות שונות. בנוסף, שינויים מורפולוגיה תאים ותנועה דינמי ניתן לרשום לצורך ניתוח ...

נדידת תאים הפלישה חשוב תהליכים ביולוגיים המאפשרים פונקציות נורמלית בגוף האדם, כגון סגירת הפצע, הפלישה של השליה לתוך הרחם ואת עטין מורפוגנזה1,2,3בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בגוף האדם יש שליטה קפדני ומדויק של אירועים אלה ביולוגי; עם זאת, ישנם כמה חריגים. גידולים ממאירים, למשל, מסוגלים לברוח הגנה זו, מוצג התפשטות חריגה, לפלוש לתוך רקמות שכנות, אשר נקרא גרורות. גרורות הוא הגורם העיקרי של תמותה מסרטן4.
סרטן השד הוא הכי נפוץ אובחן סרטן אצל נשים, הוא הגורם השני-הגבוה של מוות מסרטן בקרב נשים במדינות מפותחות ברחבי העולם5. סרטן השד מקורו של צינוריות או האוניות המורכבים של שכבה אחת או יותר של תאים אפיתל. בשד נורמלי, תאים אפיתל לדבוק אחד לשני וכדי קרום המרתף דרך הממברנה חלבונים כגון E-קדהרין אינטגרינים6. עם זאת, תאי סרטן שד פולשני איבדו קוטביות והצמדות התא-התא שלהם, ולא בסגנון קלאסי עוברים אפיתל המעבר mesenchymal (החובשים) ולהשיג את היכולת לנוע. לאחר extravasation, תאים אלה תנוע מטריצה חוץ-תאית (ECM) והזן את כלי הדם או מערכת הלימפה, ואחריו ואז intravasation וגידול גרורתי7. הבנת המנגנונים שבאמצעותו זו מתרחשת היא משמעות רבה, מאז גרורות הוא הגורם הנפוץ ביותר הקשורים לסרטן בהירושימה, קשורה קשר הדוק סרטן תא העברה/הפלישה. כדי להמחיש את התנועה של תאים סרטניים, מבחני ההעברה ופלישה הם מודלים אידיאלי ללמוד 2D and 3D תנועת התא, בהתאמה. העברה ישירות מעריך את התנועה של תאי ואילו הפלישה ושכוללת מגע עם microenvironment ואת היכולת לבזות את המחסומים הביולוגיים. שני התהליכים אינם עצמאית לחלוטין של זה, כמו הגירה היא דרישה של פלישה.
פותחו מספר שיטות ללמוד הגירה ו הפלישה. כפי שנבדקו על ידי קרמר ואח ', העברת מבחני כגון ריפוי הפצע, גדר, מיקרו-המוביל מבחני ליצור אזור נטול תאים כדי לאפשר תאים להעביר, הערכת השינוי של אזור; ואילו, מבחני transwell ו נימי מבוססים על מספר התאים שנעים לכיוון attractant8. מבחני הפלישה, סביבה ECM צריך להיות מוגדרת עם ג'ל ECM או קולגן למשל, התנועה 3D יכול להיות מוערך על ידי ניטור הפלישה פינת, מרחק, תא הסעיפים (למשל assay transwell, ברווזן assay)8. סוג נוסף של הפלישה assay היא לשלב את התאים פולשנית עם תאים לא פולשנית, להעריך את ההתנהגות של התאים פולשני (למשל, מבחני ספרואיד). השיטות שהוזכרו לעיל יש את היתרונות שלהם, אסירים, דרך קלה לגישה, קל לחזור על, שילוב וזמינותו ההעברה והיא הפלישה assay בזרימת עבודה דומה מועדף בעיצוב ניסיוני.
פרוטוקול זה מתאר את המדידה של נדידת תאים ופלישה באמצעות imager לחיות תאים. . זה תא בזמן אמת ניטור מערכת המותקנת בתוך חממה התרבות תאים סטנדרטית. זה לוקח תמונות בחדות גבוהה לפי ערכת סריקה במרווחי זמן ומדידות על-ידי החלת מסיכות מתאימות התאים או מטרות פלורסנט. המודול של העברה/הפלישה assay כולל באמצעות כלי גירוד 96 פינים, אשר מתאים לייצור הומוגניות לגרד פצעים על טפט התא בצלחת 96-ובכן. המנגנון מבוסס על הפצע במבחנה ריפוי מבחני, ניטור תנועת התא 2D פלסטיק או משטח מצופה. הפלישה או תלת-ממד התנועה מעבר ECM נוספים בתוך השריטה פצע יכול גם להיות מוערך. זרימת עבודה קצרה מודגם באיור1.

<table><tbody><tr><td>0.5% תמיסת טריפסין-EDTA (10x)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td>מדולל ל-2x ב-DPBS</td></tr><tr><td>Countess II FL מונה תאים אוטומטי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td> חומר ניקוי <td>אוטומטי נגד תאים</td></tr><tr><td>1 (Alconox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985</td><td>0.5% ריכוז עבודה</td></tr><tr><td>חומר ניקוי 2 (Virkon S)</td><td>Vetמוצר ישיר</td><td></td><td>1% עובד ריכוז</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium, ללא פנול אדום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>מועשר ב-10% FBS, 200 מ"מ L-גלוטמין, 2 &mu; גרם/מ"ל אינסולין</td></tr><tr><td>ECM ג'ל (מטריג'ל)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6909</td><td>גורם גדילה מופחת, ללא פנול אדום</td></tr><tr><td>Essen ImageLock צלחת 96 בארות, תחתית שטוחה</td><td>Essen</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>EVE שקופיות ספירת</td><td>BioTools</td><td>EVS-50</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 96-well שריטות פלישת תאים פצוע אביזרים</td><td>Essen</td><td>4444</td><td>כולל CoolBox, 2x CoolSink</td></tr><tr><td>IncuCyte Cell Migration Kit</td><td>Essen</td><td>4493</td><td>כולל בלוק סיכות 96 בארות, 2x סירות שטיפה והתוכנה</td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen</td><td></td><td>מערכת ניתוח תאים חיים</td></tr><tr><td>תמיסת אינסולין אנושית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת L-גלוטמין (100x)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-091</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית רקמה, 75 ס"מ2 אזור גידול</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>658175</td><td></td></tr></tbody></table>

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות imager אוטומטיות של תאים חיים

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

סרטן התא ניידות חיונית אתחול של גרורות. לכן, חקירה של תנועת התא, קיבולת פולשנית היא משמעות רבה. העברת מבחני לספק תובנה בסיסית של תנועת התא ברמה 2D, ואילו מבחני הפלישה רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית, מחקה סרטן ויוו dislodgment תא מהאתר המקורי, פולשים באמצעות מטריצות. בפרוטוקול הנוכחי מספק זרימת עבודה יחידה עבור מבחני ההעברה ואת הפלישה. יחד עם משולב אוטומטי מיקרוסקופיים המצלמה עבור ניתוח מובנה מודול ותמונות בזמן אמת HD, זה נותן חוקרים היעילה, האפשרות ניסיוני פשוטה לשחזור. פרוטוקול זה כולל גם החלפות הגיוניות מתכלים ושיטות ניתוח חלופי עבור משתמשים לבחירה.

Assay הגירה/הפלישה הזו מבוססת על וזמינותו ריפוי הפצע, הבודקת את הקצב של התאים נעה לתוך אזור נטול תאים שנוצרו על-ידי הכלי מאפס 96 פינים. ההבדל בין מבחני ההעברה ופלישה הם מבחני ההעברה כי תאי מידות עובר בתאי רקמת-תרבות מטופלים פלסטיק משטח ופלישה אמצעים העברת ECM ג'ל.
בכלי גירוד נועד לגרום עקבי פצעי הזמני בצלחת המיועד, םלצה לחיות תאים מתוכנן לקחת תמונות ברזולוציה גבוהה בזמן אמת עם הפצעים מאפס באמצע. השניים השד סרטן קווים המשמשים את ...

בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משולבת חוקרים נדידת תאים סרטן ופלישה על פלטפורמה אחת בזמן אמת, מתן אפשרות היעילה הדירים בקלות ללמוד ניידות תא ו מורפולוגיה.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

ניידות תאים סרטניים חיונית ליזום גרורות. לכן, חקירה של תנועת תאים ויכולת פולשנית של תאים סרטניים הוא עניין רב. שיטה משולבת זו לחקר נדידת תאים סרטניים ופלישתם, בפלטפורמה אחת בזמן אמת, מספקת אפשרות ניתנת לשחזור וחסכונית בזמן לחקר ניידות התאים והפתולוגיה.שיטה זו יכולה לספק תובנה על פלישת תאים סרטניים, באמצעות מטריצה חוץ-תאית, ו ניתן להחיל אותה על סוגי תאים אחרים. כדי להשיג זמן גירוד אופטימלי, ודא שצפיפות הזריעה עברה אופטימיזציה ואל תאריך את תקופת הדגירה לאחר שמונוליית התאים הגיעה ל-100 אחוזי התכנסות. כדי לקבוע את המספר האופטימלי של תאים זרעים עבור מקדחת הגירה, מקם את התאים במגוון של צפיפות ב- triplicate בצלחת של 96 קיר.מקם את הלוחית בתמונה של התא החי ובחר סריקות לוח זמנים מרשימת המשימות בתוכנת התמונה. בחלונית הגדרת המגירה, קבעו את מיקומי הלוח ולחצו על 'הוסף כלי שיט' לבחירת סוג הלוח. בחלונית הגדרת הסריקה, בחר או ערוך את תבנית הסריקה בהתאם להגדרת לוח הניסיון והגדר את סוג הסריקה כסטנדרט.לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ציר הזמן ובחר הגדרת מרווחי זמן. לאחר מכן קבעו הוספת סריקות כל שעתיים למשך 24 שעות ולחצו על הלחצן 'החל'. לאחר 24 שעות, פתח את הגדרת המגירה כדי לאפשר את הצלחת הניסיונית להיבחר, ולחץ על הסר כלי.בחרו שלוש עד שש תמונות מייצגות, והצבו אותן באוסף תמונות חדש. לקביעת הגדרת עיבוד מתאימה, השתמשו בהתאמות פילוח, בניקוי ובמסננים להחלת מסיכת קונפלונס מתאימה, ולהשתמש בזרם תצוגה מקדימה הכל'כדי להציג את דיוק המסיכות. הפעל את עבודת הניתוח ולקבוע צפיפות תאים ממוטבת, על פי משוער 100 אחוז confluence נגד הזמן, בתוך שש עד שמונה עשרה שעות, תלוי מתי ההגירה החלה.לאחר מכן, החל את כלי ניתוח עיבוד הקונפלונס על תמונות ניגודיות פאזה בהבחנה גבוהה שנאספו באופן אוטומטי כדי ליצור עקומת התפשטות תאים כנגד הזמן. לפני תחילת ההתמדה, מצפים את הצלחת לתרמיל הפלישה עם 50 מיקרוליטר של ג'ל מטריצה חוץ-תאית, מדולל במדיום תרבות תאים קר כקרח, לריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, מניחים את הצלחת באינקובטור של תרבות התאים למשך הלילה.למחרת אחר הצהריים, שאפו בעדינות את המדיום העודף, וצלו את התאים בצפיפות האופטימללית, בטריליקט, לתוך הבאר המתאימה של הצלחת החוץ-תאית מצופה המטריצה, ולתוך צלחת נוספת של 96 בארות לא מצופות. לאחר מכן, מניחים את הצלחות באינקובטור תרבות התאים בן לילה. למחרת בבוקר, מניחים את צלחת מסמן הנדידה לא מצופה לתוך מחזיק צלחת הבסיס של כלי השריטה, ולהשתמש dowels המנחה בזהירות למקם את החלק העליון של המחזיק על הבסיס.לחץ והחזק את הידית השחורה תוך הרמת בלוק הסיכה בזהירות כדי להפוך את השריטות. השריטות בכל באר צריכות להיות גלויות בעין בלתי, כמו גם מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת פעם או פעמיים עם מדיום תרבות מחומם מראש כדי להסיר תאים מנותקים או גיליונות תא.לצורך ההתדגם של הפלישה, גרד את הצלחת המצוהה כפי שהוכח. לאחר הסרת תאים וסדינים מנותקים, השתמשו בקופסה קרירה ומצוננת מראש כדי לצייד את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לפני שאתם שאפו בזהירות את המדיום הקר. לאחר מכן, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של ג'ל מטריצה חוץ תאית מדולל לתוך הבאר המתאימה וממקמים את הצלחת לתוך החממה לתרבות התא במשך שלושים דקות.בועות נפוצות כאשר עובדים עם ג'ל מטריצה חוץ תאית, אבל הם יכולים להיות מסולקים על ידי שאפתנות 70 אחוז אתנול. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיום טרי וחם, עם או בלי תרכובת הבדיקה, לבירות המתאימות של צלחת הבדיקה של הנדידה או הפלישה, והכנסו את הצלחת לפלטפורמת ההדמיה של התא החי. כדי לנקות את כלי השריטה, הנח את בלוק הסיכה העליון בסירות כביסה בודדות של 45 מיליליטר, המכילות 5 אחוז חומר ניקוי אחד, אחוז אחד של חומר ניקוי 2, מים מזוקקים סטריליים או 70 אחוז אתנול למשך חמש דקות לכביסה לפני הנחת כלי השריטה בחזרה לצלחת הבסיס שלו, לאחסון בסביבה נטולת אבק.להדמיית בדיקות הפצע, לאחר שאפשרו לצלחת לצייד במשך חמש דקות, בחרו את סוג הכלי 'כמישור יומן התמונה, והגדירו את סוג הסריקה כפצע שריטה. בחר או ערוך את תבנית הסריקה, בהתאם להגדרת לוחית הניסוי, ותזמן 24 שעות של סריקה חוזרת כל שעה עד שעתיים במשך 72 שעות, או עד שהפצעים ירפאו כפי שהוכח. לאחר שכל הפצעים החלימו, הפסיקו את הסריקה ובחרו שלוש עד שש תמונות מייצגות, המשתרעות על פני מגוון אחוזי קול, כולל תמונות מיד לאחר ביצוע הפצע, וסגירה של פצעים ב-10 וב-50 אחוזים.כדי לקבוע הגדרת עיבוד מתאימה, החל מסיכת פצע שריטה מתאימה ומסכת קונפלונס כפי שהוכח, ולהשתמש בזרם תצוגה מקדימה כדי להציג את הדיוק של המסכות. לאחר מכן, להשיק את עבודת הניתוח. בהגדה, רוחב הפצע הוא המרחק הממוצע בין יריעות התא לצד הפצע.הפציעה היא ההתכנסות בתוך האזור הפצוע. מהתכנסות הפצע הראשונית האידיאלית צריכה להיות קרובה לאפס אחוזים. צפיפות הפצע היחסית ומיעמד הפצע מצביעים על מהירות התאים הכובשים את אזור פצע השריטה.נתונים אלה כמעט חופפים בשתי שורות תא מייצגות אלה. קווי תאים שונים מדגימים יכולות שונות מאוד של ריפוי פצעים, המצביעות על יכולות העברה דיפרנציאליות בין קווי התא. לדוגמה, lamellipodia נצפו בקו זה תא אדנוקרצינומה השד בחזית הנדידה בתחילת הנדידה, ואילו זה mucin 1-לייצר סרטן השד קו התא לא הפגין שום סימן של נדידת תאים באותה נקודת זמן.יתר על כן, צפיפות הפצע היחסית של קו אדנוקרצינומה השד היה רווי לאחר 50 שעות, ואילו צפיפות הפצע היחסית של קו התאים של סרטן השד המייצר mucin 1 לא השתנה עם הזמן, מדגיש את פנוטיפ פולשני מאוד של תאי אדנוקרצינומה ולא פולשניות של mucin 1 מייצר תאים סרטניים בשד. תאי אדנוקרצינומה גם התנהגו בצורה שונה בעת פלישה דרך ג'ל מטריצה חוץ תאית, המדגים מורפולוגיה מוארכת עם בלטים מובילים, ובראיות הגירה, פעימה בחזית הנדידה הודמיה. כאשר ציפוי, זכור כי אם תאים מעטים מדי הם זרע, השריטה לא ייווצו כראוי, ואם תאים רבים מדי הם זרע, יהיה צפיפות.בעקבות הליך זה, ניתן להוסיף טיפולי מסלול, המאפשרים להתאים שיטה זו להקרנת מסלול תפוקה גבוהה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבצע בדיקות אלה בפלטפורמה אחת, שהיא בעלת תפוקה גבוהה, ומאפשרת לחוקרים לנטר את התאים שלהם בזמן אמת, ולא בנקודות קצה ניסיוניות. חומר החיטוי המשמש לחיטוי כלי השריטה עלול להיות מסוכן.הקפד לאסוף ולהיפטר מהפתרונות בהתאם ל- MSDS הרלוונטי, ולקווי ההדק הרגילים של המתקן שלך.

a-simple-migrationinvasion-workflow-using-an-automated-live-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

כאן אנו מתארים פולשני שני הפוטונים (2P) הגישה מיקרוסקופיה ללמוד ליקוציט ביות ב שודד את העכבר. אנו דנים בהיבטים הטכניים של ההכנה שלנו רקמות הדמיה ללכת את הקורא דרך בניסוי אופייני הראשונית להגדיר לאוסף ביצוע ונתונים.

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

מכשיר microfluidic מידור לחקר נדידת תאי גזע סרטני מתואר. פלטפורמה חדשנית זו יוצרת microenvironment סלולרי קיימא ומאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של תנועת תאים חייה. מאוד ניעתי תאים סרטניים מבודדים ללמוד מנגנונים מולקולריים של חדירה אגרסיבית, שעלולים לגרום לטיפולים יעילים יותר בעתיד.

הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה

שיטה זו מאפשרת ניטור של תאים בזמן אמת מדידות כמותיות של פרמטרים שונים הגירה סלולריים כגון מהירות, תזוזה, ומהירות. שלא כמו שיטות מסורתיות, גישה זו בזמן אמת אינה מבוססת על מדידות כמותיות נקודות קצה הגירה, אלא היא מאפשרת ניטור חישוב פרמטרים שונים ברציפות.

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

תהליכים תאיים כגון נדידת תאים מסורתי נחקרו על דו מימדי, משטחי פלסטיק נוקשה. דו"ח זה מתאר טכניקה ישירות חזותי לוקליזציה חלבון וניתוח הדינמיקה חלבון בתאי נודדות בתוך מטריצה ​​יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית תלת מימדי,.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

אנו מתארים שיטת הדמיה לחיות תאים המספקת תובנה דינמיקת חלבון במהלך תהליך תא T ההפעלה. אנו מדגימים את השימוש בשילוב של הפצת assay תא T, מיקרוסקופיה confocal וניתוח הדמיה להניב תוצאות כמותיות לעקוב איתות היווצרות מורכבת לאורך כל הפעלת תא T.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

שיטה להרכבה של שיפועים ודבק מסיסים בתא מיקרוסקופי למחקרי נדידת תאי חיים מתוארת. הסביבה המהונדסת משלבת משטחי antifouling ופסי דבק עם שיפועי פתרון ולכן מאפשרת אחת כדי לקבוע את החשיבות היחסית של רמזי הדרכה.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

פרוטוקול חזקים כדי לפקח אוכלוסיות עצבית על ידי זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה ואחריו-מבוססות תוכנה שלאחר עיבוד מתואר. שיטה זו מייצגת כלי רב עוצמה לזיהוי אירועים הביולוגי בקרב אוכלוסיה הנבחר במהלך הניסויים הדמיה בשידור חי.

חיים הדמיה ואחריו תא בודד מעקב צג Cell Biology, ההתקדמות שושלת היוחסין של אוכלוסיות עצבית מרובים

כאן נתאר הליך כדי לבחון את התא ההעברה במבחנה עם מיקרוסקופ אופטי מצלמה אוטומטית. וזמינותו מאפס כבר בשימוש נרחב שבו הסגר על השריטה מלווה קצוב. מיקרוסקופ אופטי מאפשר זיהוי אמין וזול של נדידת תאים.

אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית

אזור שוליים B תאים (MZBs) להגיב בכוח גזירה זרימה על ידי מחדש המכוונת את נתיב הנדידה שלהם כן. פרוטוקול זה מראה כיצד לתעד ולנתח את ההעברה באמצעות יחידת פלואידיקה, משאבה, מערכת הדמיה במיקרוסקופ, תוכנה חופשית.

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

מחקר זה מציג פרוטוקול של אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים המיושמים על קו תאי גליומה מפוזר בקו האמצע בילדים, שימושי כדי לחקור בזמן אמת את ביטוי החלבונים על קרום הפלזמה במהלך תהליכים דינמיים כמו פלישה ונדידה של תאים תלת-ממדיים.

בדיקות אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים של גליומה מפושטת בקו האמצע בילדים

פרוטוקול זה מספק שיטה של בידוד תאי T ראשוניים ומיקרוסקופ בהילוך מהיר של נדידת תאי T בתנאים סביבתיים ספציפיים עם ניתוח כמותי.

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8

חקור שיטה משולבת לניטור הגירה ופלישה של תאי סרטן בזמן אמת באמצעות Imager אוטומטי של תאים חיים. שיטה זו מספקת גישה יעילה וניתנת לשחזור לחקר ניידות תאים ופתולוגיה.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

גלה סרטונים נוספים