שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ"א

הדגמה זו משתמשת בהדמיית תאים חיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים כדי להבין את היחסים המרחביים הזמניים של חלבונים המעורבים בתגובת הנזק ל-DNA. ראשית, העבירו או התמרו את קו התא שבחרתם עם מבני ביטוי המכילים סמנים פלואורסצנטיים מתאימים. כאן M Cherry ו-GFP רוכשים לאחר מכן סדרה של סרטוני בקרה המציגים את התאים המסומנים בפלואורסצנט בתנאים רגילים.

לאחר מכן יש ליישם טיפול מתאים וללכוד נתונים של השפעות הטיפול על תהליך התאים הפלואורסצנטיים ולנתח את נתוני הווידאו ליחסים זמניים מרחביים של חלבונים. בסופו של דבר, מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים חיים יכול לפרט דינמיקה תאית כמו היווצרות של מוקדים של 53 BP אחד בתגובה לגורמים מזיקים ל-DNA או התנהגות של 53 BP אחד במהלך מיטוזה. התחלנו להתעניין בהדמיית אורח חיים דו-ממדית ותלת-ממדית כשרצינו לחקור כיצד טיפולים שונים משפיעים על מיטוזה בשורות תאים מסוימות.

גישה ניסויית זו מאפשרת לנו לחקור את תגובת הנזק ל-DNA ושמירה על יציבות גנומית ביתר קלות מאשר שיטות מסורתיות. בנוסף, אתה יכול להשתמש בשיטה זו כדי לחקור כיצד חלבונים מסוימים מתקשרים במסלולי איתות שונים ובקווי תאים שונים. היתרון העיקרי של הדמיית אורח חיים על פני טכניקות מסורתיות כמו כימיה של ציטו הוא שהיא מאפשרת לחקור את חלבוני תגובת הנזק של ה-DNA בזמן אמת.

אופטימיזציה של תנאי ההקלטה הנכונים יכולה להיות מאתגרת. ניתן להשתמש בהדגמה זו כדי לראות את הצעדים הקטנים הרבים הדרושים כדי להבטיח הצלחה. זכור שהתמדה משתלמת בכל הנוגע למזעור הלבנת תמונות, מציאת מרווחי ההקלטה הנכונים ומשך זמן ההקלטה הנכון וכו'.

העבירו או התמרו את קווי התאים המתאימים עם הפלסמידים לביטוי חלבון היתוך mCherry ו-GFP. שמור על התרביות תחת בחירת תרופות ובדוק מעת לעת את ביטוי החלבונים הפלואורסצנטיים יום לפני רכישת התמונה. קצרו את התאים באמצעות טריפסין.

לאחר מכן זרעו תרביות בצפיפות נמוכה על צלחות תחתונות זכוכית פלואורו בגודל 3.5 סנטימטר. פרוטוקול זה פותח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב SD של Zeiss cell observer, המצויד במעמד אחד של axio observer Z ראשית, ודא שגז ה-CO2 רץ למודול ה-CO2 של מערכת הדגירה. אם המיקרוסקופ נתמך על ידי Airtable נגד רעידות, הפעל את אספקת האוויר ל-Airtable.

כעת הפעל את החשמל עבור מעמד המיקרוסקופ מצלמות יחידת דיסק מסתובב, מודולי דגירה, תאורת HXP, במה ממונעת, לייזר ארגון ומחשב. הפעל את המתגים עבור קווי הלייזר שישמשו אותם. הפעל את תוכנת הראייה של Axio.

ניתן להתאים את תוכנת Avision עם חלונות ולמשוך תפריטים ספציפיים למיקרוסקופ ולרכיבים שבהם היא שולטת ככזה, לכל ממשק משתמש יש מראה ייחודי פוטנציאלי כשעה לפני ההדמיה. אתר את הפקדים לחממה והפעל את החימום לתא העליון ולצלחת הבמה.

הגדר את הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס. הפעל את בקרת ה-CO2 והגדר את הרמה ל-5%בחר את עדשת המטרה להדמיה במחקר זה. עדשת האובייקט דורשת שימוש במדיום טבילה בעל מקדם שבירה הדומה למים.

אם אתה צריך לדמות מספר מיקומים לאורך פרקי זמן ארוכים, הקפד ליישם מספיק מדיום טבילה כדי שההיקף לא יתייבש. הניחו את צלחת התרבות על הבמה והביאו את עדשת המטרה למעלה למגע עם החלק התחתון, באמצעות פקדי המיקרוסקופ או התוכנה. כוון את האור הנפלט לחלקי העיניים ובחר את סט מסנן השדה הרחב המתאים לאות הפלואורסצנטי המעניין.

עכשיו התבוננו מבעד לעדשות העיניים. מקד את התמונה ואתר שדה תאים מתאים באמצעות התוכנה או פקדי המיקרוסקופ. כוון את האור הנפלט הרחק מחלקי העיניים אל היציאה באמצעות יחידת הדיסק המסתובב הקונפוקלי בתוכנה.

הפעל את הלייזר המתאים למחקר זה. עבור כל ערוץ, התאם את עוצמת הלייזר על ידי התאמת בקרת המסנן המתכוונן של kuo אופטי לרמה מתאימה. לאחר מכן, בחר את המראה הדיכרואית ומסנני הפליטה המתאימים.

פתח את התריס ליחידת הדיסק המסתובב. כעת בחר את החלון החי כדי להציג את שדה הראייה הנוכחי. כעת פתח את חלון בקרת המצלמה.

בחר את המצלמה שבה יש להשתמש והגדר את זמן החשיפה לכ-100 אלפיות השנייה. התאם את האחוז ואת הרווח האלקטרומגנטי לפי הצורך. כמו כן, פתח את הבקרה עבור יחידת הדיסק המסתובב הקונפוקלי והתאם את מהירות הדיסק המסתובב על ידי הזנת זמן החשיפה של המצלמה שהוגדר לצילום תמונה מתאימה.

לחץ על הגדר כדי לנעול את השינוי. כעת פתח את חלון הרכישה הרב-ממדי. בחר את כרטיסיית הערוץ וטען או בחר ערוצים מתאימים שהוגדרו עבור Flora Fours.

כדי להבטיח רישום תמונה, השתמשו במראה דיכרואית משותפת לשני הערוצים. הגדר את התוכנה למיקוד אוטומטי. המשך לחלון MDA ולחץ על לשונית המחסנית ZS.

בחר מחסנית ZS במיקום המיקוד הנוכחי. הגדר את הטווח עבור Zack של 10 מיקרון ובחר אופטימלי למספר השלבים כדי להבטיח דגימה של nyquist דרך Z.כעת לחץ על התחל ונתח את תמונת מחסנית Z המתקבלת. בחר את כרטיסיית השעה.

הגדר את המרווח בין נקודות זמן ההדמיה לבין משך הזמן הכולל של ההפעלה. להדמיה רב-נקודתית של מספר תאים בצלחת יש לפתוח את חלון מד"א. בחר את כרטיסיית המיקום וודא שהגדרת ההחלה לפני או אחרי נקודת זמן לכל מיקום מסומנת.

כעת בחר סימן. מצא באמצעות התצוגה החיה, הזז את המנה ובחר שדות ראייה מתאימים. לחץ על התחל בתפריט הרכישה הרב-ממדית כדי להתחיל את הניסוי ולהקליט סרטון בקרה.

המשך להוסיף את הטיפול המתאים ולהקליט את סרטון הניסוי במרווחי זמן קבועים לפרק זמן מוגדר. עבור קו תאים זה ולניטור כל תהליך המיטוזה, השתמשנו במרווח של שבע וחצי דקות וזה במשך ארבע עד חמש שעות. תצטרך לקבוע את ההגדרות הספציפיות עבור קו התא שלך ועבור מה שאתה רוצה ללמוד.

פתח את תוכנת המהירות, צור ותן שם לספרייה חדשה וייבא את קבצי הווידאו הניסיוניים לצפייה בקבצים. נסה להשתמש בהגדרת המיקוד המורחב, התאם את הסרטונים לפי הצורך. Velocity מצוידת במגוון כלים שיעזרו לשפר את איכות התמונות שרכשת.

אם ההגדרות במיקרוסקופ מתאימות, זה יחסוך הרבה זמן בהמשך בעריכה. לעתים קרובות זה מועיל להאציל את התמונות שלך ולהתאים את הבהירות והניגודיות הצרכים הספציפיים שלך ישתנו בהתאם לניסוי שלך כדי להציג את התאים בתלת מימד. עברו לקביעת האטימות התלת-ממדית.

זה מאפשר סיבוב של התאים המעובדים בתלת מימד בחלל, ובכך מספק נקודות מבט מרובות של מבנים מעניינים בתוך התאים. סרטים. ניתן לייצא תמונות סטילס למגוון סוגי קבצים בהתבסס על העדפת המשתמש בהשוואה לפקדים. תאי פיברובלסטים שנחשפו ל-CPT יצרו מוקדים תוך חמש עד 10 דקות ושמרו על מוקדים אלה לאורך כל הרישום.

מעניין לציין כי בתאי כליה עובריים אנושיים, 53 BP אחד מתנתק מכרומטין בתחילת המיטוזה, ויוצר אובך דק סביב הכרומוזומים המתעבים. כאשר הטלף מתרחש והמיטוזה מגיעה לסיומה 53 BP אחד, שוב מצטבר למוקדים נפרדים. אנו מקווים שסרטון זה יאפשר לך לחקור את היחסים המרחביים-זמניים של חלבונים המעורבים בתגובת הנזק ל-DNA כמו גם מסלולים אחרים.

לדוגמה, בתחום הדינמיקה של כרומטין, נעשה שימוש בטכניקה זו כדי לחקור כיצד קשירה אחת של 53 BP משפיעה על תנועת הקצוות הטלומריים של ה-DNA. לאחר יצירת תאים מהונדסים גנטית, ניתן לבצע הדמיית תאים חיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים תוך כארבע עד שמונה שעות. ודא שהגדרות המיקרוסקופ מותאמות כראוי כדי לקבל הדמיה אופטימלית.