Name: חזותי neuroblast cytokinesis במהלך ג elegans עובר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-12T18:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: למד לצפות בחלוקת נוירובלסטים בעוברי Caenorhabditis elegans באמצעות מיקרוסקופיית שדה רחב וקונפוקלית. שיטה זו מאפשרת לחקור את תפקיד הגנים בחלוקת תאים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר בכך שעבודה זו נתמכה על ידי למדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה מענק (NSERC).

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Sequencing+Consortium.+Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li>
<li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worming+secrets+from+the+C.+elegans+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Worming secrets from the C. elegans genome.</a> Science. 282, 1972-1974 (1998).</li>
<li>Tabara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rde-1+gene%2C+RNA+interference%2C+and+transposon+silencing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans.</a> Cell. 99, 123-132 (1999).</li>
<li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChisholm%2C+AD+%22Epidermal+morphogenesis.+WormBook.+The+C.+elegans+Research+Community%22">Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community</a>. , 1-22 (2005).</li>
<li>Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+morphogenesis%3A+how+multiple+cells+cooperate+to+generate+a+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).</li>
<li>Kiehart, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing%3A+the+power+of+the+purse+string%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound healing: the power of the purse string.</a> Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).</li>
<li>Ikegami, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+and+Eph+receptor+signaling+guide+a+series+of+cell+movements+for+ventral+enclosure+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans.</a> Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).</li>
<li>Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ephrin+VAB-2%2FEFN-1+functions+in+neuronal+signaling+to+regulate+epidermal+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Cell%22%5BJournal%5D)">The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans.</a> C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).</li>
<li>Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Ephrins+Control+Cell+Organization+in+C.+elegans+Using+Kinase-Dependent+and+-Independent+Functions+of+the+VAB-1+Eph%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph.</a> Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).</li>
<li>Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+divergent+C.+elegans+ephrin+EFN-4+functions+in+embryonic+morphogenesis+in+a+pathway+independent+of+the+VAB-1+Eph+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor.</a> Development. 129, 5499-5510 (2002).</li>
<li>Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VAB-1+Eph+receptor+tyrosine+kinase+and+SAX-3%2FRobo+neuronal+receptors+function+together+during+C.+elegans+embryonic+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Development. 132, 3679-3690 (2005).</li>
<li>Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-40%2FDCC%2C+SAX-3%2FRobo%2C+and+VAB-1%2FEph+polarize+F-actin+during+embryonic+morphogenesis+by+regulating+the+WAVE%2FSCAR+actin+nucleation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex.</a> PLoS Genet. 8, (2012).</li>
<li>Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis%3A+welcome+to+the+Rho+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis: welcome to the Rho zone.</a> Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).</li>
<li>Piekny, A. J., Maddox, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myriad+roles+of+Anillin+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The myriad roles of Anillin during cytokinesis.</a> Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).</li>
<li>Zhao, W. M., Fang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin+is+a+substrate+of+anaphase-promoting+complex%2Fcyclosome+%28APC%2FC%29+that+controls+spatial+contractility+of+myosin+during+late+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis.</a> J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).</li>
<li>Piekny, A. J., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin+is+a+scaffold+protein+that+links+RhoA%2C+actin+and+myosin+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis.</a> Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).</li>
<li>Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+control+of+anillin+behavior+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).</li>
<li>Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuerr%2C+JS+%22Immunohistochemistry.+WormBook%2C+The+C.+elegans+Research+Community%22">Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community</a>. , 1-61 (2006).</li>
<li>Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+two+C.+elegans+anillins+in+the+gonad+and+early+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo.</a> Development. 132, 2837-2848 (2005).</li>
<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).</li>
<li>Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+of+the+worm%3A+genetics+of+epidermal+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans.</a> Trends Genet. 16, 544-551 (2000).</li>
<li>Zhang, H., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+mechanical+inputs+%E2%80%93+a+coordinated+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling through mechanical inputs – a coordinated process.</a> J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).</li>
<li>Guenther, C., Garriga, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+the+C.+elegans+HAM-1+protein+in+neuroblasts+enables+daughter+cells+to+adopt+distinct+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates.</a> Development. 122, 3509-3518 (1996).</li>
<li>Audhya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+containing+the+Sm+protein+CAR-1+and+the+RNA+helicase+CGH-1+is+required+for+embryonic+cytokinesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans.</a> J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).</li>
<li>Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin+and+the+septins+promote+asymmetric+ingression+of+the+cytokinetic+furrow%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow.</a> Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).</li>
<li>Dorn, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tube+formation+in+polar+body+cytokinesis+requires+Anillin+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans.</a> Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).</li>
<li>Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בסוגים שונים של מיקרוסקופ לחלוקות תא תמונה במהלך אמצע העובר. בפרט, פרוטוקול זה מדגיש עד כמה לתמונת חלוקת neuroblasts, תאים שעשויים להקל המורפוגנזה אפידרמיס. תקשורת בין התאים חשובה להיווצרות רקמה במהלך פיתוח מטזואניים וג elegans הוא מודל מצוין ללמוד היווצרות רקמה בגוף חי. אירוע אחד שמתאר בצורה יפה את משחק הגומלין של רקמות הוא המורפוגנזה אפידרמיס, אשר מכסה את העובר בשכבה של תאי האפיתל. בפרט, מתחם הגחון הוא התהליך שבו תאי האפידרמיס הגחון ל...

אמנם יש פרוטוקולים המתארים כיצד לחלוקת תא תמונה בתחילת ג עובר elegans, פרוטוקול זה מתאר כיצד חלוקת תא תמונה בתוך רקמות במהלך אמצע העובר. אחד האתגרים הגדולים בתחום ההדמיה אורגניזמים במהלך הפיתוח היה רגישותם לphototoxicity. עם זאת, נגישות מוגברת למיקרוסקופי confocal הדיסק מסתובב או מיקרוסקופים שדה סחפו התירה יישומי הדמיה נפוצים יותר. שני מערכות משתמשות בלייזרים של מצב מוצקים ואור מפוזר, המגבילים את הרמות של UV שאורגניזמים נחשפים אליהן. עם זאת, דוכני Widefield עדיין יכולים לשמש הדמיה in vivo, במיוחד אם הם לבוש עם מצלמות עם רגישות גבוהה (למשל EMCCD), בקרת צמצם ושליטה אור (למשל נוריות או נורות כספית להתאמה). פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש באחת מערכת confocal מבוסס או מערכת widefield לחלוקת תא תמונה בתוך פיתוח ג elegans &lt;/ Em&gt; עוברים. כדוגמא, נתאר כיצד תמונת חלוקת תא neuroblast. Neuroblasts עשויה להקל המורפוגנזה אפידרמיס על ידי מתן אותות כימיים או מכאניים לתאי האפידרמיס שמעליה, ומספקת דוגמא מצוינת לחשיבות של תקשורת בין תאית ביצירת רקמות. elegans Caenorhabditis הוא אורגניזם מודל אידיאלי למחקרים מבוססי מיקרוסקופיה בשל השקיפות שלה וארגון של רקמות פשוטות 1. יתר על כן, ג elegans ניתן לשיטות גנטיות וRNAi, ומאז יש לי רבים מהגנים שלו homologues האנושי, זה יכול לשמש כדי לזהות מנגנוני שימור להיווצרות רקמת 2-5. בג elegans, היווצרות של האפידרמיס מתרחש במהלך אמצע העובר, כאשר לעובר&gt; 300 תאים. המורפוגנזה עוריות מורכבת מכמה שלבים עיקריים, שבמהלכו העובר מוקף בשכבה של תאי האפידרמיס שלהצר ולהרחיב להפוך embrיו מצורת ביצה לצורה המוארכת של תולעת 6. מתחם הגחון מתאר את אחד אירועי morphogenetic אלה, כאשר תאי האפידרמיס הגחון נודדים לכיוון קו האמצע הגחון כדי לכסות את פני השטח הגחון של העובר (איור 1). ראשית, שני זוגות של תאים החדשניים קדמי ממוקם נודדים לכיוון קו אמצע הגחון, שבו הם דבקים והפתיל עם שכניהם נגדי 6. זה ואחריו הגירה של תאי כיס האחוריים ממוקם, המהווים טריז כמו צורות יצירת כיס הגחון 6-7. המנגנון שסוגר את הכיס אינו מובן היטב. אפשרות אחת היא שמבנה התכווצות שרירן אקטין supracellular קושר את תאי הכיס יחד במחרוזת ארנק כמו אופנה, בדומה לריפוי פצעים 8. מעניין לציין, כי הגירתם של חלק מתאי הכיס מתווכת על ידי תת ספציפי של neuroblasts בסיס 9 (מבשרי נוירונים שנמצאים מתחת לepidermis; איור 1). מחקרים קודמים הראו כי neuroblasts לווסת את הגירת הגחון אפידרמיס תא ומתחם הגחון. VAB-1 (קולט ephrin) ו( יגנד ephrin) VAB-2 באים לידי ביטוי מאוד בneuroblasts ולהקל על מיון הקדמי והאחורית neuroblasts אחד מהשני, ו מוטציות במתחם הגחון סיבת VAB-1 או VAB-2 פנוטיפים 10-13. עם זאת, ניסויי הצלת אמרגן הראו כי VAB-1 נדרש גם בתאים שמעל הגחון אפידרמיס וקולטנים לאותות הנחיה אחרים מופרשים על ידי neuroblasts באים לידי ביטוי בתאי האפידרמיס הגחון 9. למרות שמוטציות בכל של קולטנים אלה גורמים לפנוטיפים מתחם הגחון, שלא ברור אם פגמים להתעורר עקב בעיות במיקום neuroblast או עקב כישלון של תאי האפידרמיס הגחון להגיב להדרכת רמזי 14. לשנות את חלוקת wi neuroblastsגם בלי להשפיע על היכולת שלהם להפריש רמזי הדרכה יכול לשפוך אור על התפקיד של neuroblasts והיכולת שלהם לספק קלט מכאני במהלך המורפוגנזה אפידרמיס. לאחרונה, נמצא כי גן חלוקת תא, ani-1 (anillin) מתבטא מאוד בneuroblasts (איור 2 א) ודלדולה גורם למומי חלוקת neuroblast. מעניין לציין, כי העוברים האלה להציג פנוטיפים מתחם הגחון (Fotopoulos, Wernike וPiekny, תצפיות לא פורסמו). Anillin נדרש לחלוקת תאים, ובמיוחד עבור cytokinesis, המתאר את התהליך שבו תא האם מחלק פיזי לשני תאים בת. Cytokinesis הוא מונע על ידי היווצרות של טבעת התכווצות actomyosin, אשר צריך להיות מבוקר היטב בחלל ובזמן כדי לוודא שהוא מצמידים כראוי עם הפרדה chromatid האחות. הרגולטור הראשי של cytokinesis מטזואניים הוא RhoA (RHO-1 ב C. elegans), GTPase קטן שהואctive בצורה מאוגד GTP. GEF Ect2/ECT-2 מפעיל RhoA, לאחר שRhoA-GTP אינטראקציה עם effectors מורד הזרם היוצרות את טבעת ההתכווצות ולתווך ingression 15. Anillin הוא חלבון תחום רב שנקשר לRhoA באמצעות C-הסופית שלה ויקטין ומיוזין באמצעות N-הסופית שלה. Anillin נדרש כדי לייצב את עמדתה של טבעת ההתכווצות בתאי יונקים או דרוזופילה S2 16. דלדול Anillin גורם טבעות התכווצות לעבור תנודות לרוחב, וסופו של דבר נכשל cytokinesis יוצר תאים multinucleate 17-19. מעניין לציין, כי למרות שג elegans ani-1 מתאם את התכווצות actomyosin בעובר המוקדם, זה לא חיוני לcytokinesis. עם זאת, כפי שתואר לעיל, נדרש ani-1 לcytokinesis neuroblast במהלך אמצע העובר (Fotopoulos, Wernike וPiekny, תצפיות לא פורסמו). כישלון cytokinesis ישנה את המספר והמיקום של neuroblasts ועלול להשפיע על locע אותות הנחיה כימיים, או שזה יכול לשנות את התכונות מכאניות של הרקמות. שני הדגמים להדגיש את תפקיד nonautonomous של neuroblasts למתחם הגחון, ואת החשיבות של תקשורת רקמות רקמות במהלך התפתחות עוברית. פרוטוקול ניסוי זה מתאר כיצד חלוקת תא תמונה במהלך ג elegans אמצע עובר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. רוב ניסויי חקר המנגנונים של חלוקת תא בוצעו בתאים בודדים בתוך מנות תרבות (למשל. הלה או תאי S2) או בעוברים מוקדמים עם מספר מוגבל של תאים (לדוגמא C. elegans עובר אחד תאים, Xenopus, או echinoderm עוברים). עם זאת, חשוב גם ללמוד חלוקת תאים בתוך רקמות, שכן יש רמזים חיצוניים שיכול להשפיע על העיתוי ומיקום של מטוס החטיבה. יתר על כן, תאים עשויים לספק רמזים כימיים או מכאניים כדי להשפיע על ההתפתחות של רקמה השכנהים, וזה חשוב להבין כיצד תקשורת בין תאית מסייעת רקמות כדי ליצור במהלך פיתוח.

<table><tbody><tr><td>אגר</td><td>ביושופ קנדה בע"מ</td><td>#AGR001.1</td><td>להכנת לוחות C. elegans NGM ו-RNAi Agar</td></tr><tr><td></td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#9002-18-0</td><td>להכנת חיידקים צלחות אגר LB</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר Alexa Fluor 488 נוגדן</td><td>Life Technologies Corporation (Invitrogen)</td><td>#A11029</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד עכבר נגד GFP</td><td>Roche Applied Science</td> <td>#11814460001</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-ארנב Alexa Fluor 568 נוגדן</td><td>Life Technologies Corporation (Invitrogen)</td><td>#A11011</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#AMP201.5</td><td>אחסן אבקה בטמפרטורה של 4 מעלות; C ואמפיצילין מומס ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>בקטופטון&nbsp; (פפטון-א')</td><td>ביו בייסיק בע"מ</td><td></td><td></td>#G213</tr><tr><td>CaCl2 (סידן כלורי)</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#C302.1</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>ביושופ קנדה בע"מ</td><td>#CHL380.25</td><td>להתמוסס באתנול</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>#D9542</td><td>השתמש לצביעה של חומצות גרעין (DNA)</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>ביושופ קנדה בע"מ.</td><td>#GLY001.1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (איזופרופילתיו-ובטא;-גלקטוזיד)</td><td>ביו בייסיק בע"מ</td><td>#367-93-1</td><td>יש לאחסן אבקה ו-IPTG מומס בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>KH2PO4 (אשלגן פוספט, מונובסיס)</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#PPM666.1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (אשלגן פוספט, דו-בסיסי)</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#PPD303.1</td><td></td></tr><tr><td>L4440&nbsp; (וקטור הזנה)</td><td>Addgene</td><td>#1654</td><td>יש לשמור כמלאי גליצרול בטמפרטורה של -80 מעלות; C</td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp; &nbsp; (מגנזיום גופרתי)</td><td>ביושופ קנדה בע"מ</td><td>#MAG511.500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (נתרן כלורי)</td> <td>ביו בייסיק בע"מ</td><td>#7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (נתרן פוספט, דו-בסיסי)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל (NDS)</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>#035-110</td><td></td></tr><tr><td>n-פרופיל-3,4,5-טריהידרוקסיבנזואט (פרופיל גלאט)</td><td>אלפא אזר</td><td>#A10877</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>#P8920</td><td>לתוצאות מיטביות שקופיות מיקרוסקופ שלוש פעמים&nbsp;</td></tr><tr><td>סטרפטומיצין</td><td>ביושופ קנדה בע"מ</td><td>#STP101.50</td><td>אחסן אבקה בטמפרטורה של 4 מעלות; C וסטרפטומיצין מומס ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>טטרציקלין</td><td>ביושופ קנדה בע"מ</td><td>#TET701.10</td><td>אחסן אבקה בטמפרטורה של 4 מעלות; C וטטרציקלין מומס ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ביו בייסיק בע"מ</td><td>CAS#9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>ביושופ קנדה בע"מ</td><td>#TRP402.500</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>ביו בייסיק בע"מ</td><td>#8013-01-2</td><td></td></tr></tbody></table>

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי לתמונת חלוקת תאים בתוך פיתוח עוברי elegans Caenorhabditis. בפרט, פרוטוקול זה מתמקד איך תמונת חלוקת neuroblasts, אשר נמצאים מתחת לתאי האפידרמיס ועשוי להיות חשוב עבור המורפוגנזה אפידרמיס. היווצרות רקמה חיונית לפיתוח מטזואניים ומסתמכת על רמזים חיצוניים מרקמות שכנות. ג elegans הוא אורגניזם מודל מצוין ללמוד המורפוגנזה רקמות in vivo בשל השקיפות שלה וארגון פשוט, מה שהופך את הרקמות שלה קלים ללמוד באמצעות מיקרוסקופ. מתחם הגחון הוא התהליך שבו פני השטח הגחון של העובר הוא מכוסה על ידי שכבה אחת של תאי האפיתל. הוא חשב את האירוע הזה כדי להיות בהנחייתם של neuroblasts הבסיסית, המספק רמזי הדרכה כימית לתווך הגירה של תאי האפיתל שמעליה. עם זאת, neuroblasts הן שגשוג מאוד וגם עשויה לפעולכמצע מכאני לתאי האפידרמיס הגחון. מחקרים באמצעות פרוטוקול ניסוי זה יכול לחשוף את חשיבותה של תקשורת בין תאית במהלך היווצרות רקמות, ויכולים לשמש כדי לחשוף את תפקידם של גנים הקשורים בחלוקת תאים בתוך רקמות מתפתחות.

פרוטוקול ניסוי זה מתאר כיצד חלוקת תאי תמונה בג elegans עוברים במהלך אמצע העובר. בפרט, היא מתארת ​​כיצד neuroblasts תמונה, אשר עשוי להקל המורפוגנזה אפידרמיס. המורפוגנזה עוריות מתרחשת עקב שילוב של שינויי צורת תא אפידרמיס, הגירה והידבקות, אלא גם מסתמך על אותות כימיים או מכאניים מneuroblasts הבסיס (איור 1). Neuroblasts מפרישות רמזי הדרכה שקבלו על ידי קולטנים על פני השטח של תאי האפידרמיס הגחון, המסדיר 10,14,25 ההגירה שלהם. יתר על כן, neuroblasts הן ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה בעוברי elegans Caenorhabditis. בעוד כמה פרוטוקולים מתארים כיצד חלוקת תאי תמונה בעובר המוקדם, פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה מתפתחת במהלך embryogenesis אמצע סוף.

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לצפות בתאים המתחלקים בתוך רקמה מתפתחת במהלך האמבריוגנזה של *C. elegans*. על מנת לחקור גנים השולטים בחלוקת תאים, הדבר מושג על ידי יצירה או השגה של זן *C. elegans* המבטא באופן יציב סמנים טרנסגניים המסמנים את התאים הרלוונטיים. כשלב שני, יש לבצע השתקה סלקטיבית (knock down) של גן מטרה על ידי האכלת זחלים בשלב L4 ב-dsRNA למשך 24 עד 48 שעות.עוברים של RNAI נאספים מחרמודיטים גרפיים ומועברים למצע ארוס (aros pad) לצורך דימות חי. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופיית שדה רחב או מיקרוסקופיה קונפוקלית, מדממים את העוברים כדי להדמיש פנוטיפים של חלוקת תאים. התוצאות יראו כיצד נוירובלסטים מתחלקים במהלך האמבריוגנזה של sea elgin, ואת תפקידם של גנים הדרושים לחלוקתם.שיטה זו יכולה לסייע בחשיפת שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית וביולוגיה של התא. לדוגמה, שיטה זו עשויה לחשוף גנים ומנגנוים המעורבים בבקרת המיטוזה במהלך התפתחות רקמות, בתקשורת בין תאים, בנדידה של תאים או בקוטביות של תאים. השתמשו בתולעים טרנסגניות המבטאות את הסמנים המתאימים, שנשמרו בצלחות ביקורת או בצלחות RNAI למשך 24 עד 48 שעות.בחרו ארבעה עד שישה תולעי בוגרים בשלב הגרביד (grave) והעבירו אותם ל-20 עד 30 µL של תמיסת M9 לשקופית בעלת שקעים. כדי לשחרר את העוברים, השתמשו בסקלפל סטרילי וחתכו את התולעים משני צדדי הספרמטקה (spermatheca) או הוולבה (vulva). לאחר מכן, אספו את העוברים באמצעות קפילרה שנמשכה, המחוברת לנבובית שאיבה ורחבה מספיק כדי לאפשר את מעבר העוברים. העבירו את העוברים לפד אגרוז (agarose pad) שהוכן טרי, באמצעות ריס המור 접ק לקיסם שיניים.צרו קבוצות של 5 עד 10 עוברים על ידי דחיפת העוברים זה לצד זה. כסו את התבנית בכיסוי זכוכית והוסיפו עוד M nine buffer במידת הצורך, ולאחר מכן אטמו את כיסוי הזכוכית באמצעות valla נוזלית שחוממה מראש. השתמשו במיקרוסקופ epi fluorescent wide field הכולל מסננים אוטומטיים.עדשות, מצלמת CCD ברזולוציה גבוהה ובמה ממוטרת באופן מלא. הכל נשלט באמצעות תוכנה. למרות שבמערכת זו הם אינם קיימים, שימוש ב-LEDs וב-E-M-C-C-D יגביל את הפוטוטוקסיות לעובר בהגדלה נמוכה.בצעו מיקוד ידני של העובריים לצילום של neuroblast. הגדילו את ההגדלה ובחרו עובריים הנמצאים בשלבי dorsal intercollation או בשלבים מוקדמים של ventral closure במיקרוסקופ השדה הרחב (widefield). בחרו במסנני GFP ו-Texas red וקבעו את מישורי ה-Z האופטימליים במערכת השדה הרחב.שימוש בפחות Z-stacks ובפחות נקודות זמן יפחית את הפוטוטוקסיות; כמו כן, סגירה של המפתח (aperture) ל-30% ובמידת האפשר הפחתה של עוצמת האור יפחיתו עוד יותר את הפוטוטוקסיות. לחלופין, ניתן להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי מסוג live scan swept field או spinning disc עם תוכנה השולטת בלייזרים הסורקים, בעדישות, במצלמת E-M-C-C-D ובבמה ממוטרית ברמה גבוהה. כעת, לאחר שהגדרות הרכישה עברו אופטימיזציה, ניתן לדמות את העובריים במיקרוסקופ שדה רחב (wide field microscope).מומלץ לצלם תחילה עוברים של קבוצת הביקורת לפני צילום עוברים שעברו RNAI. במערכת ה-swept field, הגדירו את לייזרי ה-4 88 וה-5 61 בעוצמה של 100 milliwatt ל-40% power, עם מפתח (slit) של 50 וזמן חשיפה של 300 milliseconds.חשוב לציין כי הגדרות אלו יהיו שונות עבור מיקרוסקופים אחרים. הניחו את הזכוכית על בסיס המיקרוסקופ, ולאחר מכן השתמשו בעדשה אובייקטיבית בעוצמת הגדלה נמוכה כדי לאתר את העוברים. לאחר מכן, עברו לעדשה אובייקטיבית של 60 או 100 x עם טבילת שמן.לאחר קביעת המיקוד, אספו 20 Z stacks במרווחים של 0.2 microns בכל שתי דקות, למשך 10 דקות בסך הכל. סביר להניח שיהיה צורך בכיול של זמן החשיפה. יש להביא בחשבון רעילות פוטונית בעת דימות חי שלווים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, על ידי סגירת הצמצם או בחירה במספר קטן יותר של Zacks או נקודות זמן.הפחתת זמן החשיפה עשויה להגביל את הפוטוטוקסיות במידת האפשר. שימוש בשדה SW או במיקרוסקופ קונפוקלי בעל דיסקה מסתובבת (spinning disc) יכול לסייע בשיפור בעיה זו. קבע את הזמן, הנקודות ומישורי ה-Z הרלוונטיים באמצעות תוכנת הרכישה.ייצאו את התמונות הרצויות כקבצי tiffs מרובים. פתחו את מישורי ה-Z הרצויים עבור כל נקודת זמן וערוץ רלוונטי בתוכנת עיבוד כמו Image J וצרו ערימה (stack), שכן נוירובלסטים משתרעים לרוב על פני מספר מישורים בודדים בלבד. ערמו את מישורי ה-Z עבור כל נקודת זמן וצרו היטלי Z stack.חזור על פעולה זו עבור ערוצים נוספים. לאחר השלמת כל היטלי ה-Zack עבור נקודות הזמן הרצויות, פתח את ההיטלים כדי ליצור רצף זמן. בצע זאת עבור כל ערוץ בנפרד.עבור כל ערוץ, בצע התאמות של הבהירות והניגודיות לפי הצורך. סובב את התמונות במידת הצורך. לאחר מכן, בחר אזור עניין (region of interest) וגזור את התמונות.כעת צרו תמונה ממוזגת באמצעות פונקציית מיזוג הערוצים (merged channels). בחרו צבע שונה עבור כל ערוץ. שמרו את התמונה הממוזגת כקובץ RGB כדי להדמיאן את התמונות בצורה ברורה יותר.השתמשו בתמונות TIFF ב-16 ביט ובחרו בפונקציית ה-invert תחת edit כדי ליצור תמונות בגווני אפור עבור כל ערוץ. כדי לקבוע את גודלו של אובייקט רצוי במיקרונים, שרטטו קו והכפילו את אורכו בגודל הפיקסלים, הנקבע על ידי פרמטרי ההדמיה. כעת, צרו סרגל קנה מידה המייצג פרופורציה מהאורך שחושב במיקרונים.לבסוף, שמרו את התמונות הסופיות כקבצי tiff של שמונה ביטים. במידת הצורך, המירו את קבצי ה-tiff לסרטונים באמצעות ImageJ. מורפוגנזה של האפידרמיס ב-C. elegans מתרחשת עקב שילוב של שינויים בצורת תאי האפידרמיס, נדידה והיצמדות בעזרת נוירובלסטים פרוליפרטיביים שמתחתם.תאי אפידרמיס נודדים לקו האמצע הגחוני ויוצרים שכבה בודדת של תאים. כדי לחקור חלוקה של נוירובלסטים בעוברים, בוצע דימוי של סממן ספציפי לנוירובלסטים המסומן ב-GFP וסממן ממברנה מונע על ידי גורם אימהי המסומן ב-mCherry במהלך הסגירה הגחונית בהגדלה גבוהה. ניתן היה לראות נוירובלסטים בתהליך חלוקה; גרעיני הנוירובלסטים מוצגים בירוק והממברנות שסביבם מוצגות באדום. תמונות time-lapse של נוירובלסטים מתחלקים, המהוים על ידי גשש הממברנה mCherry בעובר ביקורת, צולמו באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב (wide field) כדי להדגים טוב יותר נוירובלסטים מתחלקים בעוברי ביקורת. כל ערוץ נשמר בסולם אפור והתמונות הופכו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של שדה סרוק (swept field) בעוברי ביקורת.ביצעו הדמיה של Coex המבטאת ham one GFP ו-M cherry pH באזור עם נוירובלאסטים במחלוקה. אותם עוברים, שטופלו ב-RNAI להשתקה של ביטוי ill, נדגמו באמצעות מיקרוסקופיית שדה רחב. בניגוד לעוברים בקבוצת הביקורת, נוירובלאסטים רבים נעצרו או נסוגו במהלך החלוקה והפכו לרב-גרעיניים בבדיקה במיקרוסקופיית שדה סרוק.היה ברור גם כי נוירובלסטים רבים נעצרו או נסוגו במהלך החלוקה והפכו למרובי גרעינים. ניתן להשתמש בטכניקה זו גם כדי לדגם תאים נודדים במהלך התהוות רקמה. כמו כן, אם נעשה שימוש ב-Zacks כדי לאפשר דימוג מהיר יותר, ניתן להפיק מידע רב יותר על הדינמיקה התת-תאית.יתרה מכך, באמצעות הציוד המתאים, ניתן להשתמש בטכניקה זו להפעלה של גששים הניתנים לכיוונון פוטו-כימי לצורך ביצוע אופטוגנטיקה. כמו כן, ניתן ליישם טכניקות מיקרוסקופיה כגון FRET כדי לחקור חלבונים, אינטראקציות בין חלבונים או דינמיקה של חלבונים.

visualizing-neuroblast-cytokinesis-during-c-elegans-embryogenesis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים את הליך להכין...

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

מאמר זה מתאר טכניקה להדמיה של האירועים הראשונים של העובר בתוך...

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

מקור: Williams, A. L., et al. הדמיית זמן-lapse מרובת פוטונים כדי להמחיש התפתחות בזמן אמת: הדמיה של תאי פסגה עצבית נודדים בעוברי דג זברה. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מציג פרוטוקול הדמיה מרובה פוטונים כדי לדמיין את הנדידה של תאי פסגה עצבית בעובר דג זברה בזמן אמת ברזולוציה גבוהה.

הדמיה של נדידת תאי פסגה עצבית בעובר דג זברה באמצעות הדמיית זמן-lapse מרובת פוטונים

מקור: Jeong, S. הדמיה של דפוס ההקרנה האקסונלי של נוירונים מוטוריים עובריים ב-Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההדמיה של הקרנות אקסונליות בעוברים Drosophila. תיוג חיסוני של נוירונים מוטוריים, דיסקציה מדויקת לחשיפת מבנים עצביים ומיקרוסקופ ניגודיות של הפרעות דיפרנציאליות חושפים ביחד ארכיטקטורה עצבית מפורטת, תוך שימת דגש על דפוסי ההקרנה האקסונלית.

הדמיה של דפוסי הקרנה אקסונליים של נוירונים מוטוריים עובריים בדרוזופילה

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

כאן מוצג כיצד לעקוב ולכמת תהליכי התפתחות ב-C. elegans. השיטות המוצגות מבוססות על כלי קוד פתוח הניתנים ליישום בקלות. הוא מודגם כיצד לשחזר מודלים תלת מימדיים בצורת תא, כיצד לעקוב באופן ידני אחר מבנים תת-תאיים וכיצד לנתח זרימת התכווצות קליפת המוח.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כלים חישוביים, ותיוג תא יחיד בחיים C. אלגיה העוברים להבין דינמיקה תא בודד במהלך ההתפתחות העצבית.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים וכלים להמחשת סידן במהלך הפריה ועובריות מוקדמות באמצעות מדווח סידן מקודד גנטית המתבטא בקו הנבט של נמטודת המודל C. elegans.

הדמיה in vivo של מעברי סידן במהלך הפריה והתפתחות מוקדמת ב - C. elegans

למד לצפות בחלוקת נוירובלסטים בעוברי Caenorhabditis elegans באמצעות מיקרוסקופיית שדה רחב וקונפוקלית. שיטה זו מאפשרת לחקור את תפקיד הגנים בחלוקת תאים בביולוגיה התפתחותית.

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך

גלה סרטונים נוספים