הריבוב פלורסנט Microarray לניתוח חלבוני רוק אדם שימוש מיקרוסכמות פולימרים ואגדים של סיבים אופטיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח חלבונים מרובים בדגימות רוק אנושיות באמצעות מערכים פלואורסצנטיים מבוססי מיקרוספרה. ראשית, קודד את המיקרוספירות בכמויות שונות של שני צבעים פלואורסצנטיים. חבר את נוגדני הלכידה לחלבונים שונים על המיקרוספירות המקודדות.

לאחר מכן הרכיבו את מיקרו-מערך החלבון המולבט על צרור הסיבים האופטיים באמצעות הבדיקות החיסוניות הסנדוויץ' בבדיקת המיקרו-מערכים המורכבים עבור חלבונים מרובים בדגימות הרוק של הבדיקה. בסופו של דבר, ניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול למדוד את תגובות האותות של חלבונים שונים בדגימות הרוק. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו זו של אלייזה הוא שהיא מאפשרת ניתוח בו זמנית של חלבונים מרובים בנוזלים ביולוגיים מורכבים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ניתוח רוק אנושי, ניתן ליישם אותה גם על שפעת ביולוגית אחרת כגון שתן בסרום וליחה. שקלו את האופיום TTA בבקבוקון זכוכית ענבר והכינו תמיסת מלאי של 200 מילי-מולרית בטטרה הידרו פורין. ערבבו בעדינות על ידי פיפטינג וודאו חזותית שהצבע מומס לחלוטין.

באופן דומה, הכינו תמיסת מלאי של 12 מילי-מולרית של קומרין 30 מעורבבת בעדינות על ידי פיפטינג. באופן חזותי. ודא שה-D הוא מערבולת מומסת לחלוטין למתלה מיקרוספרה, ולאחר מכן העבר 60 מיקרוליטר לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. כדי לשטוף את המיקרוספירות יש להוסיף 600 מיקרוליטר PBS מעורבב על ידי פיפטינג 20 פעמים וצנטריפוגה ב -10, 000 סל"ד למשך שלוש דקות.

לאחר שלוש שטיפות עם תמיסת טטרה הידרו פורין, הסר את הסופרנטנט השהה מחדש את החך ב-600 מיקרוליטר של תמיסת עבודה, והעביר את התערובת לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר. אטום את צינור המיקרו צנטריפוגה עם סרט פרה והניח אותו על שייקר. הגן עליו מפני אור על ידי כיסוי בנייר אלומיניום.

הוסף 200 מיקרוליטר של מתלה מיקרוספרה מקודד למנעול בטוח, צינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. בצורה טיפתית הוסף 150 מיקרוליטר, תמיסת EDC טרייה שהוכנה הוסף מיד 150 מיקרוליטר של תמיסת סולפה NHS. מערבבים היטב על ידי פיפטינג ומוודאים שהמתלה הומוגני.

מכסים את הצינור, אוטמים אותו בפרפורם ומניחים אותו על שייקר. הגן עליו מפני אור על ידי כיסוי בנייר אלומיניום. לאחר שלוש שטיפות של P-B-S-S-D-S מאגר ראוס, השעו את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של תערובות חיץ P-B-S-S-D-S.

ובכן, אז העבירו את התמיסה ל-300 מיקרוליטר של מאגר P-B-S-S-D-S המכיל 60 מיקרוגרם של נוגדנים לכידה. מערבבים 50 מיקרוליטר מכל סוג של מיקרוספירות לכידת חלבון לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה חיטוי חדש. צנטריפוגה את המיקרוספירות המלאי במהירות של 7,000 סל"ד למשך שלוש דקות והסירו את כל המיקרוליטרים מלבד 100 מיקרוליטר של סופרנטנט.

כעת חותכים ידנית צרורות סיבים אופטיים לאורך של כחמישה סנטימטרים, מלטשים ברצף את שני הקצוות באמצעות סרטי חיפוי יהלומים. לאחר מכן סוניקציה של הצרור המלוטש במים נטולי יונים למשך שתי דקות. כדי להסיר חלקיקים, הכניסו מוט ערבוב מגנטי קטן לצינור מיקרו צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר.

מוסיפים 400 מיקרוליטר של מאגר PBS נטול חלבון ומערבבים על צלחת ערבוב מגנטית למשך 30 דקות. כדי להסיר בועות אוויר, חרוט קצה אחד של צרור הסיבים המלוטשים בתמיסת מימן כלורי רגילה של 0.025 למשך 150 שניות. טבלו מיד והפכו את ה-N החרוט למים נטולי יונים למשך דקה אחת.

לאחר מכן יבש את צרורות הסיבים באוויר דחוס, הרכיב את צרור הסיבים על מחזיק סיבים וחסום את הקצה החרוט במאגר PBS נטול חלבון ללא בועות למשך שעה אחת, הפקיד רביעיית ALI של מיקרוליטר אחד של מתלה המיקרוספירה המאוחסנת בקצה החרוט של צרור הסיבים האופטיים. הגן על ההתקנה מפני אור עם קופסה עטופה בנייר אלומיניום. לאחר 15 דקות, נפח המתלה יקטן על ידי אידוי ויאלץ את המיקרוספירות לתוך בארות המיקרו החרוטות.

השתמש במקלון רווי בתמיסת דגימה כדי להסיר מיקרוספירות שאינן כלואות בבארות המיקרו. כדי להפוך את מיקרו-מערך החלבון מוכן לשימוש, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת דגימה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה חיטוי של 0.5 מיליליטר. טבלו את מערך החלבון העמוס על הסיבים בתמיסה והניחו על שייקר.

הגן מפני אור על ידי כיסוי בנייר אלומיניום. לאחר מכן, טבלו את מיקרו-מערך החלבון בצינור מיקרו צנטריפוגה חדש המכיל 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה ונערו ב-600 סל"ד למשך שתי דקות. כעת דגרו את המיקרו-מערך בתמיסה של 100 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים לזיהוי המכיל נוגדנים לזיהוי ביוטיניליים וחוצץ חוסם PBS למשך 30 דקות.

בטמפרטורת החדר בחושך, נקו את הקצה הדיסטלי של צרור הסיבים בעזרת ספוגית רוויה באתנול מוחלט. לאחר מכן יבש את שני קצוות הסיב באוויר דחוס, הרכיב את הסיב על מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי ודמיין דרך הקצה הדיסטלי של הסיב, רכוש את תמונות המיקרוספירה המתאימות לעוצמות פליטת פלואורסצנט של אופיום TTAC 30 ו-SAP. תמונות הקידוד של שבעה סוגי מיקרוספרה מוצגות כאן.

שתי רמות עוצמה נצפות בתמונת הקידוד UTTA, המייצגות מיקרוספירות המקודדות בכמויות שונות של UTTA תוצאות דומות נצפות בתמונת הקידוד C 30. ניתוח תמונה של MATLAB מאפשר לחשב את עוצמות הקרינה של מיקרוספירות שונות בתמונת האות. תוצאות הפענוח מוצגות באיור 2D 7.

מיקרוספירות שונות מפוענחות בהצלחה. המיקרוספירות אינן מראות תגובה כאשר הן מודגרות עם מאגר בדיקה. כאשר מודגרים עם דגימות רוק אנושיות, נצפות תגובות פלואורסצנטיות משמעותיות.

להשוואה טובה יותר, הניגודים בשני הדמויות הללו הותאמו לאותה רמה. לאחר שליטה, שיטה זו מאפשרת ניתוח ניתן לשחזור של חלבונים שונים בדגימות הרוק האנושיות. מוצגות התוצאות של שלושה גילויים עצמאיים באותה דגימה.

לאחר צפייה בסרטון זה, עליך להבין היטב כיצד להכין מיקרו-קרני חלבון מולטיפלקס מבוססת מיקרוספירה ולהשתמש בה לניתוח נוזלים ביולוגיים מורכבים. בצע הליך זה. ניתן לנתח גם סמנים ביולוגיים אחרים של חלבונים בנוזלים ביולוגיים מורכבים שונים.