שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ"א
28 בספטמבר 2012
פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ"א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.
הדגמה זו משתמשת בהדמיית תאים חיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים כדי להבין את היחסים המרחביים הזמניים של חלבונים המעורבים בתגובת הנזק ל-DNA. ראשית, העבירו או התמרו את קו התא שבחרתם עם מבני ביטוי המכילים סמנים פלואורסצנטיים מתאימים. כאן M Cherry ו-GFP רוכשים לאחר מכן סדרה של סרטוני בקרה המציגים את התאים המסומנים בפלואורסצנט בתנאים רגילים.
לאחר מכן יש ליישם טיפול מתאים וללכוד נתונים של השפעות הטיפול על תהליך התאים הפלואורסצנטיים ולנתח את נתוני הווידאו ליחסים זמניים מרחביים של חלבונים. בסופו של דבר, מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים חיים יכול לפרט דינמיקה תאית כמו היווצרות של מוקדים של 53 BP אחד בתגובה לגורמים מזיקים ל-DNA או התנהגות של 53 BP אחד במהלך מיטוזה. התחלנו להתעניין בהדמיית אורח חיים דו-ממדית ותלת-ממדית כשרצינו לחקור כיצד טיפולים שונים משפיעים על מיטוזה בשורות תאים מסוימות.
גישה ניסויית זו מאפשרת לנו לחקור את תגובת הנזק ל-DNA ושמירה על יציבות גנומית ביתר קלות מאשר שיטות מסורתיות. בנוסף, אתה יכול להשתמש בשיטה זו כדי לחקור כיצד חלבונים מסוימים מתקשרים במסלולי איתות שונים ובקווי תאים שונים. היתרון העיקרי של הדמיית אורח חיים על פני טכניקות מסורתיות כמו כימיה של ציטו הוא שהיא מאפשרת לחקור את חלבוני תגובת הנזק של ה-DNA בזמן אמת.
אופטימיזציה של תנאי ההקלטה הנכונים יכולה להיות מאתגרת. ניתן להשתמש בהדגמה זו כדי לראות את הצעדים הקטנים הרבים הדרושים כדי להבטיח הצלחה. זכור שהתמדה משתלמת בכל הנוגע למזעור הלבנת תמונות, מציאת מרווחי ההקלטה הנכונים ומשך זמן ההקלטה הנכון וכו'.
העבירו או התמרו את קווי התאים המתאימים עם הפלסמידים לביטוי חלבון היתוך mCherry ו-GFP. שמור על התרביות תחת בחירת תרופות ובדוק מעת לעת את ביטוי החלבונים הפלואורסצנטיים יום לפני רכישת התמונה. קצרו את התאים באמצעות טריפסין.
לאחר מכן זרעו תרביות בצפיפות נמוכה על צלחות תחתונות זכוכית פלואורו בגודל 3.5 סנטימטר. פרוטוקול זה פותח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב SD של Zeiss cell observer, המצויד במעמד אחד של axio observer Z ראשית, ודא שגז ה-CO2 רץ למודול ה-CO2 של מערכת הדגירה. אם המיקרוסקופ נתמך על ידי Airtable נגד רעידות, הפעל את אספקת האוויר ל-Airtable.
כעת הפעל את החשמל עבור מעמד המיקרוסקופ מצלמות יחידת דיסק מסתובב, מודולי דגירה, תאורת HXP, במה ממונעת, לייזר ארגון ומחשב. הפעל את המתגים עבור קווי הלייזר שישמשו אותם. הפעל את תוכנת הראייה של Axio.
ניתן להתאים את תוכנת Avision עם חלונות ולמשוך תפריטים ספציפיים למיקרוסקופ ולרכיבים שבהם היא שולטת ככזה, לכל ממשק משתמש יש מראה ייחודי פוטנציאלי כשעה לפני ההדמיה. אתר את הפקדים לחממה והפעל את החימום לתא העליון ולצלחת הבמה.
הגדר את הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס. הפעל את בקרת ה-CO2 והגדר את הרמה ל-5%בחר את עדשת המטרה להדמיה במחקר זה. עדשת האובייקט דורשת שימוש במדיום טבילה בעל מקדם שבירה הדומה למים.
אם אתה צריך לדמות מספר מיקומים לאורך פרקי זמן ארוכים, הקפד ליישם מספיק מדיום טבילה כדי שההיקף לא יתייבש. הניחו את צלחת התרבות על הבמה והביאו את עדשת המטרה למעלה למגע עם החלק התחתון, באמצעות פקדי המיקרוסקופ או התוכנה. כוון את האור הנפלט לחלקי העיניים ובחר את סט מסנן השדה הרחב המתאים לאות הפלואורסצנטי המעניין.
עכשיו התבוננו מבעד לעדשות העיניים. מקד את התמונה ואתר שדה תאים מתאים באמצעות התוכנה או פקדי המיקרוסקופ. כוון את האור הנפלט הרחק מחלקי העיניים אל היציאה באמצעות יחידת הדיסק המסתובב הקונפוקלי בתוכנה.
הפעל את הלייזר המתאים למחקר זה. עבור כל ערוץ, התאם את עוצמת הלייזר על ידי התאמת בקרת המסנן המתכוונן של kuo אופטי לרמה מתאימה. לאחר מכן, בחר את המראה הדיכרואית ומסנני הפליטה המתאימים.
פתח את התריס ליחידת הדיסק המסתובב. כעת בחר את החלון החי כדי להציג את שדה הראייה הנוכחי. כעת פתח את חלון בקרת המצלמה.
בחר את המצלמה שבה יש להשתמש והגדר את זמן החשיפה לכ-100 אלפיות השנייה. התאם את האחוז ואת הרווח האלקטרומגנטי לפי הצורך. כמו כן, פתח את הבקרה עבור יחידת הדיסק המסתובב הקונפוקלי והתאם את מהירות הדיסק המסתובב על ידי הזנת זמן החשיפה של המצלמה שהוגדר לצילום תמונה מתאימה.
לחץ על הגדר כדי לנעול את השינוי. כעת פתח את חלון הרכישה הרב-ממדי. בחר את כרטיסיית הערוץ וטען או בחר ערוצים מתאימים שהוגדרו עבור Flora Fours.
כדי להבטיח רישום תמונה, השתמשו במראה דיכרואית משותפת לשני הערוצים. הגדר את התוכנה למיקוד אוטומטי. המשך לחלון MDA ולחץ על לשונית המחסנית ZS.
בחר מחסנית ZS במיקום המיקוד הנוכחי. הגדר את הטווח עבור Zack של 10 מיקרון ובחר אופטימלי למספר השלבים כדי להבטיח דגימה של nyquist דרך Z.כעת לחץ על התחל ונתח את תמונת מחסנית Z המתקבלת. בחר את כרטיסיית השעה.
הגדר את המרווח בין נקודות זמן ההדמיה לבין משך הזמן הכולל של ההפעלה. להדמיה רב-נקודתית של מספר תאים בצלחת יש לפתוח את חלון מד"א. בחר את כרטיסיית המיקום וודא שהגדרת ההחלה לפני או אחרי נקודת זמן לכל מיקום מסומנת.
כעת בחר סימן. מצא באמצעות התצוגה החיה, הזז את המנה ובחר שדות ראייה מתאימים. לחץ על התחל בתפריט הרכישה הרב-ממדית כדי להתחיל את הניסוי ולהקליט סרטון בקרה.
המשך להוסיף את הטיפול המתאים ולהקליט את סרטון הניסוי במרווחי זמן קבועים לפרק זמן מוגדר. עבור קו תאים זה ולניטור כל תהליך המיטוזה, השתמשנו במרווח של שבע וחצי דקות וזה במשך ארבע עד חמש שעות. תצטרך לקבוע את ההגדרות הספציפיות עבור קו התא שלך ועבור מה שאתה רוצה ללמוד.
פתח את תוכנת המהירות, צור ותן שם לספרייה חדשה וייבא את קבצי הווידאו הניסיוניים לצפייה בקבצים. נסה להשתמש בהגדרת המיקוד המורחב, התאם את הסרטונים לפי הצורך. Velocity מצוידת במגוון כלים שיעזרו לשפר את איכות התמונות שרכשת.
אם ההגדרות במיקרוסקופ מתאימות, זה יחסוך הרבה זמן בהמשך בעריכה. לעתים קרובות זה מועיל להאציל את התמונות שלך ולהתאים את הבהירות והניגודיות הצרכים הספציפיים שלך ישתנו בהתאם לניסוי שלך כדי להציג את התאים בתלת מימד. עברו לקביעת האטימות התלת-ממדית.
זה מאפשר סיבוב של התאים המעובדים בתלת מימד בחלל, ובכך מספק נקודות מבט מרובות של מבנים מעניינים בתוך התאים. סרטים. ניתן לייצא תמונות סטילס למגוון סוגי קבצים בהתבסס על העדפת המשתמש בהשוואה לפקדים. תאי פיברובלסטים שנחשפו ל-CPT יצרו מוקדים תוך חמש עד 10 דקות ושמרו על מוקדים אלה לאורך כל הרישום.
מעניין לציין כי בתאי כליה עובריים אנושיים, 53 BP אחד מתנתק מכרומטין בתחילת המיטוזה, ויוצר אובך דק סביב הכרומוזומים המתעבים. כאשר הטלף מתרחש והמיטוזה מגיעה לסיומה 53 BP אחד, שוב מצטבר למוקדים נפרדים. אנו מקווים שסרטון זה יאפשר לך לחקור את היחסים המרחביים-זמניים של חלבונים המעורבים בתגובת הנזק ל-DNA כמו גם מסלולים אחרים.
לדוגמה, בתחום הדינמיקה של כרומטין, נעשה שימוש בטכניקה זו כדי לחקור כיצד קשירה אחת של 53 BP משפיעה על תנועת הקצוות הטלומריים של ה-DNA. לאחר יצירת תאים מהונדסים גנטית, ניתן לבצע הדמיית תאים חיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים תוך כארבע עד שמונה שעות. ודא שהגדרות המיקרוסקופ מותאמות כראוי כדי לקבל הדמיה אופטימלית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשה של חלבון איתות של שבירת דו-גדיל DNA המופעל בתגובה לנזק ב-DNA וכן את מיקומו במהלך מיטוזה. ההדגמה משתמשת בהדמיה תלת-ממדית של תאים חיים כדי לחקור את היחסים הזמניים-מרחביים של חלבונים המעורבים בתגובה לנזק ב-DNA.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- תגובה לנזק ב-DNA
- הדמיה של תאים חיים
רקע
- הבנת תגובת הנזק ב-DNA חיונית לויסות מחזור התא.
- סמנים פלואורסצנטיים עוזרים להמחשה של דינמיקה של חלבונים בתאים חיים.
- טכניקות הדמיה דו-ממדיות ושלוש-ממדיות משפרות את הניתוח המרחבי והזמני.
- 53 BP1 הוא חלבון מרכזי המעורב בתגובת הנזק ב-DNA.
מטרת המחקר
- להמחיש את ההפעלה והמיקום של חלבוני איתות של נזק ב-DNA.
- לנתח את ההשפעות של סוכני נזק ב-DNA על הדינמיקה התאית.
- לחקור את התנהגות החלבונים במהלך מיטוזה.
שיטות ששימשו
- לבצע טרנספקציה או טרנסדוקציה של קווי תאים עם מבני סמנים פלואורסצנטיים.
- לרכוש סרטוני בקרה של תאים מסומנים פלואורסצנטית בתנאים רגילים.
- ליישם טיפולים ולתעד נתונים על השפעות הטיפולים.
- לנתח נתוני וידיאו ליחסים זמניים-מרחביים של חלבונים.
תוצאות עיקריות
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים מגלה את הדינמיקה של היווצרות מוקדי 53 BP1.
- התנהגות החלבון במהלך מיטוזה מושפעת מסוכני נזק ב-DNA.
- הדמיה דו-ממדית ושלוש-ממדית מספקת תובנות לגבי התגובות התאיות לטיפולים.
- ניתן לנתח ביעילות את היחסים הזמניים-מרחביים של החלבונים.
מסקנות
- שיטה זו מאפשרת תצפית מפורטת על חלבוני תגובת הנזק ב-DNA.
- הדמיה של תאים חיים היא כלי רב עוצמה לחקר הדינמיקה התאית.
- הבנת התהליכים הללו יכולה לסייע באסטרטגיות טיפוליות נגד נזק ב-DNA.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Live cell 2D and 3D imaging of DNA damage response proteins such as 53BP1 enables direct visualization of spatiotemporal protein dynamics following genotoxic stress. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery, particularly for targets and pathways involved in genomic stability. Integrating these imaging approaches informs target validation and portfolio triage decisions in oncology and genome maintenance programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables real-time interrogation of DNA repair pathway activation and protein recruitment.
- Supports functional validation of DDR targets by visualizing protein localization and kinetics.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying pathway engagement and cellular context.
- Provides predictive confidence for advancing DDR modulators or synthetic lethality strategies.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live cell systems for quantitative assessment of DDR protein dynamics.
- Enables reproducible measurement of foci formation and chromatin changes post-treatment.
- Supports assay standardization for compound screening targeting DNA repair pathways.
- Allows for scalable adaptation to multiple cell lines and genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant models of genomic instability.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of DDR-targeting agents.
- Enables risk-adjusted advancement by linking mechanistic readouts to translational endpoints.
- Supports biomarker development for DDR pathway engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging method integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting both hypothesis-driven target validation and downstream assay development for DDR-focused programs.
- Discovery Biology: Visualizes protein recruitment and chromatin remodeling in response to DNA damage, clarifying pathway function.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts of DDR protein foci for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of spatiotemporal protein dynamics and comparison across treatments or cell lines.
- Translational Research: Connects mechanistic imaging outputs to disease-relevant models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for studying diverse DDR proteins and pathways across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DDR target validation.
- Operational Value: Standardizes live cell imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust mechanistic data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of DDR-targeting assets and translational biomarker strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging, fluorescent protein engineering, and image analysis.
- Demands access to advanced confocal microscopy and environmental control systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to various cell lines and DDR proteins with appropriate construct design.
- Imaging conditions must be optimized to minimize photobleaching and ensure data quality.
