הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לדווח ולהשוות את שתי הבדיקות המשמשות לחקר פלישת תאים ונדידה, מבחן תא בוידן ובדיקת פצעי שריטות מבוססת מיקרוסקופ וידאו במבחנה. ניסויים אלה יכולים לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר של פלישה והגירה, כגון בחירת השיטה הרלוונטית ביותר. היתרון העיקרי של בדיקת פצע שריטות מותאמת זו המבוססת על מיקרוסקופיית וידאו במבחנה הוא שהיא מספקת השוואה ניתנת לשחזור ומדויקת בין תנאי הטיפול.

למרות ששיטה זו יכולה להעריך נדידת תאים ופלישה, ניתן ליישם אותה גם בתחומי מחקר אחרים כגון ריפוי או התחדשות רקמות. הכן תאי SQ20B 72 שעות לפני היום הראשון של הבדיקה על ידי זריעה פעמיים 10 ל-1/6 תאים ב-25 מיליליטר של מדיום תרבית בבקבוק של 175 סנטימטר מרובע. אפשר לתאים לגדול ל-80% מפגש תאים ב-37 מעלות צלזיוס.

ביום הראשון לאחר הטריפסיניזציה וספירת התאים, זרעו את התאים בבקבוק של 25 סנטימטר רבוע בצפיפות תאים של שישה כפול 10 ל-1/5 תאים בשלושה מיליליטר של מדיום תרבית עבור כל מצב שיש להעריך. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, הרעיבו את התאים על ידי החלפת המדיום בכל בקבוק בשלושה מיליליטר של מדיום סרום בקר עוברי נמוך.

הרעיבו את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לבדיקת הפלישה הכינו את תאי בוידן המצופים 12 שעות לאחר תחילת הרעב התאים. הנח כל תא בוידן בצלחת הנלווית.

הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום תאי רעב לכל תא מצופה. למחרת, היום השלישי, השתמש בצלחת הנלווית להכנת חומר המשיכה הכימי. מלאו כל באר של הצלחת הנלווית בת 24 הבארות ב-750 מיקרוליטר של מדיום שלם עם 10% FBS, הידרוקורטיזון, פניצילין וסטרפטומיצין.

העבירו את החדר העליון לצלחת הנלווית הממולאת מראש תוך הקפדה על הימנעות מבועות. לצורך בדיקת הפלישה, הסר בזהירות 450 מיקרוליטר של מדיום תרבית מכל תא ביידן. לאחר טריפסיניזציה וספירה של תאי SQ20B המורעבים, זרעו שלוש פעמים 10 ל-1/4 התאים ב-500 מיקרוליטר של מדיום BSA 0.1% נותנים דילול סופי של שישה כפול 10 ל-1/4 תאים למיליליטר.

הנח את תא בוידן באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. ביום הרביעי הסר כל תוספת מהצלחת הנלווית והסר בזהירות את התאים מהתא העליון באמצעות צמר גפן. לאחר מכן תקן וצבוע כל תוספת בנפרד כדי לקבל צבע מאי-גרונוולד גימסה באמצעות ערכת צביעה לפי הוראות היצרן.

בצע ניתוח מיקרוסקופי ביום החמישי. הכנס את הצלחת הנלווית עם התוספות למיקרוסקופ ניגודיות פאזה 20X וספור כל תא נודד בחלק התחתון של הממברנה. 72 שעות לפני היום זרע אחד מהבדיקה פעמיים כפול 10 לתאי 1/6 SQ20B ב-25 מיליליטר של מדיום תרבית בבקבוק של 175 סנטימטר רבוע ומאפשר לתאים לגדול למפגש תאים של 80%.

ביום הראשון לאחר הטריפסיניזציה וספירת התאים יוצרים דגימה מדוללת מראש של תאי SQ20B בצפיפות של ארבע פעמים 10 ל-1/5 תאים למיליליטר. הוצא 100 מיקרוליטר מתמיסת התא לכל באר של צלחת של 96 בארות כדי לתת צפיפות סופית של ארבע פעמים 10 ל-1/4 תאים לכל 100 מיקרוליטר בכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ומאפשרים לתאים להיצמד לצלחת למשך 12 עד 16 שעות.

למחרת קח את הצלחת למכסה המנוע לפציעה באמצעות מכשיר פציעה מסחרי. הסר את החלק העליון של יצרן הפצעים והנח אותו בתמיסת סירת הכביסה. הכנס את הצלחת למחזיק לוחית הבסיס והסר את מכסה הצלחת.

החלף את בלוק הסיכה על ידי הנחיית הדיבלים האחוריים של בלוק הסיכה לתוך החורים האחוריים של לוחית הבסיס. דחוף והחזק את הידית השחורה והרם את בלוק הסיכה תוך כדי המשך החזקת הידית השחורה כלפי מטה. בעזרת פיפטה עם קצה חרוטי מותאם, הסר מיד את המדיום מכל באר, הקפד לא לגעת בפצע.

שטפו את התאים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מדיום תאים שחומם ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר הכביסה השנייה, השתמש בפיפטה עם קצה חרוטי מותאם כדי לשאוב את מדיום התא. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום ספציפי לכל מצב טיפול לכל באר והקפד להימנע מיצירת בועות בבארות.

הנח את צלחת 96 הבארות במדף המותאם של מיקרוסקופ הווידאו. באמצעות תוכנת מיקרוסקופ הווידיאו לוח הזמנים של סריקות בתמונה אחת לכל באר. לניסוי פלישת הגירה נדרש מרווח מקסימלי של שעתיים.

אם מטרת הניסוי היא להפיק סרטון, עדיף מרווח מקסימלי של 30 דקות. נטר ובדוק את נדידת התאים למשך 24 שעות לפחות ועד חמישה ימים באמצעות מסכת תאים מתאימה המותאמת לכל סוג תא כדי לנתח את נדידת התאים. כדי להשיג מסיכת תא המותאמת לכל קו תא, צור הגדרת עיבוד תאים מהתוכנה באמצעות אוסף תמונות תא ספציפי.

עקוב אחר העקומות וייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני שניתן להשתמש בו כדי לנתח ולהשוות את התוצאות. כדי להתכונן לבדיקת פלישת התאים, זרעו תאי SQ20B באותו אופן שהודגם עבור בדיקת נדידת התאים, ודגרו על צלחת 96 הבארות בחממה. ביום השני של הבדיקה הכינו את המטריצה החוץ-תאית.

הפשירו את המטריצה בארבע מעלות צלזיוס למשך 12 שעות לפחות לפני השימוש וודאו שלא נראים אגרגטים. מצננים את צינורות המיקרו-צנטריפוגה על קרח למשך חמש דקות. מדללים את המטריצה עם קצות חרוטיים מקוררים מראש לארבע מעלות צלזיוס בצינורות המיקרו-צנטריפוגה מקוררים מראש עם מדיום תא מקורר לארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל ריכוז סופי של 300 מיקרוגרם למיליליטר.

שמור את צינורות המיקרו-צנטריפוגה עם מטריצה מדוללת מראש במקרר בארבע מעלות צלזיוס. אחזר את צלחת 96 הבארות מהחממה. מתחת למכסה המנוע הכינו את הפצע באמצעות מכשיר הפציעה המסחרי על פי פרוטוקול היצרן כפי שהודגם קודם לכן.

השתמש בפיפטה עם קצה חרוטי מותאם כדי להסיר מיד את המדיום מכל באר ולהיזהר לא לגעת בפצע. שטפו את התאים פעמיים באמצעות 100 מיקרוליטר של מדיום תאים שחומם ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר הכביסה השנייה הניחו את הצלחת על קרח למשך חמש דקות כדי לאזן את הטמפרטורה שלה.

הסר את המדיום הקר מכל באר תוך הקפדה על פיפטה בזהירות מהקצה ולהימנע מלגעת בפצע. בעזרת קצות חרוטיים מקוררים מראש בארבע מעלות צלזיוס מוסיפים 50 מיקרוליטר של מטריצה מדוללת מראש לכל באר. מניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות הוסף 100 מיקרוליטר ממדיום התא המותאם לכל באר כפי שמצוין לכל מצב טיפול. הנח את הצלחת לתוך המתלה המותאם במיקרוסקופ הווידאו. לאחר מכן תכנת את הסריקות ובצע ניתוח מיקרוסקופ וידאו כפי שהודגם עבור בדיקת נדידת התאים.

מוצגות תוצאות מייצגות של קרום בוידן לאחר קיבוע תאים. לממברנה התת-אופטימלית יש אשכולות תאים בצד העליון של הממברנה ותוצאות בלתי ניתנות לפירוש. לעומת זאת, לממברנה האופטימלית יש תאים הניתנים למנייה בחלק התחתון של הממברנה המוכתמים בכחול.

תוצאה אופטימלית של בדיקת פצע השריטה מודגמת על ידי תמונות אלה של ריפוי פצע בשעת אפס, 15 שעות ו-30 שעות. הקריטריונים לניסוי איכותי הם פצע ליניארי, לא נצפו שברי תאים בפצע ומפגש תאים אופטימלי. מפגש של 90% הוא צפיפות התאים האופטימלית לבדיקת ריפוי הפצע כפי שמוצג בפאנל A.לוח C מציג דוגמה לצפיפות תאים נמוכה ופאנל B מציג אשכולות תאים הנגרמים על ידי שטיפה לא מספקת של גלולת התא.

ייצוג גרפי זה של ריפוי פצעים המתקבל באמצעות תוכנת מיקרוסקופ הווידיאו מציג כימות של פרמטרים של מפגש תאי פצע בהתאם לזמן עבור ארבעה מצבי טיפול. נצפה כי הטיפול המשולב מפחית משמעותית את נדידת התאים. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך את תהליך נדידת התאים והפלישה.