כימות חדירות גלומרולרי של מקרומולקולות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ 2-פוטון בחולדות Wistar מינכן

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין בהצלחה את יחידת הסינון של הנפרון ולכמת סינון של מקרומולקולות פלואורסצנטיות על פני מחסום הסינון לחלל השתן in vivo. זה מושג על ידי הכנת שלב המיקרוסקופ עבור החיה החיה. לאחר מכן, הכליה נחשפת והחולדה מונחת על הבמה.

לאחר מכן מזוהים וממופים גלומרולים בודדים ומתקבלות תמונות תלת מימד ברקע. לבסוף, מוזרק אלבומין פלואורסצנטי. נפחים תלת מימדיים של גלומרולים בודדים נרכשים, והחדירות מכומתת.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את מקדם הסינון של מקרומולקולות על פני הגלומרולים בכליה באמצעות מיקרוסקופ פוטונים תוך בקבוקוני. היתרון העיקרי של מיקרוסקופ שני פוטונים הוא בכך שהוא מאפשר כימות בו זמנית של סינון גלומרולרי וגם ספיגה חוזרת של צינוריות פרוקסימליות וטרנסציטוזיס בבעל החיים. יחד עם זאת, ההשלכות של הטכניקה חורגות ממכניסטיות לאבחון וטיפול כחשיבות של הבנת תפקיד הסינון הגלומרולרי והצינורי הפרוקסימלי.

ספיגה חוזרת של אלבומין היא קריטית בקביעת מיקוד הטיפול. לאחר הרדמת החולדה, הכנס קו גישה ורידי דרך וריד הצוואר או הירך וגלח את הצד השמאלי ממש מתחת לכלוב הצלעות ממש מעל הירך השמאלית. זהו ניתוח שאינו הישרדותי.

הנח את החולדה שטוחה על צדה הימני כך שהצד השמאלי המגולח פונה כלפי מעלה. ודא שהוא שטוח על הספסל כשהיציבה שלו מוארכת ולא כפופה עם כפות קדמיות נוגעות זו בזו וכפות אחוריות נוגעות זו בזו בעדינות רבה. משש כדי למשש את הכליה כדי לקבוע היכן היא שוכבת באופן טבעי בתוך הרטרופריטונאום, והשתמש בשארפי כדי לצייר קו ישר במקביל לגוף עם זוג מלקחיים לשיניים.

הרם את העור והשתמש בזוג המוסטטים כדי לצבוט את העור לאורך הקו המצויר כדי לרסק את הרקמה ולמנוע דימום באמצעות מספריים כירורגיים. חותכים לאורך החתך. השתמש באותו הליך לחיתוך שכבת השריר החיצונית, שהיא דקה לפי הצורך.

השתמש בהמוסטטים כדי למנוע דימום לחתך בשכבת השריר הפנימית, מה שיחשוף את הצפק. ממשש מחדש את הכליה כדי להעריך את הגודל. צבט קו חתך קטן יותר מהכליה כדי להבטיח שהחתך נמצא ממש מעל הכליה.

עדיף להפוך את החתך הזה לקטן מדי ולהגדיל אותו במידת הצורך. אתר את הכליה והשתמש במלקחיים כדי לאחוז בשומן שמסביב הפועל לכיוון הקוטב התחתון של הכליה בצורה של יד על יד. לאחר שמגיעים לקוטב התחתון של הכליה, משוך בעדינות את הכליה דרך החתך תוך כדי לחיצה עדינה מאוד מתחת לכליה כדי להוציא אותה החוצה.

אם החתך קטן מדי, מועכים את שכבת השריר וחותכים כדי להרחיב אותה. חזור על ההליך כדי להוציא את הכליה לאחר הוצאת כליית החולדה והנחת החולדה על במת המיקרוסקופ להדמיה. אם המיקרוסקופ שלך מצויד בבמה ממונעת המסוגלת לסמן מיקומים, באמצעות מוט פלואורסצאין דו-מעבר, מסנן דומין ומטרה בעלת עוצמה נמוכה, מצא ומרכז גלומרולים בודדים, שיופיעו כמבנים עגולים ריקים המוקפים בצינורות פרוקסימליים.

בעל אוטופלואורסצנציה כתומה צהובה אינהרנטית מסמן כל מיקום, העבר את הצריח ליעד טבילה במים בעוצמה גבוהה יותר, וצלם מערכי נתונים תלת מימדיים של כל גלומרולי. לוודא שהלולאות הנימים וחלל באומן נראים בבירור. שימוש בפלטת צבעים פסאודו יעזור לדמיין את המבנים הללו.

לאחר מכן, תוך התמקדות בכלי דם שטחי להחדיר לאט אלבומין פלואורסצנטי, ולוודא שניתן זמן לאפשר פיזור מערכתי למולקולות בעלות מקדם ציפוי גלומרולרי נמוך או GSC, חיוני למקסם את ערכי העוצמה בפלזמה, אך לא להגיע לרמות שירוויחו את גלאי הצילום במיקרוסקופ. זה מגביר את יכולת הזיהוי של מולקולות מסוננות לאחר המתנה של כ-10 דקות כדי לאפשר לכל שברי משקל מולקולרי קטנים פוטנציאליים להתנקות, רכוש נפחים תלת מימדיים במרווחים של מיקרון אחד שישמשו לחישוב אלבומין באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מטמורפוזית. טען את מערכי הנתונים התלת-ממדיים יחד עם תמונות הרקע עבור כל גלומרולי בנפח המכיל את האלבומין הפלואורסצנטי.

אתר לולאה נימית שטחית עם מספיק מקום ריק בין השוליים המוגדרים שלה לקצה קפסולת באומן. באמצעי האחסון ברקע. אתר את אותו מישור מוקד, שאמור להכיל את כל הרמזים החזותיים של התמונה המכילה אלבומין

בחר אזור בתוך הלולאה הנימים המעניינת ושים לב לקריאת העוצמה הממוצעת. לאחר מכן, בחר אזור בתוך מרחב באומן ושים לב לקריאת העוצמה הממוצעת. אלה ישמשו כערכי רקע לכמות.

בחר את האזור הדומה בתוך מרחב באומן באלבום המכיל תמונה. עשה זאת עבור לפחות שני אזורים אחרים כדי לקבל ערך עבור העוצמה הממוצעת בתוך המרחב של באומן. בחר את הלולאה הנימים עם עוצמת הפלזמה הבהירה ביותר וצייר סביבה אזור.

לאחר מכן, באמצעות פונקציית הסף, הדגש את הערכים הבהירים בתוך הפלזמה המחזורית, הימנע מהפסים הכהים שמסתובבים בתאי הדם האדומים. שימו לב לערכי העוצמה הממוצעים של חלל הפלזמה שנבחר. חשוב לבחור באופן מועדף את האזורים הבהירים של הפלזמה מכיוון שגורמים בתוך הדם רק ישמשו לגרום להערכת חסר של רמות הקרינה בפלזמה.

הזן את הערכים בגיליון אלקטרוני של Excel כדי לחשב את ה-GSC כאשר GSC שווה להפרש של שטח הקשת הגולמי. עוצמה פחות רקע עוצמת מרחב באומן חלקי ההבדל של עוצמת הלולאה הנימים הגולמית פחות עוצמת הלולאה הנימים של הרקע. ספיגת אלבומין פלואורסצנטי מסונן מתרחשת בעיקר בקטע המוקדם של צינורות פרוקסימליים.

ה-S, לוח זה מציג חתך רוחב של גלומרולוס וקטע S אחד שנלקח מחולדת פרומפטר של מינכן וויסטאר, כ-20 דקות לאחר עירוי של בולוס RSA אדום טקססי. פתיחת החלל של באומן והקליטה הנלהבת של האלבום באדום מוצגת בקטע S one. פאנל זה מציג הקרנה תלת מימדית רדודה של 20 מיקרון של אותו מערך נתונים, ומוצג כאן הקרנה בהספק נמוך יותר שצולמה כ-60 דקות לאחר העירוי.

תמונות אלו מדגימות כי מיקרוסקופיה תוך-חיונית יכולה לאפשר הדמיה של גורל החומר המוזרק לאחר סינון המאשר במידה מסוימת, מקדם הסינון שנצפה המוצג כאן הוא תמונות שצולמו מפני השטח גלומרולוס. פאנל זה הוא תמונת רקע ותמונה זו צולמה כ-12 דקות לאחר עירוי של אלבומין סרום עכברוש טקסס אדום. שני לוחות אלה מצוירים בצבע פסאודו.

שלושה אזורי עניין קטנים שצוירו בחלל של באומן משמשים לחישוב העוצמה הממוצעת של אלבומין פלואורסצנטי שנע על פני מחסום הסינון. ערכי עוצמה ממוצעים עבור האזורים הבודדים דווחו באזור המודגש בתיבת הדו-שיח סטטיסטיקה של אזור ההצגה. ערך ה-GSC עבור אלבומין של 0.0111 הנגזר עבור גלומרולוס בודד זה נופל בסצנת הטווח בזן זה של חולדות כוכב מינכן כאשר הוא במצב מוזן.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ניתוח כמותי ואיכותי על מבני כליה אחרים כדי לענות על שאלות נוספות כגון הסחר הסופי של המקרומולקולה לאחר סינון לחלל השתן לאחר התפתחותה. טכניקה זו אפשרה לחוקרים בפיזיולוגיה של הכליות לחקור תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים דינמיים, לא רק פעם אחת אלא לאורך. עם הזמן, זה היה.