מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את השפעת העומס המכני על המחשוף הפרוטאוליטי של חלבונים בודדים בצורה מקבילה וחסכונית ביותר. בהדגמה זו, המחשוף של קולגן על ידי מטריקס מטאלופרוטאינאז אחד נבדק בשלב הראשון, גוזמי קולגן מחוברים לכיסוי הזכוכית של תא זרימה, ואחריו הצמדת חרוזים מגנטיים בגודל מיקרומטר למולקולות הקולגן הבודדות. השלב השני הוא הרכבת תא הזרימה למנגנון הפינצטה המגנטית ולבדוק שחרוזים שאינם מחוברים במיוחד הוסרו ממשטח החלקת הכיסוי.

לאחר מכן, הפרוטאז מתווסף לתאי הזרימה. השלב האחרון הוא קביעת קצב הפרוטאוליזה על ידי ניטור ניתוק החרוזים בזמן אמת. על ידי מדידת שיעורי ניתוק חרוזים בריכוזים וכוחות פרוטאז משתנים, ניתן לגזור פרמטרים קינטיים זואולוגיים סטנדרטיים באמצעות כמויות זעירות של סובסטרט ופרוטאז.

בנוסף, טכניקה זו מספקת מידע ייחודי על השפעת הכוח המכני על קצב הפרוטאוליזה ועל השינויים המבניים בחלבון הסובסטרט הנלווים למחשוף. היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות אחרות כמו עקבות T אופטיים ומיקרוסקופ כוח אטומי, הוא שטכניקה זו היא תפוקה גבוהה וחסכונית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הכוח האפקטיבי על המחשוף הפרוטאוליטי של חלבונים בודדים, ניתן ליישם את המכשור והטכניקות על מגוון רחב של בעיות ביופיזיקליות, כולל השפעת הכוח על קיפול ואישור חלבונים.

התחל בהכנת תאי זרימה על ידי ניקוי החלקות כיסוי באמצעות סוניקציה. הוסף את פתקי הכיסוי למיכל זכוכית קטן המסוגל להחזיק אותם שמתאים לטור. מלאו את המיכל באיזופרופנול וסוניקט באמבטיה למשך 20 דקות, האיזופרופנול ושטפו את הכיסוי מחליק בכמויות גדולות של מים נטולי יונים.

מלאו את המיכל במים וסוניקטו למשך 20 דקות. לאחר ייבוש סוניקציה, הכיסוי מחליק בזרם של אוויר מסונן, נטול אבק. בדוק את פתקי הכיסוי והשתמש רק באלה הנקיים מכתמים.

הבהבו בעדינות את החלקות הכיסוי למשך מספר שניות כדי לנקות אותם מכל אבק ולחות שנותרו על ידי העברת המכסה. מחליק דרך להבת גז המיוצרת על ידי מבער בונסן ומקפיד לא לעוות את החלקת הכיסוי בגלל עודף חום. שלב זה מסיר מזהמי שטח שיוריים.

לאחר מכן, השתמש בסקוטש דו צדדי כדי לחבר את שני החלקות הכיסוי יחד. על ידי חיתוך הקלטת תחילה באורך של כשלושה סנטימטרים ורוחב של 0.3 סנטימטרים, חבר את הקלטת לגלישת כיסוי בגודל 22 על 40 מילימטר, והשאיר תעלה של 1.6 סנטימטר באמצע. השתמש בקצה פיפטה כדי ללחוץ בעדינות כלפי מטה על החלקת הכיסוי כדי לוודא שהסרט נדבק כהלכה.

מכשיר הפינצטה המגנטית נבנה על ידי מעבדה זו באמצעות תושבת L מאלומיניום עם חור סיכה בקוטר מילימטר אחד והותקן על מתרגם Z אנכי כדי לווסת את גובה הפינצטה. שני מגנטים קבועים של אדמה נדירה חוברו לתושבת משני צידי החור כדי ליצור את שיפוע השדה המגנטי. כיול נכון של המלכודת המגנטית חיוני להליך זה.

כדי להבטיח הצלחה, אנו משתמשים בשתי שיטות שונות כמתואר בסעיף זה. כדי לכייל את המלכודת המגנטית לכיול השתמש ב-DNA שהוכן בעבר מפאג' למבדה המסומן בחמשת הקצוות הראשוניים ושלושת הקצוות הראשוניים שלו עם ביוטין וחמצן כמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי לחבר את ה-DNA לתא הזרימה תחילה, מלאו את תא הזרימה בחמצן אנטי-D ובתמיסת נוגדנים ואפשרו לנוגדנים להיצמד למשטח הזכוכית למשך 15 דקות.

לאחר מכן, אכל את פני תא הזרימה כדי למנוע הדבקה לא ספציפית של DNA על ידי הוספת תמיסת BSA לתא הזרימה. שים לב שעבור שלב זה וכל השלבים הבאים, נפח המגיב שנוסף לתא הזרימה צריך להיות לפחות כפול. נפח תא הזרימה, שבהדגמה זו הוא 75 מיקרוליטר, דוגר את תא הזרימה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.

לאחר חזרה על שלב זה, הוסף 50 פיקו טוחנת של DNA למבדה פונקציונלי ואפשר לו להיצמד להחלקת הכיסוי למשך 15 דקות, לשטוף עודפי DNA עם XPBS אחד. לבסוף, הוסיפו חרוזים סופר פרמגנטיים מצופים סטרפטווידין ואפשרו להם להיצמד ל-DNA המשותק למשך 15 דקות. בהדגמה זו משתמשים בחרוזים של 2.8 מיקרומטר.

שטפו עודפי חרוזים עם XPBS אחד. לאחר מכן, בצע כיול פינצטה מגנטית על ידי הזזת המגנטים הקבועים למיקום רחוק ממשטח הדגימה. לאחר מכן הניחו את תא הזרימה המוכן במיקרוסקופ.

הזז את המגנטים הקבועים למקומם מעל תא הזרימה. בחר את מישור המוקד של חרוזים פונקציונליים של Lambda DNA על ידי התמקדות בחרוזים הרחק משני משטחי הזכוכית. מישור המוקד הנכון הוא כזה שבו לחרוזים הרצויים יש מרכז בהיר.

צלם סרטון של תנועת חרוזים ש -80 הרץ גדולים יותר עבור 500 פריימים. קרב את המגנט למשטח הדגימה והקלט סרטון של תנועת החרוזים בכל מיקום. למרחקים מעבר לחמישה מילימטרים, יש לנוע במרווחים של מילימטר אחד למרחקים שבין מילימטר אחד לחמישה מילימטרים.

לנוע במרווחים של 0.5 מילימטר למרחקים של פחות ממילימטר אחד, לנוע במרווחים של 0.25 מילימטר עבור כל מערך נתונים, עקוב אחר מרכז החרוזים באמצעות התאמה גאוס דו-ממדית. חישוב הכוח באמצעות תנודות בראונות כמתואר בנוהל הכתוב. אשר את דיוק הכוחות על ידי בדיקת חישוב הכוח באמצעות ספקטרום הספק Lian fit.

על מנת למצוא את תדירות הגלגול, ניתן למצוא את הקשר בין כוח מופעל לתדירות הגלגול בטקסט לפני חיבור פפטיד הקולגן לתאי זרימה, לבטא ולטהר את פפטיד הקולגן וחלבוני MMP one. התחל בהוספת תמיסת הנוגדן נגד מיקרופון לתא הזרימה ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לאפשר לאנטי מיקרופון להיצמד לפני השטח של תא הזרימה, אכל את תא הזרימה כדי למנוע התקשרות לא ספציפית של חלבונים באמצעות חמישה מיליגרם למיליליטר. BSA הוסף 150 פפטיד קולגן פיקומולר ואפשר לו להיצמד לנוגדנים דרך M ttag למשך 45 דקות.

שטפו עודפי קולגן באמצעות מאגר PBS לפני הוספת חרוזים של 2.8 מיקרומטר לתא הזרימה. יש להפריד אותם מתמיסת החרוזים המצופה והסטרפטוקוקוס באמצעות מגנטים חזקים, ולאחר מכן להשעות אותם מחדש ב-PBS. יש לחזור על תהליך זה שלוש פעמים.

שלב זה חיוני כדי לגרום לחרוזים בגודל 2.8 מיקרומטר להיקשר לפפטיד קולגן משותק על פני השטח. לאחר מכן, הוסיפו חרוזים סופר פרמגנטיים מצופים סטרפטווידין ואפשרו להם להיצמד למולקולות הקולגן למשך 45 דקות. לאחר שתא הזרימה מורכב עם פפטיד קולגן וחרוזים מגנטיים, דמיין את תא הזרימה במלכודת המגנטית.

בכוח נמוך, תת-אוכלוסייה של החרוזים היא לפעמים חלשה, מודבקת לפני השטח בצורה לא ספציפית. הפעלת כוח צנוע מבטיחה שהחרוזים הללו ישוחררו. הוסף אנזים פעיל לתא הזרימה.

במקרה זה, MMP 1 הופעל מראש על ידי הוספת 3.5 מילי-מולרי A PMA והודגר ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. ברגע שתא זרימה מוכנס מחדש למנגנון הפינצטה המגנטית, הקלט סרטון המשתרע על פני כמה שדות ראייה, בדרך כלל מניב כמה מאות חרוזים מחוברים. מדידה זו תואמת לזמן שווה לאפס.

חזור על אותו תהליך של רישום מספר שדות ראייה בנקודות זמן קבועות עד שכל החרוזים מתנתקים או שלא ניתן להבחין בפרוטאוליזה נוספת. פינצטה מגנטית כוילו לחרוזים של מיקרומטר אחד ו-2.8 מיקרומטר. באמצעות גודל התנודות הבראוניות שנצפו וחישוב תדירות הגלגול במיקומי מגנט משתנים בניסויי הפרוטאוליזה הכפויה, ניתן לשרטט את המספר המנורמל של החרוזים שנותרו כפונקציה של זמן למציאת קצב הפרוטאוליזה.

וניתן לחזור על תהליך זה עבור ריכוזי אנזימים וכוחות משתנים. שיעורי הפרוטאוליזה תלויים בכוח המופעל. שיעורי הפרוטאוליזה נקבעו בפיקו ניוטון אחד, 6.2 פיקו ניוטון ו-13 פיקו ניוטון.

חלק החרוזים הלא פרו נמצא ביותר מ-15 דקות, נשאר קבוע בערך ב-0.25 בניסויים שונים. במקרה שלנו, הבדיקה אפשרה לנו למדוד את היעילות הקטליטית של MMP 1 כפונקציה של כוח מופעל. על ידי ניתוח הנתונים, מצאנו כי הסליל המשולש של הקולגן חייב להירגע באופן מקומי לפני פרוטאוליזה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש עד שש שעות אם היא נעשית כהלכה. חשוב לזכור שנדרשים לפחות 30 עד 50 חרוזים לכל דלק של נוף כדי לקבל מובהקות סטטיסטית טובה של הנתונים שלך. אל תשכח ש-PMA יכול להיות מסוכן ביותר ותמיד יש להשתמש באמצעי זהירות כגון כפפות, מעילי מעבדה ומסכת פנים בעת ביצוע ניסוי זה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את השפעת הכוח על מחשוף פרוטאוליטי של חלבונים בודדים באמצעות פינצטה מגנטית. הפינצטה המגנטית היא כלי נהדר להבנת ניסויים ביופיזיקליים של מולקולה בודדת. ניתן להרחיב טכניקה זו לשילובי פרוטאז ומצע אחרים.

בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקות דומות להבנת הדינמיקה המבנית של חלבונים וכן להבנת חלבונים אחרים הנקשרים או משנים RNA ו/או DNA.