Name: שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: למד הדמיה תלת-ממדית של תאים חיים לחקירת חלבוני תגובת נזק לדנ"א. שיטה זו מאפשרת לעקוב אחר דינמיקת חלבון 53BP1 בזמן אמת ולנתח את השפעת סוכני הנזק על תהליכי מיטוזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

נתמך בחלקו על ידי R01NS064593 וR21ES016636 (KV). מיקרוסקופי בוצע בVCU - מחלקה לנוירוביולוגיה מתקן מיקרוסקופי ואנטומיה, נתמך, בין השאר, במימון ה-NIH NINDS מרכז ליבת מענק 5P30NS047463. Confocal מיקרוסקופ הדיסק מסתובב נקנה בפרס ה-NIH NCRR (1S10RR027957).

הכנת תא א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> fibroblasts העיקרי אדם נורמלי (GM02270) התקבלו ממאגר Coriell סלולרי, קמדן, ניו ג&#39;רזי, והונצח עם 6 hTERT. תאים גדלו והתרחבו בCellStar מנות 6-סנטימטר בתקשורת (4 מ&quot;ל) בהיקף של MEM בתוספת 20% בסרום עוברי שור (GIBCO), חומצות אמינו non-essential/essential, ויטמינים, פירובט נתרן, ופניצילין / סטרפטומיצין (HyClone ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כליה עוברית אנושית 293 (HEK293) תאים נלקחו מאוסף תרבות סוג האמריקאי וגדלה והתרחבה בCellStar מנות 6-סנטימטר. התאים נשמרו בתקשורת (4 מ&quot;ל) בהיקף של DMEM בתוספת חומצות 10% עובריים שור בסרום, שאינן חיוניות אמינו, L-גלוטמין, ופניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 53BP1-mCherry (N-Myc-WT 53BP1 pLPC-Puro; Addgene פלסמיד 19836) וH2B-GFP (pCLNR-H2BG; 17735 פלסמיד Addgene) גן היתוך הבונה גם לבטא את גני התנגדות G418 puromycin או, בהתאמה, transduced (fibroblaSTS) או transfected (HEK293) באמצעות SuperFect (Qiagene) לתוך תאים ונשמר תחת בחירת תרופה. תחזוקה של קרינה נבדקה מעת לעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24-48 שעות לפני רכישת תמונה, תאי trypsinized לתוך השעית תא בודד ונזרעו בצפיפות נמוכה על צלחות תחתונות 3.5 סנטימטר FluroDish זכוכית. </li></ol> התקנת מיקרוסקופ ב ויבוא תמונות פרוטוקול זה פותח באמצעות מיקרוסקופ הסלולרי Zeiss אובזרוור SD דיסק ספינינג confocal המצויד בZ1 עמדת AxioObserver, ערוץ כפול Yokagawa יחידת המז&quot;פ-X1a 5000 מסתובב דיסק, 2 מצלמות Photometrics QuantEM 512SC EMCCD, מאייר 120C HXP מבוסס סיבים, 4 לייזרים (Lasos 100mW רב קווי ארגון [458, 488, 514 ננומטר], 50 405 דיודה mW ננומטר, דיודה 40 MW 561 ננומטר, והדיודה ננומטר 30 mW 635), AOTF, מערכת Pecon XL multiS1 שלב דגירה, דגירת Zeiss מודולים (O 2 מודול S, CO 2 מודול S, S TempModule, ההסקה XL S) ומו לפנישלב torized XY עם תותב NanoScanZ piezo Z. כדי למזער את הסטיות כדוריות ואילו תאים חיים הדמיה תמכו במדיום מימי, 63x/1.20 מי C-Apochromat / קור אובייקטיבי עדשה ונוזל Zeiss Immersol W טבילה (עם מקדם שבירת n = 1.334) היו בשימוש. לערוץ 2 confocal הדמיה, RQFT מראה וBP525/50 Dichroic 405/488/568/647 (ירוק) וBP629/62 (אדום) מסנני פליטה היו בשימוש. תוכנת המערכת המשמשת הייתה Zeiss AxioVision (גרסה. 4.8.2.0) עם AV4 Multi-channel/Z/T, הדמיה מהירה, פיזיולוגיה, MosaiX, מארק ומצא, מצלמה כפולה, בתוך 4D, פוקוס אוטומטי ומודולים Deconvolution 3-D. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא פועל כי 2 גז CO 2 למודול CO של מערכת הדגירה. אם מיקרוסקופ נתמך על ידי שולחן אוויר נגד רעידות, הדלק את אספקת האוויר (או 2 גז N) לשולחן האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הכח לעמדת מיקרוסקופ, יחידה מסתובבת דיסק, מצלמות, מודולים דגירה, מאייר HXP, שלב ממונע, ארגוןליזר, ומחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 דקות של זמן חימום, סובב את מפתח ההצתה לארגון הליזר ל&quot; ב &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוח הבקרה של ליזר Zeiss, מפעיל את המתגים לקווי הליזר לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את המתג עבור בקר Lasos ארגון הליזר מ&quot; מתנה &quot;ל&quot; טווח ליזר&quot; ולהתאים את בקר האור לרמה האופטימלית (כלומר בדיוק מתחת לנקודה שבה החיווי הירוק הופך לאדום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את AxioVision תוכנה. הערה: ממשק המשתמש עבור AxioVision יכול להיות מותאם אישית עם תפריטים וחלונות נפתחים שהם ספציפיים למיקרוסקופ במיוחד ורכיבים שהיא שולטת. ככזה, לכל מערכת יש ממשק פוטנציאל ייחודי. לכן, הנחיות כלליות למניפולצית תוכנה מסופקות בשלבים הבאים, ולא לכיווני חלונות ספציפיים תוכנה, כרטיסיות ו / או בתפריטים נפתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 1 שעות לפני ההדמיה, בתוכנה, לאתר את הפקדים לחממה ולהפעיל את החימום לחדר העליון ואת צלחת השלב. הגדר את הטמפרטורה עד 37 מעלות צלזיוס הפעל 2 שליטת CO ולהגדיר את הרמה של 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את העדשה האובייקטיבית להדמיה. במחקר זה, עדשת 63x/1.20 NA C-Apochromat מים / קור אובייקטיבי שמשה הערה:. לעדשה, בינוני טבילה עם מדד דומה למים (נוזל טבילת Zeiss Immersol W) שבירה הוא זקוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עמדות נפרדות מרובות הן שידגמו על פני תקופה ארוכה של זמן, כדי להיות בטוח יש למרוח כמות מספקת של מדיום טבילה כדי לוודא שהיא מתבצעת מתפקיד אחד למשנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצלחת על הבמה ולהביא את העדשה האובייקטיבית עד במגע עם התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שימוש בפקדי מיקרוסקופ או בתוכנה, לכוון את האור הנפלט לעינית ובחר את המתאים widefield המסנן נקבע לאות הניאון של עניין (לצורך מחקר זה, &quot;אדום&quot; מסנן נקבע ל53BP1 ו&quot; GFP &quot;מסנן נקבע לH2B ). &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו דרך העדשות העיניות, להתמקד בתמונה, ולאתר את השדה מתאים של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> או באמצעות תוכנה או פקדי מיקרוסקופ, לכוון את האור הנפלט מאת העינית ליציאה עם יחידת דיסק ספינינג confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, להפעיל את הליזר המתאים (למחקר זה, ליזר ננומטר 561 ל53BP1 וקו 488 ננומטר של ארגון הליזר לH2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל ערוץ, להתאים את עוצמת הליזר על ידי התאמת מסנן השליטה מתכוננת acousto האופטית (AOTF) לרמה מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המראה המתאים Dichroic (RQFT 405/488/568/647) ומסנני פליטה (BP 629/62 ל53BP1 וBP 525/50 לH2B). לפתוח את התריס ליחידת דיסק ספינינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את החלון &quot;החי&quot; כדי להציג את השדה הנוכחי של נוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, פתח את השליטה &quot;המצלמה&quot;, לבחור את המצלמה לשימוש (אם מערכת מצלמה כפולה) ולהגדיר את זמן חשיפה לכ 100 מילישניות. התאם% ו EM לקבל כמו נמ&quot;אהערת essary:. מבנה 53BP1-mCherry מופיע מעט עמום. מצאנו את זה מועיל כדי להגדיל את רווח EM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, פתח את השליטה ליחידת דיסק ספינינג confocal ולהתאים את מהירות הדיסק מסתובב על ידי הזנת זמן חשיפת המצלמה שהוקם כדי ללכוד תמונה מתאימה (לדוגמה: ~ 100 ms). לחץ על &quot;גדר&quot; כדי לנעול בשינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח &quot;רכישה רבה ממדית&quot;. בחר בכרטיסיית הערוץ ולטעון / לבחור ערוצים מתאימים. במחקר זה, אנו משתמשים בערוצים שהוגדרו לdsRed (561 ננומטר עירור ליזר ו-BP 629/62 מסנן לפליטה) וה-GFP (488 ננומטר קו ליזר לעירור וBP525/50 מסנן לפליטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח רישום תמונה, מראה Dichroic משותף (RQFT 405/488/568/647) שמש לשני הערוצים. הגדר את התוכנה ל&quot; פוקוס אוטומטי &quot;. הערה: עבור לעורך כלי → הגדרות כדי להתאים את ההגדרות של מד&quot;א. ודא שעוצמת הליזר הנאותה מוגדרת (&quot;כוח הליזר הולם&quot; מתייחס להגדרה המאפשרת לךכדי להלהיב fluorophore המתאים תוך מזעור תמונת הלבנה-). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון מד&quot;א, בחר בכרטיסיית Z-המחסנית. בחר &quot;Z-מחסנית במיקום המוקד הנוכחי&quot;. הגדר את הטווח ל~ 10 מיקרומטר Z-עורם ולבחור &quot;אופטימלי&quot; למספר צעדים על מנת להבטיח דגימת נייקוויסט דרך הערת ז&#39;: הגודל המדויק של Z-המחסנית יהיה תלוי בגובה של התאים שלך. בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 23. לחץ על &quot;התחל&quot; ולנתח את תמונת Z-מחסנית כתוצאה כדי להבטיח את ההגדרות מתאימות למה שאתה חוקר (למשל במחקר זה, היה חשוב לכל תמונה לגרעין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;T&quot; (זמן). לניסוי שלנו עם camptothecin, אנו קובעים את המרווח בין נקודתי זמן הדמיה עד 5 דקות והמשך הכולל של הישיבה לשעה 1 עבור וידאו שליטה (תאים שאינם מטופלים). הערה: כדי למזער את תמונת הלבנה-של התאים, הניסוי צריך להיות מוגדר כך שAOTF חסר הליזר בין נקודתי זמן הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fאו הדמיה מרובה נקודות של מספר תאים במנה, בחלון מד&quot;א, בחר בכרטיסיית המיקום. ודא &quot;החל&quot; הגדרה לפני / אחרי נקודת זמן העמדה ל&quot; מסומנת. בחר &quot;Mark_Find&quot;. שימוש בתצוגה &quot;החייה&quot;, להזיז את קערת האוכל ובחר בשדות מתאימים של תצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;התחל&quot; בתפריט רב ממדי הרכישה כדי להתחיל את הניסוי ולהקליט וידאו שליטה (של תאים שלא טופלו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר וידאו השליטה, להוסיף את הטיפול המתאים (במקרה זה, camptothecin מיקרומטר 10). הקלטנו וידאו הניסיוני (תאים שטופלו בתרופה) במרווחי דקות 5-10 ל2-4 שעות. הערה: נושא חשוב שיש לשקול הוא המהירות שבה השפעת נתונה מתרחשת לאחר טיפול. כפי שניתן לראות בוידאו, 53BP1 המוקדים יתחילו מ~ 5 דקות אחרי תוספת של CPT. למרות תהליך קל יחסית, והוסיף תרופה למנה ידנית וכיול מחדש-מיקרוסקופ עושה ייקח זמן. שיקול שצריך לתת לזה בעת תכנון ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניטור מ &#39;itosis, אנו קובעים את המרווח ל -7.5 דקות ורשמנו ל4-5 שעות (ההגדרות הספציפיות תלויות בקו הסלולרי בשימוש, ואורכו של מחזור התא שלו). התאמות ייתכן שיהיה הצורך נעשתה כדי למנוע הלבנה-תמונה במהלך הקלטה ארוכה יותר. </li></ol> עיבוד וניתוח תמונת ג פרוטוקול זה פותח באמצעות תוכנת Volocity (PerkinElmer). תוכנה המשמשת לאיסוף נתונים זה (AxioVision) יש גם את היכולת לעבד ולנתח תמונות. משתמשים מוזמן לנצל את התוכנה הזמינה להם, ולהתייעץ ספרות מתאימה לגבי היישום שלהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת Volocity. צור ושם ספרייה חדשה, ולייבא את קבצי הווידאו שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפייה בקבצים, אנחנו בדרך כלל למצוא את זה מועיל ביותר לשימוש בהגדרה &quot;המורחבת הפוקוס&quot;. זה כופה את פרוסות Z-מחסנית ו, עבור פרוטוקול זה, מאפשר לנו לדמיין מוקדי 53BP1 באזורים שונים של הגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם קטעי וידאו על פי צורך. ווlocity מצויד במגוון רחב של כלים כדי לשפר את איכות תמונות שנרכשו. על ידי הקפדה על ההגדרות במיקרוסקופ היו מתאימות, הרבה זמן ניתן לשמור בעריכה מאוחר יותר. לעתים קרובות, כדאי deconvolve התמונות שלך, ולהתאים את הבהירות / ניגודיות. צרכי העריכה הספציפיים שלך ישתנו בהתאם לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חותמת זמן יחסית וסרגל קנה מידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפייה בתאים ב3-D, מעבר להגדרת &quot;3-D האטימות&quot;. זה מאפשר סיבוב של התאים שניתנו 3-D בחלל, ובכך לספק פרספקטיוות שונות על מבנים של עניין בתוך התאים. הערה: זה מועיל לחזות תאים במישורים שונים כדי לקבוע היכן מבנים של נסיעות ריבית. לדוגמה, בהגדרה &quot;המורחבת הפוקוס&quot; קשה להבחין ש53BP1 אין, למעשה, לנתק מהדנ&quot;א במהלך מיטוזה. עם זאת, זה ברור מב 3-D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרטים ותמונות סטילס יכולים להיות מיוצאים למגוון סוגי קבצים המבוססים על העדפת משתמש. </l<html> i&gt; </ol> תוצאות מייצגות ד דוגמה להיווצרות 53BP1 מוקדים בתגובה לCPT מוצגת באיור 1. תאים נחשפים לצורת CPT מוקדים בתוך דקות 5-10, ולשמור על המוקדים האלה לכל אורך הקלטה. כפי שמוצג באיור 2, 53BP1 מנתק מהכרומטין בתחילתם של מיטוזה, יוצר אובך דק סביב הכרומוזומים העיבוי. כtelophase מתרחש מיטוזה ומגיעה לסיומו, שוב אגרגטים 53BP1 למוקדים נפרדים. בעוד HEK293 התאים לא היו חשופים לCPT, הם בכל זאת נוצרו מוקדים בשפע, ספונטניים 53BP1 תיקון שנוצרו על ידי ניזק לדנ&quot;א אנדוגני. התבוננות זו אפשרה לנו להגיע למסקנה ש53BP1 אינו מהווה מוקדים במהלך מיטוזה מוקדם, בקנה אחד עם דו&quot;ח קודם שהראה השפעה דומה לאחר חשיפת תאים לקרינה מייננת ותרופות radiomimetic 5. יור 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; האיור 1. Camptothecin (10 מיקרומטר) גורם DSBs והיווצרות המוקדים 53BP1 ברכיבה על אופני fibroblasts בתוך 30 דקות של הוספת התרופה לבינונית. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> איור 2. 53BP1 אינו מהווה מוקדים במהלך מיטוזה עד telophase/G1 בHEK293 תאים.

<ol><li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li>
<li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li>
<li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+study+DNA+repair%3A+what%27s+in+the+box%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li>
<li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li>
<li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Give+me+a+break%2C+but+not+in+mitosis%3A+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li>
<li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li>
<li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li>
<li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li>
<li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459(2010).</li>
<li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1%3A+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li>
<li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+binding+protein+1+%2853BP1%29+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li>
<li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li>
<li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1%2C+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li>
<li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שמירה על שלמות גנטית היא חיונית להישרדות תא. כישלון כדי לשמר את התוצאות הגנום במוקדם, היווצרות הסרטן, הזדקנות או מות 8. יש עניין רב בהבחנה כמה פונקציות DDR, נובעות מחשיבותו למחקר בסיסי וקליני. טכניקות רבות פותחו במשך השנים כדי לסייע במחקר של כמה תאים לזהות ולתקן ניזק לדנ&quot;א. שיטות מסורתיות כגון immunocytochemistry ומערבי מוחות היו מעמודי תווך של התחום, למרות התקדמות בטכנולוגיה אפשרה לשיטות מתוחכמות יותר ויותר כדי להתפתח. חי הדמית תא, כמפורט בפרוטוקול זה, מאפשר לנו ל...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מוצר </td><td> חברה </td></tr><tr><td> מנות תרבות CellStar </td><td> גריינר ביו אחד </td></tr><tr><td> מנות תחתית זכוכית FluroDish </td><td> עולם מכשירי דיוק, Inc </td></tr><tr><td> MEM תקשורת </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> חומצות אמינו </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> ויטמינים </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> פירובט נתרן </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-WT 53BP1 pLPC-Puro; 19836 פלסמיד </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; 17735 פלסמיד </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss סלולרי אובזרוור SD הדמית המערכת </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (מהדורה 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W שמן </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> תוכנת Volocity (גרסה 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

הפסקות כפולות גדיל (DSBs) הן DNA המזיק ביותר נגעי תא יכול להיתקל. אם יצא שלא תוקן, פוטנציאל גדול DSBs נמל לייצר מוטציות וליקויים כרומוזומליים 1. כדי למנוע הטראומה הזאת מcatalyzing חוסר יציבות גנומית, זה קריטי לתאים כדי לזהות DSBs, להפעיל את תגובת הניזק לדנ&quot;א (DDR), ולתקן את ה-DNA. כאשר מגורה, DDR עובד כדי לשמור על שלמות גנטית על ידי מפעילת עצירת מחזור תא כדי לאפשר תיקון להתקיים או לאלץ את התא כדי לעבור אפופטוזיס. המנגנונים הבולטים של תיקון DSB מתרחשים דרך nonhomologous הסוף מצטרף-(NHEJ) וההומולוגי רקומבינציה תיקון (הרר) (שנסקר ב2). יש חלבונים רבים שפעילות חייבת להיות דווקא מתוזמרת לDDR כדי לתפקד כראוי. בזאת, אנו מתארים שיטה ל2 - ויזואליזציה 3-ממדית (ד &#39;) של אחד מהחלבונים האלה, 53BP1. חלבון p53 מחייב 1 (53BP1) localizes לתחומיםDSBs על ידי הקשירה לההיסטונים שונים 3,4, ויצר מוקדים בתוך 5-15 דקות 5. השינויים והגיוס של חלבוני היסטון 53BP1 ואחרים DDR לאתרי DSB הם האמינו כדי להקל על ההתארגנות המבנית של הכרומטין סביב אזורים של ניזק ולתרום לתיקון דנ&quot;א 6. מעבר להשתתפות ישירה בתיקון, תפקידים נוספים כבר תאר ל53BP1 בDDR, כגון הסדרת מחסום S תוך, מחסום G2 / M, והפעלת DDR חלבונים במורד זרם 7-9. לאחרונה, התגלה כי 53BP1 אינו מהווה מוקדים בתגובה לניזקי DNA הנגרמים במהלך מיטוזה, במקום לחכות לתאים להיכנס G1 לפני localizing לסביבה של 6 DSBs. חלבוני DDR כגון 53BP1 נמצאו לקשר עם מבני mitotic (כגון kinetochores) במהלך ההתקדמות במיטוזה 10. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של 2 ו - 3-D הדמיה חייה תא לדמייןהיווצרות 53BP1 המוקדים בתגובה לדנ&quot;א סוכן camptothecin המזיק (CPT), כמו גם התנהגותו של 53BP1 במהלך מיטוזה. Camptothecin הוא topoisomerase אני מעכב שבעיקר גורם DSBs במהלך שכפול הדנ&quot;א. כדי להשיג זאת, השתמש חלבון היתוך ניאון תואר קודם 53BP1-mCherry לבנות מורכב מחלבון תחום 53BP1 מסוגלת להיקשר 11 DSBs. בנוסף, השתמש חלבון היתוך ניאון היסטון H2B-GFP לבנות מסוגל לפקח דינמיקת הכרומטין לאורך מחזור התא אך בפרט במהלך 12 מיטוזה. הדמית תא חייה בממדים רבים היא כלי מצוין להבנה מעמיקה יותר של התפקוד של חלבונים בתאי DDR האיקריוטים.

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ&quot;א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

שברים דו-גדיליים (DSBs) הם הנגעים המזיקים ביותר ב-DNA שתא עלול להיתקל בהם. אם לא יתקנו, לשברים דו-גדיליים יש פוטנציאל רב ליצור...

הדגמה זו משתמשת בדימוי תאים חיים בדו-ממד (2D) ובתלת-ממד (3D) כדי להבין את הקשרים המרחביים והזמניים של חלבונים המעורבים בתגובה לנזקי DNA. ראשית, בצע טרנספקציה או טרנסדוקציה לקו התאים הנבחר באמצעות קונסטרוקטים של ביטוי המכילים סממנים פלואורסצנטיים מתאימים; במקרה זה M Cherry ו-GFP. לאחר מכן, רכוש סדרה של סרטוני ביקורת המראים את התאים המסומנים פלואורסצנטית בתנאים נורמליים.לאחר מכן, יש להחיל טיפול מתאים וללכוד נתונים על השפעות הטיפול בתהליך התאים הפלואורסצנטיים, ולנתח את נתוני הווידאו עבור מערכות יחסים מרחביות-זמניות של חלבונים. בסופו של דבר, מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תאים חיים יכולה לפרט דינמיקה תאית, כגון היווצרות מוקדי 53 BP one בתגובה לחומרים הגורמים לנזק ל-DNA או את התנהגותו של 53 BP one במהלך המיטוזה. התעניינו לראשונה בדימות תאים חיים בדו-ממד ובתלת-ממד כאשר רצינו לבחון כיצד טיפולים שונים השפיעו על המיטוזה בקווי תאים מסוימים.גישה ניסיונית זו מאפשרת לנו לחקור את התגובה לנזקי DNA ואת השמירה על היציבות הגנומית בקלות רבה יותר מאשר בשיטות מסורתיות. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור כיצד חלבונים מסוימים מקיימים אינטראקציה במסלולי איתות שונים ובקווי תאים שונים. היתרון המרכזי של דימות חי (live-cell imaging) על פני טכניקות מסורתיות, כגון ציטוכימיה, הוא היכולת לחקור את החלבונים המגיבי

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה, אנו מתארים את שיטת האימונופלואורסנציה כדי לדמיין את הלוקליזציה של חלבוני תיקון הדנ"א γH2AX ו- 53BP1 באתרים של הפסקות DNA דו-גדילי בגרעין התא המוקרנ.

הדמיה מבוססת אימונופלואורסנציה של אינטראקציות חלבון תיקון DNA

לייזרים משמשים לעתים קרובות במחקרים של התגובה התאית לנזקי DNA. עם זאת, הם מייצרים נגעים אשר מרווח, תדירות, ואת התנגשויות עם מזלגות שכפולים נדירות מאופיינות. כאן, אנו מתארים גישה המאפשרת קביעת פרמטרים אלה עם crosslinks interstrand לייזר מקומי.

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

פרוטוקול זה מציג מערכת גנים כתב חדשה ואת ההתקנה הניסיונית כדי לזהות שעתוק ב- DNA כפול גדיל נשבר עם רגישות מולקולה אחת.

הדמיה של תאים חיים של פעילות תמלול בהפסקות דו-סטרנד DNA

למד הדמיה תלת-ממדית של תאים חיים לחקירת חלבוני תגובת נזק לדנ"א. שיטה זו מאפשרת לעקוב אחר דינמיקת חלבון 53BP1 בזמן אמת ולנתח את השפעת סוכני הנזק על תהליכי מיטוזה.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ"א

גלה סרטונים נוספים