חזותי neuroblast cytokinesis במהלך ג elegans עובר

פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה בעוברי elegans Caenorhabditis. בעוד כמה פרוטוקולים מתארים כיצד חלוקת תאי תמונה בעובר המוקדם, פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה מתפתחת במהלך embryogenesis אמצע סוף.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לצפות בתאים מתחלקים בתוך רקמה מתפתחת במהלך אמבריוגנזה אלגנטית C. על מנת לחקור גנים השולטים בחלוקת התאים, זה מושג על ידי יצירה או השגה של זן C elgan המבטא ביציבות סמנים טרנסגניים המסמנים את התאים המעניינים. כצעד שני, הפילו באופן סלקטיבי גן מעניין על ידי הזנת D-S-R-N-A ל-L ארבעה זחלים למשך 24 עד 48 שעות.

עוברי ה-RNAI נאספים מהרמפרודיטים גרפיים ומועברים לכרית ארוס להדמיה חיה. לאחר מכן, באמצעות שדה רחב או מיקרוסקופיה קונפוקלית עוברים מצולמים כדי לדמיין פנוטיפים של חלוקת תאים. התוצאות יראו כיצד נוירובלסטים מתחלקים במהלך האמבריוגנזה של אלגין הים, ואת תפקיד הגנים הנדרשים לחלוקתם.

שיטה זו יכולה לסייע לחשוף שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית והתאית. לדוגמה, שיטה זו יכולה לחשוף גנים ומנגנונים המעורבים בוויסות מיטוזה במהלך התפתחות רקמות, תקשורת תאים, נדידת תאים או קוטביות תאים. השתמש בתולעים טרנסגניות המבטאות את הסמנים המתאימים שנשמרו על לוחות בקרה או RNAI למשך 24 עד 48 שעות.

בחרו ארבעה עד שישה בוגרים קברים והעבירו אותם ל-20 עד 30 מיקרוליטר של מאגר M 9 במגלשת שקע כדי לשחרר את העוברים, השתמשו באזמל סטרילי, חתכו את התולעים משני צידי הזרע או הפות. לאחר מכן, אספו את העוברים באמצעות נימים משוכים, המחוברים לנורת פיפטה ורחבים מספיק כדי להעביר את העוברים. מעבירים את העוברים לכרית ארוס טרייה שהוכנה באמצעות ריס המודבק לקיסם.

צרו קבוצות של חמישה עד 10 עוברים על ידי דחיפת העוברים אחד ליד השני. מכסים את השקופית עם פתק כיסוי ומוסיפים עוד מאגר M nine במידת הצורך, ואז אטמו את החלקת הכיסוי עם וואלה נוזלית שחוממה מראש. השתמש במיקרוסקופ שדה רחב פלואורסצנטי אפי הכולל מסננים אוטומטיים.

מטרות, מצלמת CCD ברזולוציה גבוהה ובמה ממונעת מאוד. הכל נשלט באמצעות תוכנה. למרות שמערכת זו אינה משתמשת בנורות LED ו-E-M-C-C-D תגביל את הפוטוטוקסיות לעובר עם הגדלה נמוכה.

התמקד ידנית בעוברים כדי לדמות נוירובלסט. הגדל את ההגדלה ובחר עוברים שעוברים איסוף גבי או מוקדם את סגירת הגחון במיקרוסקופ הרחב. בחר את המסננים האדומים GFP וטקסס וקבע מישורי Z אופטימליים במערכת השדה הרחב.

שימוש בפחות זקים ופחות נקודות זמן יפחית את הפוטוטוקסיות גם סוגר את הצמצם ל-30% ואם אפשר, הפחתת עוצמת האור תפחית עוד יותר את הפוטוטוקסיות. לחלופין, השתמש בשדה נסחף בסריקה חיה או במיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב עם תוכנה השולטת במטרות לייזר הסריקה, מצלמת E-M-C-C-D ובמה ממונעת מאוד. כעת, לאחר שהגדרות הרכישה עברו אופטימיזציה, דמו את העוברים במיקרוסקופ השדה הרחב.

מומלץ לצלם תחילה עוברי ביקורת לפני עוברי RNAI. עם מערכת השדה הסוחפת. הגדר את הלייזרים 4 88 ו-5 61 100 מילי-וואט להספק של 40% עם חריץ של 50 וזמן חשיפה של 300 אלפיות השנייה.

חשוב לציין שהגדרות אלה יהיו שונות עבור מיקרוסקופים אחרים. הנח את השקופית על שלב המיקרוסקופ, ולאחר מכן השתמש במטרה בהגדלה נמוכה כדי למצוא את העוברים. לאחר מכן עבור ליעד טבילת שמן פי 60 או 100.

לאחר המיקוד, אסוף 20 ערימות Z ב-0.2 מיקרון כל שתי דקות למשך 10 דקות בסך הכל. זמן החשיפה ידרוש ככל הנראה שינוי. יש לקחת בחשבון פוטוטוקסיות כאשר עוברים הדמיה חיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סוגרים את הצמצם, בוחרים פחות זקסים או נקודות זמן.

הפחתת זמן החשיפה יכולה להגביל את הפוטוטוקסיות במידת האפשר. שימוש בשדה SW או במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב יכול לעזור לשפר בעיה זו. קבע את הזמן, הנקודות ומישורי ה-Z המעניינים שלך באמצעות תוכנת הרכישה.

ייצא תמונות רצויות כמספר tiffs. פתח את מישורי ה-Z הרצויים עבור כל נקודת זמן וערוץ עניין בתוכנת עיבוד כמו Image J וצור נוירובלסט מחסנית משתרע לרוב על פני כמה מישורים בלבד. ערמו את מישורי Z לכל נקודת זמן וצרו הטלות אוסף Z.

חזור על פעולה זו עבור ערוצים נוספים. לאחר השלמת כל תחזיות זאק לנקודות הזמן הרצויות, פתח את התחזיות כדי ליצור רצף זמן. עשה זאת עבור כל ערוץ בנפרד.

עבור כל ערוץ, בצע התאמות לבהירות ולניגודיות לפי הצורך. סובב את התמונות במידת הצורך. לאחר מכן בחר אזור עניין וחתוך את התמונות.

כעת צור תמונה ממוזגת באמצעות פונקציית הערוצים הממוזגים. בחירת צבע שונה לכל ערוץ. שמרו את התמונה הממוזגת כקובץ RGB כדי להציג את התמונות בצורה ברורה יותר.

השתמשו בתמונות TIFF של 16 סיביות ובחרו בפונקציית ההיפוך תחת 'עריכה' ליצירת תמונות בקנה מידה אפור לכל ערוץ. כדי לקבוע את גודלו של אובייקט מעניין למיקרונים, צייר קו והכפל את אורכו בגודל הפיקסלים, שנקבע על ידי פרמטרי ההדמיה. כעת, צור סרגל קנה מידה המייצג חלק מהאורך המחושב במיקרונים.

בסופו של דבר, שמור את התמונות הסופיות כ-tiffs של שמונה סיביות. אם תרצה, המר את ה-tiffs לסרטים באמצעות תמונה J אפידרמיס. מורפוגנזה של אלגנטיות C מתרחשת עקב שילוב של שינויים בצורת תאי האפידרמיס, נדידה והדבקה בעזרת נוירובלסט פרוליפרטיבי בסיסי.

תאי אפידרמיס נודדים לקו האמצע הגחוני ויוצרים שכבה אחת של תאים כדי לחקור עוברי חלוקת נוירובלסטים, ביטוי קוקס יציב וסמן ספציפי לנוירובלסט המתויג ב-GFP וסמן ממברנה מונע אימהות המתויג ב-m דובדבן צולמו במהלך המתחם הגחוני בהגדלה מוגברת. נוירובלסטים הודגמו, עוברים חלוקה, גרעיני נוירובלסטים מוצגים בירוק, והממברנות שמסביב מוצגות באדום, תמונות זמן-lapse של נוירובלסט מתחלק המתוארות עם בדיקת ממברנת mCherry בעובר ביקורת נלכדו באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב כדי לדמיין טוב יותר את הנוירובלסט המחלק בעוברי הביקורת. כל תעלה נשמרה בקנה מידה אפור והתמונות הפוכות באמצעות עוברי בקרת מיקרוסקופיה קונפוקלית בשדה נסחף.

קוקס המבטא בשר חזיר אחד GFP ו-M דובדבן pH צולמו באזור עם נוירובלסט מתחלק. אותם עוברים שטופלו ב-RNAI כדי להפיל ביטוי חולי הודגמו באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב. בניגוד לעוברי ביקורת, נוירובלסטים רבים נתקעו או נסוגו במהלך החלוקה והפכו לרב-גרעיניים באמצעות מיקרוסקופ שדה נסחף.

היה ברור גם שנוירובלסטים רבים נעצרו או נסוגו במהלך החלוקה והפכו לרב-גרעינים. ניתן להשתמש בטכניקה זו גם כדי לדמות תאים נודדים במהלך היווצרות רקמות. כמו כן, אם משתמשים בזקס שלך כדי לאפשר הדמיה מהירה יותר, ניתן לקבל מידע נוסף על הדינמיקה התת-תאית.

יתר על כן, עם הציוד המתאים, ניתן להשתמש בטכניקה זו להפעלת בדיקות הניתנות לכוונון צילום לביצוע אופטוגנטיקה. כמו כן, ניתן ליישם טכניקות מיקרוסקופיה כגון שריג או שריג לחקר אינטראקציות חלבון, חלבון או דינמיקה של חלבונים.