Name: מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: חקור את השפעת העומס המכאני על פרוטאוליזה ברמת מולקולה בודדת באמצעות מלקטות מגנטיות. שיטה זו מאפשרת מדידת קינטיקה אנזימטית בקולגן עם יעילות גבוהה ועלות נמוכה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרס בורוז קריירה Wellcome בממשק המדעי (ARD), המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב באמצעות תוכנית חדשה של מנהל NIH פרס ממציא 1-DP2-OD007078 (ARD), המלכה האם ויליאם ג&#39;וניור בוגר סטנפורד אחוות (ASA ), ואת לב וכלי דם במכון סטנפורד אחוות הצעיר Predoctoral (JC). המחברים מודים ג&#39;יימס Spudich עבור הלואה ציוד במיקרוסקופ.

<ol><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+cancer+be+reversed+by+engineering+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).</li>
<li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).</li>
<li>Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+structure+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibrin structure and wound healing.</a> J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).</li>
<li>Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Load+Induces+a+100-Fold+Increase+in+the+Rate+of+Collagen+Proteolysis+by+MMP-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).</li>
<li>Zareian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+collagen%2Fenzyme+mechanochemistry+in+native+tissue+with+dynamic%2C+enzyme-induced+creep%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep.</a> Langmuir. 26, (2010).</li>
<li>Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+of+bovine+pericardium+accelerates+enzymatic+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation.</a> Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).</li>
<li>Jesudason, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+regulate+elastase+activity+and+binding+site+availability+in+lung+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin.</a> Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy%3A+determination+of+unbinding+force%2C+off+rate+and+energy+barrier+for+protein-ligand+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction.</a> Micron. 38, 446-461 (2007).</li>
<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li>
<li>Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers in cell biology.</a> Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Frank, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+short+collagen-like+triple+helices+by+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering.</a> J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).</li>
<li>Stetefeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+stabilization+at+atomic+level%3A+crystal+structure+of+designed+%28GlyProPro%2910foldon%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon.</a> Structure. 11, 339-346 (2003).</li>
<li>Chung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+unwinds+triple-helical+collagen+prior+to+peptide+bond+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis.</a> EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).</li>
<li>Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+the+specific+adhesion+of+cells+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Models for the specific adhesion of cells to cells.</a> Science. 200, 618-627 (1978).</li>
<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSelvin%2C+PR+%22Single-molecule+techniques%3A+a+laboratory+manual%22">Single-molecule techniques: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22, 292-299 (2006).</li>
<li>Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+ligand-receptor+complexes+using+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers.</a> Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).</li>
<li>Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoenzymatic+cleavage+of+the+ultralarge+vascular+protein+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor.</a> Science. 324, 1330-1334 (2009).</li>
<li>Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).</li>
<li>del Rio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+single+talin+rod+molecules+activates+vinculin+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding.</a> Science. 323, 638-641 (2009).</li>
<li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers%3A+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

פרוטוקול זה מתאר שימוש חדש במולקולה טכניקה קלאסית אחת. פינצטה מגנטיים מאפשרים בינונית עד גבוהה התפוקה מבחני מולקולה בודדת בצורה יעילה וחסכונית. עם זאת, כמו כל ניסיוני בטכניקות ישנם אתגרים ואת החסרונות פוטנציאליים. מגבלות פינצטה מגנטיים לעומת מלכודת אופטי רזולוציה במרחב ובזמן של מנגנון MT הוא נמוך. יתר על כן, הכוחות שנוצר על ידי MT הפשוטה המתוארת כא...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> מיקרו כיסוי זכוכית # 1.5 (22x22) </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td> מיקרו כיסוי זכוכית # 1.5 (22x40) </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td> Lambda-DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> האנזים T4 DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> Microcon Ultracel YM-100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td></tr><tr><td> נגד Digoxigenin </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> סיגמא </td><td> P9416-100 מ&quot;ל </td></tr&gt; <tr><td> Anti-myc נוגדן </td><td> Invitrogen </td><td> 46-0603 </td></tr><tr><td> שור אלבומין בסרום </td><td> סיגמא </td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne T1 streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> P-Aminophenylmercuric Acetate </td><td> Calbiochem </td><td> 164610 </td></tr><tr><td> ביוטין-Maleimide </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> B1267 </td></tr><tr><td> ביוטין שכותרתו oligo </td><td> IDT-DNA </td><td> התאמה אישית סינתזה </td></tr><tr><td> Digoxigenin שכותרתו oligo </td><td> IDT-DNA </td><td> התאמה אישית סינתזה </td></tr><tr><td> קולגןהפפטיד גן </td><td> ה-DNA 2.0 </td><td> התאמה אישית סינתזה </td></tr><tr><td> MMP-1 cDNA </td><td> הרווארד פלסמיד מסד נתונים </td><td></td></tr><tr><td> Z-מתרגם </td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td> סרוו בקר על המתרגם </td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

הדור וזיהוי של כוחות מכניים הוא היבט של פיזיולוגיה התא נמצא בכל מקום, עם שייכות ישירה סרטן גרורות 1, 2 ו atherogenesis ריפוי פצעים 3. בכל הדוגמאות הללו, התאים להפעיל כוח הן על סביבתם ובמקביל enzymatically לשפץ תאי מטריקס (ECM). השפעת כוחות על ECM הפך בכך על שטח של עניין רב בשל החשיבות שלה סביר ביולוגי ורפואי 4-7. טכניקות מולקולה בודדת, כגון השמנה אופטי 8, מיקרוסקופ כוח אטומי 9, פינצטה מגנטיים 10,11 לאפשר לחוקרים לבחון את תפקוד האנזימים ברמה המולקולרית על ידי הפעלת כוחות על חלבונים בודדים. של שיטות אלו, פינצטה מגנטי (MT) ידועות ובעלות נמוכה שלהם, קצב העברת נתונים גבוה. MT מפעילים כוחות בטווח של 1-100 ~ PN והוא יכול לספק פתרון זמני אלפית השנייה,תכונות כי הם מתאימים גם ללימוד מנגנון האנזים ברמת מולקולה בודדת 12. כאן אנו מדווחים assay MT parallelizable מאוד ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis של מולקולות חלבון בודדות. אנו מציגים דוגמה ספציפית של proteolysis של פפטיד קולגן trimeric ידי מטריקס metalloproteinase 1 (MMP-1), אך זה assay ניתן להתאים בקלות ללמוד מצעים אחרים פרוטאזות.

במאמר זה נתאר את השימוש פינצטה מגנטיים ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis האנזימטית ברמה של מולקולה בודדת באופן parallelizable ביותר.

ייצורם וגילויהם של כוחות מכניים הם היבט נפוץ בפיזיולוגיה של התא, בעל רלוונטיות ישירה למטסטזיס של סרטן1, לאתרוגנזה2...

המטרה הכללית של הליך זה היא לחקור את השפעת העומס המכני על פירוק פרוטאוליטי של חלבונים בודדים באופן מקבילי מאוד וחסכוני. בהדגמה זו, נבחן את פירוק הקולגן על ידי matrix metalloproteinase one; בשלב הראשון, מוצמדים קוצצי קולגן (collagen trimmers) לכיסוי הזכוכית של תא זרימה, ולאחר מכן מוצמדים חרוזי מגנט בגודל מיקרומטר למולקולות קולגן בודדות. השלב השני הוא התקנת תא הזרימה במכשיר הפינצטה המגנטית ובדיקה שחרוזים שהוצמדו באופן לא ספציפי הוסרו מפני השטח של כיסוי הזכוכית.בשלב הבא, מוסיפים את הפרוטאז לתאי הזרימה. השלב האחרון הוא קביעת קצב הפרוטאוליזה על ידי ניטור ניתוק חרוזיים בזמן אמת. על ידי מדידת קצבי ניתוק החרוזיים בריכוזי פרוטאז ובכוחות משתנים, ניתן לגזור פרמטרים קינטיים זואולוגיים סטנדרטיים תוך שימוש בכמויות מזעריות של סובסטרט ופרוטאז.בנוסף, טכניקה זו מספקת מידע ייחודי על השפעת כוח מכני על קצב הפרוטאוליזה ועל השינויים המבניים בחלבון המצע הנלווים לבקיעה. היתרון המרכזי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות אחרות, כגון עקבות T אופטיות ומיקרוסקופיית כוח אטומי, הוא שהיא בעלת תפוקה גבוהה וכלכלית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הכוח האפקטיבי על הבקיעה הפרוטאוליטית של חלבונים בודדים, ניתן ליישם את המכשור והטכניקות על מגוון רחב של בעיות ביופיזיות, כולל השפעת כוח על קיפול חלבונים וקונפורמציה.התחילו את הכנת תא הזרימה על ידי ניקוי של לבישי כיסוי באמצעות סוניקציה. הכניסו את לבישי הכיסוי למכל זכוכית קטן המתאים להם ונכנס למכשיר הסוניקטור. מלאו את המכל באיזופרופנול ובצעו סוניקציה באמבט סוניקציה למשך 20 דקות, לאחר מכן רוקנו את האיזופרופנול ושטפו את לבישי הכיסוי בכמויות רבות של מים דה-יוניים.מלאו את המיכל במים ובצעו סוניקציה למשך 20 דקות. לאחר הסוניקציה, ייבשו את לוחות הכיסוי בזרם של אוויר מסונן נקי מאבק. בדקו את לוחות הכיסוי והשתמשו רק באלו הנקיים מכתמים.חממו בעדינות את לבישי הכיסוי במשך מספר שניות כדי לנקות אותם מאבק ומלחות שנותרו, וזאת על ידי העברת לבישי הכיסוי בלהבה של מבער בנזן, תוך הקפדה שלא לעוות את לביש הכיסוי עקב חום מרובה. שלב זה מסיר מזהמים שנותרו על פני השטח.בשלב הבא, השתמשו בסרט דביק דו-צדדי כדי לחבר את שתי זכוכיות הכיסוי זו לזו. גזרו תחילה את הסרט לאורך של כ-3 סנטימטרים וברוחב של 0.3 סנטימטרים, והדביקו אותו לזכוכית כיסוי בגודל 22 על 40 מילימטר, כך שיישאר תעלה של 1.6 סנטימטר במרכז. השתמשו בטיפ של פיפטה כדי ללחוץ בעדינות על זכוכית הכיסוי כדי להבטיח שהסרט נדבק כראוי.מערך הפינצטה המגנטית נבנה במעבדה זו באמצעות תומך אלומיניום בצורת L עם חור סיכה בקוטר של one millimeter, והוא הותקן על מתרגם Z אנכי כדי לווסת את גובה הפינצטה. שני מגנטים קבועים של נדיר-עפר הוצמדו לתומך משני צדי חור הסיכה כדי ליצור את מפל המגנטים. כיול תקין של המלכודת המגנטית חיוני להליך זה.על מנת להבטיח הצלחה, אנו משתמשים בשתי שיטות שונות כפי שמתואר בסעיף זה. לצורך כיול המלכודת המגנטית, השתמשו ב-DNA שהוכן מראש מפאג' Lambda, המסומן בקצות ה-5' וה-3' שלו בביוטין וב-doxygen כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להצמיד את ה-DNA לתא הזרימה, מלאו תחילה את תא הזרימה בתמיסת נוגדן נגד D oxygen ואפשרו לנוגדן להיצמד למשטח הזכוכית למשך 15 דקות.בשלב הבא, חסמו את פני השטח של תא הזרימה כדי למנוע היצמדות לא ספציפית של DNA על ידי הוספת תמיסת BSA לתא הזרימה. שימו לב כי עבור שלב חסימה זה וכל השלבים הבאים, נפח הריאגנט המתווסף לתא הזרימה צריך להיות לפחות פי שניים מנפח התא. נפח תא הזרימה, שבהדגמה זו הוא 75 microliters, דגרו את תא הזרימה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.לאחר חזרה על שלב זה, הוסיפו 50 pico molar של lambda DNA פונקציונלי ו permitan לו להיקשר ללוחית הזכוכית (cover slip) למשך 15 דקות, ושטפו את ה-DNA העודף באמצעות XPBS אחד. לבסוף, הוסיפו חרוזי סופר-פרמגנטיים מצופים בסטראפטאבידין (streptavidin) והניחו להם להיקשר ל-DNA המקובע למשך 15 דקות. בהדגמה זו נעשה שימוש בחרוזים בקוטר 2.8 micrometer.שטפו עודפי חרוצים באמצעות XPBS אחד. לאחר מכן, בצעו כיול של הפינצטה המגנטית על ידי הזזת המגנטים הקבועים למצב הרחוק מפני שטח הדגימה. לאחר מכן, הניחו את תא הזרימה שהוכן במיקרוסקופ.העבירו את המגנטים הקבועים למיקום מעל תא הזרימה. בחרו את מישור המיקוד של חרוזי Lambda DNA פונקציונליים על ידי מיקוד על החרוזים הרחוקים משני משטחי הזכוכית. מישור המיקוד הנכון הוא זה שבו למרכז החרוזים הרצויים יש מראה בהיר.צלמו וידאו של תנועת החרוצים בשיעור של 80 hertz למשך 500 פריימים. קרבו את המגנט לפני השטח של הדגימה והקליטו וידאו של תנועת החרוצים בכל מיקום. עבור מרחקים הגדולים מחמישה מילימטרים, התקדמו במרווחים של מילימטר אחד; עבור מרחקים שבין מילימטר אחד לחמישה מילימטרים, התקדמו במרווחים של מילימטר אחד.הזז במרווחים של 0.5 millimeter למרחקים קטנים ממילימטר אחד, ובמרווחים של 0.25 millimeter עבור מרחקים קצרים יותר. עבור כל סט נתונים, עקב אחר מרכז החרו지를 באמצעות התאמת Gaussian בדו-ממד (2D). חשב את הכוח באמצעות תנודות בראוניאניות (brownian fluctuations) כפי שמתואר בנוהל הכתוב. אשר את דיוק הכוחות על ידי בדיקת חישוב הכוח באמצעות התאמת קו ליניארי (Lian fit) של ספקטרום ההספק.על מנת למצוא את תדר ה-roll off, ניתן למצוא את הקשר בין הכוח המופעל לבין תדר ה-roll off בטקסט שקדם להיצמדות פפטיד קולגן לתאי זרימה, ביטוי וניקוי של פפטיד הקולגן וחלבון MMP one. התחל בהוספת תמיסת נוגדן anti mic לתא הזרימה והדגר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לאפשר ל-anti mic להיצמד לפני השטח של תא הזרימה; חסום את תא הזרימה כדי למנוע היצמדות לא ספציפית של חלבונים באמצעות 5 mg/mL BSA. הוסף 150 pM פפטיד קולגן ואפשר לו להיצמד לנוגדן באמצעות תג M ttag למשך 45 דקות.שטפו את עודפי הקולגן באמצעות בופר PBS לפני הוספת חרוצים בגודל 2.8 µm לתא הזרימה. יש להפרידם מהתמיסה של ה-strep divid והחרוצים המצופים באמצעות מגנטים חזקים, ולאחר מכן לתלה אותם מחדש ב-PBS. יש לחזור על תהליך זה שלוש פעמים.שלב זה חיוני כדי לגרום לחרו지를 בגודל 2.8 micrometer להיקשר לפפטיד קולגן המקובע על פני השטח. לאחר מכן, הוסף חרוזים סופר-פרמגנטיים מצופים בstreptavidin ואפשר להם להיקשר למולקולות הקולגן למשך 45 דקות. לאחר הרכבת תא הזרימה עם פפטיד הקולגן והחרוזים המגנטיים, בצע הדמיה של תא הזרימה במלכודת המגנטית.תחת כוח נמוך, תת-אוכלוסייה של חרו지를 היא לעיתים חלשה, ונדבקת למשטח באופן לא ספציפי. הפעלת כוח מתון מבטיחה שחרוזים אלו ישוחררו. הוסף אנזים מופעל לתא הזרימה.במקרה זה, MMP 1 הופעל מראש על ידי הוספת 3.5 mM PMA ודגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות. מיד עם החזרת תא הזרימה למכשיר הפינצטות המגנטיות, הקליטו וידאו המקיף מספר שדות ראייה, שבדרך כלל יניב כמה מאות חרוזיים קשורים. מדידה זו תואמת לזמן שווה ל-0.חזור על אותו תהליך של הקלטת מספר שדות ראייה בנקודות זמן קבועות עד שכל החרו지를 ניתקים או עד שלא ניתן להבחין בפרוטאוליזה נוספת. הפינצטה המגנטית כויילה עבור חרוזים של 1 µm ו-2.8 µm. באמצעות גודל התנודות הברוניאניות שנצפו וחישוב תדר ה-roll-off במיקומים משתנים של המגנט בניסויי הפרוטאוליזה הכפויה, ניתן לשרטט את מספר החרוזים שנותרו בנורמליזציה כפונקציה של זמן כדי למצוא את קצב הפרוטאוליזה.ניתן לחזור על תהליך זה עבור ריכוזי אנזימים וכוחות משתנים. קצבי הפרוטאוליזה תלויים בכוח המופעל. קצבי הפרוטאוליזה נקבעו עבור 1 pN, 6.2 pN ו-13 pN.חלקם של החרוזים שלא נפתחו לאחר יותר מ-15 דקות נשאר קבוע בקירוב על 0.25 בניסויים שונים. במקרה שלנו, הבדיקה אפשרה לנו למדוד את היעילות הקטליטית של MMP1 כפונקציה של הכוח המופעל. מניתוח הנתונים מצאנו כי סליל השלשה של הקולגן חייב להיפתח מקומית לפני הפרוטאוליזה.ברגע שהטכניקה תשלט, ניתן לבצעה תוך חמש עד שש שעות אם היא מבוצעת כהלכה. חשוב לזכור כי נדרשים לפחות 30 עד 50 חרוצים לשדה ראייה כדי להשיג מובהקות סטטיסטית טובה של הנתונים. אין לשכוח כי PMA עלול להיות מסוכן ביותר, ויש להשתמש תמיד באמצעי זהירות כגון כפפות, חלוקי מעבדה ומסכות פנים במהלך ביצוע ניסוי זה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למדוד את השפעת כוח על פירוק פרוטאוטי של חלבונים בודדים באמצעות פינצטות מגנטיות. הפינצטות המגנטיות הן כלי מצוין להבנת ניסויים ביופיזיקליים של מולקולות בודדות. ניתן להרחיב טכניקה זו לשילובים אחרים של פרוטאזות ותסריטים.בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקות דומות כדי להבין את הדינמיקה המבנית של חלבונים, וכן כדי להבין חלבונים אחרים נקשרים ל-RNA ו/או DNA או משנים אותם.

multiplexed-single-molecule-force-proteolysis-measurements-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פינצטה המגנטית, טכניקת מניפולציה מולקולה בודדת חזקה, יכולה להיות מותאמת למדידות הישירות של טוויסט (שימוש בתצורה הנקראת באופן חופשי, המקיף פינצטה המגנטית) ומומנט (באמצעות תצורה כינתה פינצטה מומנט מגנטי) במקרומולקולות ביולוגיות. הנחיות לביצוע מדידות כאלה מקבלות, כוללים יישומים למחקר של ה-DNA וחוטי Nucleo-חלבון קשורים.

מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט

פלטפורמה פינצטה מגנטי יחיד מולקולה לתמרן G-quadruplexes מדווח, מה שמאפשר לחקר G4 יציבות ורגולציה על חלבונים שונים.

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

שיטה מקבילה מאוד למדידת המחשוף הספציפי לאתר של ה-DNA ברמת מולקולה אחת מתוארת. פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה באמצעות ההגבלה אנדונוקלאז Nde. ניתן לשנות את השיטה בקלות כדי ללמוד כל תהליך שתוצאות מחשוף DNA ספציפי לאתר.

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה ניסיונית מלאה לחקר אינטראקציות חלבון RNA באמצעות פינצטה אופטית. מספר הגדרות ניסיוניות אפשריות מתארות כולל שילוב של פינצטה אופטית עם מיקרוסקופיה קונפוקלית.

פינצטה אופטית לחקר אינטראקציות בין RNA לחלבון בוויסות התרגום

ביוכימיה חזותית של מולקולה בודדת הנחקרת באמצעות תאים מיקרופלואידיים מקלה מאוד באמצעות קנה זכוכית, מזרקים אטומים לגז, חיבורים יציבים של צינורות לתאי זרימה, וחיסול בועות על ידי הצבת שסתומי מיתוג בין המזרקים והצינורות. הפרוטוקול מתאר מלכודות אופטיות כפולות המאפשרות הדמיה של עסקאות דנ"א ואינטראקציות בין-מולקולריות.

שימוש בפינצטה אופטית כפולה ומיקרופלואידיקה למחקרי מולקולות בודדות

במאמר זה אנו מתארים מערך פינצטה מגנטית במהירות גבוהה המבצע מדידות ננו-מכניות על ביומולקולות רגישות לכוח בקצב מרבי של 1.2 קילוהרץ. אנו מציגים את היישום שלה על סיכות ראש DNA וקומפלקסים SNARE כמערכות מודל, אבל זה יהיה ישים גם על מולקולות אחרות המעורבות באירועים מכנוביולוגיים.

פינצטה מגנטית במהירות גבוהה למדידות ננומכניות על אלמנטים רגישים לכוח

פרוטוקול זה מדגים שימוש בפינצטה מגנטית של מולקולה אחת כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים קושרי DNA טלומריים (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] ו-TRF2) לבין טלומרים ארוכים שהופקו מתאים אנושיים. הוא מתאר את שלבי ההכנה לטלומרים ולגורמים קושרים חוזרים טלומריים, ביצוע ניסויים במולקולות בודדות ושיטות איסוף הנתונים וניתוחם.

ניתוח אינטראקציות חלבון-דנ"א טלומריות באמצעות פינצטה מגנטית של מולקולה אחת

אנו מדגימים את השימוש בפינצטה אופטית צירית קבועה כוח כדי לחקור את התכונות המכאניות של מולקולות דנ"א קצרות. על ידי מתיחת DNA axially, אנחנו למזער מכשולים וממצאים שמקורם במניפולצית רוחב קונבנציונלית סטריים, ומאפשרים לנו לחקור מולקולות דנ"א קצרה כמו ~ 100 ננומטר.

מתיחת רצפים קצרים של DNA עם פינצטה חיל הצירי האופטית קבועה

שיטה למדידת אורך ההתמדה או קשיחות כפיפה של biopolymers מתוארת. השיטה משתמשת assay גלישת microtubule kinesin מונע בניסוי כדי לקבוע את אורך ההתמדה של microtubules הבודד וניתנת להתאמה למבחני גלישה יקטין מבוססים.

מדידות קשיחות כפיפה של Biopolymers שימוש במבחני דאייה

צלולוזומים הם קומפלקסים מולטי-אנזימים המיועדים לעיכול תאית. SMFS מבוסס AFM שימש לחקר התכונות המכניות ותצורת הקיפול של מכלולי חלבון הקשורים לתאית. אנו מציגים זרימת עבודה מלאה לקיבוע חלבונים, רכישת נתונים וניתוח נתונים כדי לחקור את האינטראקציות של קומפלקסים בודדים של קולטנים-ליגנדים המעורבים בהרכבת תאית.

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

חקור את השפעת העומס המכאני על פרוטאוליזה ברמת מולקולה בודדת באמצעות מלקטות מגנטיות. שיטה זו מאפשרת מדידת קינטיקה אנזימטית בקולגן עם יעילות גבוהה ועלות נמוכה.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

גלה סרטונים נוספים