Name: כימות חדירות גלומרולרי של מקרומולקולות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ 2-פוטון בחולדות Wistar מינכן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: למד כיצד לכמת חדירות גלומרולרית של מקרומולקולות פלורסנט בחולדות Wistar מינכן באמצעות מיקרוסקופ 2-פוטון. שיטה זו מאפשרת מחקר ישיר של תפקוד הכליה בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר סילביה B קמפוס, Bilderback וג&#39;ורג&#39; J רודוס להשלמת הליכים כירורגיים מעורבים מיקום של קווי גישה ורידים. הם גם רוצים להודות לשרה E לגמול לשמירה על מושבות מינכן-Wistar המורכבת משני זנים וFrömter סימונסן.

1. נטיה של סרום אלבומין לעכברוש כלוריד Sulfonyl 101 sulfo-Rhodamine (טקסס האדומה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 100 מ&quot;ג של עכברוש 6.667 מיליליטר סרום אלבומין (RSA) ב100 מ&quot;מ של סודיום ביקרבונט pH 9.0, ריכוז סופי 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בשפופרת 50 מיליליטר חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מקום בכוס קרח / מים ומגניבים בין 0 עד 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של לפוראמיד דימתיל איכות הגבוהה נטול מים (DMF) לבקבוקון 10 מ&quot;ג של כלוריד Sulfonyl האדום טקסס (TRSC); מערבולת על מדיום במשך 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון RSA במערבולת בינונית ומוסיף TRSC המומס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף 50 מ&quot;ל חרוטי בנייר הכסף (Parafilm יכול לשמש כדי להבטיח חותם חזק נוצר), מקום אופקי בדלי קרח w / קרח בלבד ומניח על נדנדה כדי להתסיס פתרון לאט (למנוע היווצרות של בועות), מאפשרים תגובה להמשיך ב0 עד 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 5 ליטר של תמיסת מלח 0.9%, והרטיב 50 kDa משקל מולקולרי נותק תא שיכול להיות קרום דיאליזה) עם קליפים, ב) דיצינורות alysis כמו בלצוף-lyzer, או ג) קלטת שקופית-lyzer (כל מתאים להסרת TRSC unconjugated). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת תגובת מקום בתא הדיאליזה והמקום במכל L w 5 / תמיסת מלח 0.9%, dialyze לילה בשעה 4 ° C עם תסיסה עדינה באמצעות סרגל ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את פתרון דיאליזה L 5 בבוקר ובשעתי אחר הצהריים מאוחרות, עד שתוצאות דגירה לילה בכמעט ללא שינוי צבע (זה בדרך כלל לוקח ~ 48 שעות עם לפחות 4 חילופים). בנוסף, עם MWCO של 50 kDa להיות כל כך קרוב למגוואט של RSA, 66kDa; זה אפשרי לא לייצר פתרון ברור, זה יהיה תלוי בהפצה בגודל הנקבובית של הקרום; 60 שעות ו -5 חילופים היא יותר ממספיק זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח מדוד ולחלק את המשקל ההתחלתי של 100 מ&quot;ג בנפח לתת ריכוז משוער של TR-RSA; בדרך כלל טווח ריכוזים 10-13 מ&quot;ג / מ&quot;ל. צבע הסופי: יחס אלבומין צריך להיות ~, 1 fluorophore 04:01 ל15,000 Daltons של MW החלבון. חנות ב 4 ° C, אף פעם לא להקפיא את פתרון TR-RSA, כתוצאת פיצול שעלול להתרחש תשנה ערכי חדירות. </li></ol> 2. מכין את הבמה מיקרוסקופ הפוכה להגדרות הדמיה / מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ~ 4-7 חתיכות של נייר חיטוי (¾ &quot;ארוך כ) נערמות אחד על השני בצורה מושלמת בתוך צלחת 50 מ&quot;מ עם תחתית coverslip 40 מ&quot;מ (צלחת תחתית coverslip). אלה צריכים להיות ממוקמים קרובים יותר לאחד הקצוות, כך ש קצה של הקלטת יהיה ליצור קשר עם הקצה של עקמומיות של הכליה, אך לא לחסום את נתיב האור האובייקטיבי (האיורים 1A ו-1B); חולדות גדולות יותר ידרשו יותר מקום בין הסרט לבין קצה הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 רפידות Repti-THERM הקרובים לבמה לצד המנה 50 מ&quot;מ (איור 1 א). הנח שמיכת ז&#39;קט מים התחממות מעל הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקסם את היעילות בעת איסוף תמונות על ידי הבטחת הצריח האובייקטיבי יש אוויר O 10xR 20x (אוויר או מים טבילה) אובייקטיבי ואובייקטיבי טבילה במים מופעל גבוהה כדי לאסוף תמונות כדי לכמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדמיה את הדרך היעילה ביותר כדי להוסיף מים למטרות היא לסובב אותם לצד ומוסיף מים באמצעות מזרק 1 סמ&quot;ק עם חתיכה ארוכה של PE-200 צינורות שיכולים להגיע לפסגה של המטרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את עוצמת העירור של לייזר 10watt ל ~ 15-20% תוך שימוש במסנני הצפיפות ניטראליים על התוכנה. את photodetectors descanned שאינו זרח גליום arsenide נקבעים 750 לאסוף פליטות ירוקות, ו625 לאסוף את הפליטה אדומה. פליטה הכחולה (כגון Hoechst 33342 גרעיני הכתם) נאספות באמצעות גלאי multialkaline nondescanned סטנדרטי עם הגדרה בין 750-800. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח את האוסף הנכון של פליטות בעצימות הנמוכות בתוך החלל של באומן, לוודא את הגבולות התחתונים של הגלאים מוגדרים כדי לא לכלול את הערכים הללו. סמני אזהרה חזותיים יציינו אם הרגישותההגדרה היא נמוכה מדי וערכים אלה מקבלים ערך עוצמת אפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מזרק 1 סמ&quot;ק עם ~ 5-8 מ&quot;ג של אלבומין פתרון הניאון מדולל עם 0.9% מלח סטרילית כדי להעלות את הנפח הכולל עד 1 סמ&quot;ק. </li></ol> 3. הדמיה חושף את הכליה בחולדת Wistar מינכן לIntravital 2-פוטון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם עכברוש מראש מורדם באמצעות Pentabarbitol (פתרון מ&quot;ל 50 מ&quot;ג /, 120 גר &#39;משקל גוף μl/100), Inactin (פתרון מ&quot;ל 130 מ&quot;ג /, 120 גרם במשקל μ/100 גוף), או isofluorane (5% אינדוקציה, 1.5 לרמה של 2.5% אחזקה), שורת שכינת ורידי גישה (או ורידי הצוואר או הירך), והאגף השמאלי גילח מ, ממש מתחת לבית החזה כדי בדיוק מעל הירך השמאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה שטוחה בצדו ממני, כך שצד השמאל, מגולח הוא פונה כלפי מעלה; לוודא שהוא שטוח על השולחן, עם היציבה שלו מוארכת ולא שפופה, עם רגליו קדמיות נוגעות זה בזה ומאחור כפות נוגעות זה בזה (איור 2 א). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוד בעדינות למשש להרגיש את הכליה כדי לקבוע היכן מניח אותו באופן טבעי בתוך retroperitoneum ולצייר קו ישר במקביל לגוף (מבית החזה לירך) באמצעות טוש (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את העור עם זוג המלקחיים שיניים, ולצבוט את העור לאורך הקו נמשך באמצעות זוג hemostats כדי למחוץ את הרקמה ולמנוע דימום. לחתוך לאורך החתך בעזרת זוג המספריים כירורגיות. ריסוק העור החיצוני ואת שכבות שרירים לפני החיתוך יהיה להפחית באופן דרמטי ובדרך כלל למנוע דימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך עבור שכבת השריר החיצונית, שהוא רזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתך לתוך שכבת השריר הפנימית, שיחשוף את הצפק, מחדש למשש את הכליה כדי להעריך את הגודל. צבוט קו חתך קטן יותר מהכליה; מבטיח חתך הוא רק מעל הכליה. עדיף לעשות החתך הזה קטן מדי ולהפוך אותו גדול יותר במידת הצורך. אם זה נעשה גדול מדי, תפירה תידרש.החתך אחרון זו הוא קריטי; רחוקה מדי מעל לכל כיוון ישפיע על יציבות על הבמה ולגרום גם ממצא תנועה מנשימה (תרחיש מקרה הטוב ביותר) או ימתח פרפוזיה גבעול ולהפחית לרעה הכליות (תרחיש מקרה הגרוע ביותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את הכליות (כפי שמוצג באיור 2) ואחיזת השומן שמסביב באמצעות מלקחיים, פועל לקוטב התחתון של הכליה ביד אחרת יד האופנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהקוטב התחתון של הכליה הוא הגיע, משוך בעדינות את הכליה דרך החתך בעדינות רבה תוך סחיטה מתחת לכליות לexteriorize. אם החתך קטן מדי, למעוך את שכבת השריר ולחתוך להרחבתו; לחזור על התהליך לexteriorize כליות. </li></ol> 4. הצבת עכברוש Wistar מינכן בשלב הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הכליות לכיוון הקצה של צלחת coverslip עם הכליה מעט הסתובב לכיוון (בצד האחורי) הגב של העכברוש כל כך בצד הגחוני של כליותיישל יצירת קשר עם צלחת תחתית coverslip (איור 1 א). הוסף% פתרון חימם, סטרילי 09. מלח למנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסתכל דרך אובייקטיבי 10x או 20x ולבדוק לתנועה. אם הצעה הוא זוהה, לגלגל את העכבר מעל מעט כל כך את בית החזה הוא רחוקה יותר מצלחת תחתית coverslip; לוודא הכליות הן קרובה לקצה הצלחת ללא מתיחה (איור 1) pedicle כליות. </li></ol> 5. רכישת תמונות לכמת חדירות כליות של אלבומין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב חדירות גלומרולרי (מקדם Glomeruluar הסינון; GSC) של כל מקרומולקולה ידרוש לקחת תמונות רקע התייחסות של glomeruli הבודדים לפני העירוי של מולקולת הניאון. אם המיקרוסקופ שלך מצויד בבמה ממונעת מסוגלים סימון מיקומים, ולמצוא glomeruli הבודדים מרכז באמצעות העצמה נמוכה יותר אובייקטיבי ולסמן כל מיקום. מסירה כפולה העמסה / Rhodamine epifluorescence filter הוא אידיאלי להליך זה למרות שגם מסנן הפליטה יעבוד (לעומת שלב או ממקורות שאינם הקרינה אחרות של תאורה לא יעבדו). Glomeruli יופיע כמבנים עגולים ריקים מוקפים בצינוריות הפרוקסימלי יש autoflourescence הצהוב כתום גלום כאשר נצפים מבעד לעבור סינון הכפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המיקרוסקופ שלך לא חייב במה ממונעת, לסרוק הכליות בדפוס סריקה במטרה בעצמה הנמוכה ולהפוך את המפה בסיסית של הפרט שבו glomeruli נמצאים; להסתמך על ציוני דרך טבעיות כגון כלי דם שטחיים גדולים הממוקמים מעל הקפסולה הכליות או כתמי שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את הצריח למטרת הטבילה במי החשמל הגבוהה ולקחת ערכות נתונים 3D של כל glomeruli לוודא את לולאות הנימים והמרחב של האומן גלויים לעין. שימוש בצבעי pseudocolor (משהו אחר מאשר B / W) יעזור לדמיין מבנים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התמקדות בכלי דם שטחי להחדיר לאט בtהוא זמן לוודא אלבומין ניאון הוא נתון, כדי לאפשר החלוקה מערכתית. למולקולות עם GSC הנמוך זה הכרחי כדי למקסם את ערכי עוצמה בפלזמה, אבל לא להגיע לרמות שיהיו להרוות את התמונה גלאי במיקרוסקופ. זה מגדיל detectability של מולקולות מסוננות. הערה: יש בדרך כלל 5-7 שניות בין לשגות זמן אלבומין ניאון הוא הציג בפעם שהוא מופיע על המסך (רכישת מסגרות מלאות במסגרת ~ 1 / שנייה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר כ 10 דקות כדי לאפשר לכל ברי משקל מולקולריים קטנים פוטנציאליים כדי לנקות לפני רכישת כרכי 3D במרווחים של 1 מיקרומטר כדי לשמש בחישוב GSC אלבומין. בדרך כלל, המתח של סימונסן של מינכן Wistar חולדות יש הרבה פחות שטח glomeruli, אז כל מה שיכול להיות דמיינו הם צילמו וכימות. יש מתח Frömter מספר גדול בהרבה ולכן אנחנו מגבילים את המספר לכמת ל ~ 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף המחקר את העכברוש הוא מורדמים באמצעות מנת יתר של anesthetIC בשימוש במחקר. Pneumothoracotamy כפול מבוצע כדי להבטיח המתת חסד. </li></ol> 6. חישוב GSC לפלורסנט אלבומין מכרכי 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת עיבוד תמונת Metamorph לטעון את ערכות נתונים 3D עבור כל glomeruli, הן סט הרקע ולהגדיר נלקח לאחר עירוי של אלבומין ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהיקף המכיל אלבומין ניאון לאתר לולאת נימים שטחית עם חלל ריק מספיק מקום בין השוליים המוגדרים שלה והקצה של הקפסולה של באומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהיקף הרקע לאתר אותו מישור המוקד שאמור להכיל את כל הרמזים החזותיים של התמונה המכילה אלבומין. בחר אזור בתוך לולאת הנימים של עניין ולציין את עוצמת הקריאה הממוצעת. הבא בחרו אזור בשטח של באומן ולציין את עוצמת הקריאה הממוצעת. אלה ישמשו כערכי רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת, בחר את האזור הדומה בתוך החלל של באומן בג אלבומיןontaining תמונה. האם זה במשך לפחות שני אזורים אחרים לקחת ערך ממוצע לעצמה הממוצעת בתוך החלל של באומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את לולאת הנימים עם עוצמת הפלזמה הבהירה ולצייר אזור סביבו. הבא באמצעות פונקצית הסף, להדגיש את הערכים הבהירים בתוך הפלזמה במחזור, תוך הימנעות מפסים הכהים שהמחזור של RBC. שימו לב לערכי עוצמה הממוצעים של חלל הפלזמה שנבחר. חשוב לבחור מעדיף את האזורים הבהירים של הפלזמה בגלל גורמים בתוך הדם ישמשו אך ורק כדי לגרום ולהערכה נמוכה מדי של רמות הקרינה הפלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בגיליון אלקטרוני של Excel של מיקרוסופט להזין את הערכים כדי לחשב את GSC שבו: </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells%3B+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504(2007).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489(2009).</li>
<li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447(2012).</li>
<li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601(1992).</li>
<li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides%2C+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat%3A+Effects+of+molecular+size+and+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237(2007).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389(2008).</li>
<li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9(2007).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הצעדים המודגשים כאן מייצגים את מה שאנחנו מרגישים להיות אלה שמייצרים ערכי חדירות עקביות ומדויקים משום שהם לעקוף את המלכודות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיזור: השימוש בfluorophores פולטות אדום מאפשר גבייה יעילה יותר של אור מאז פוטונים באורך גל ארוך יותר הם פחות נוטים להתפזר. או באמצעות fluorophores פולטות ירוק או כחול יציג וריאציה גדולה יותר בGSC בגלל ההשתנות המוגברת בערכי עוצמה מלולאות הנימים והמרחב של באומן <s...

<table><tbody><tr><td>Olympus Floview 1000 מיקרוסקופ קונפוקלי/רב-פוטוני</td><td>אולימפוס אמריקה</td><td></td><td>מסננים לגלאים: כחול 430/100, ירוק 525/50, אדום 605/90</td></tr><tr><td>נעול מצב Ti: ספיר מאי טאי ספקטרום לייזר</td><td>פיזיקה-פיזיקה</td><td></td><td>אורכי גל עירור מתכווננים: ~ 750-1150 ננומטר</td></tr><tr><td>גלאי פוטו פוספיד גליום ארסניד</td><td>Hamamatsu Corp</td><td></td><td>הערה: תצורות רכובות קדמיות או צדדיות זמינות.</td></tr><tr><td>תוכנת עיבוד תמונה Metamorph</td><td>דינמיקה</td><td></td> מולקולרית <td>הערה: גרסה 6.1r1</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corportation</td><td></td><td>2007 גרסת</td></tr><tr><td>טיפול במלקחיים</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי</td><td>Cat# 78266-04</td><td></td></tr><tr><td>מאיו ניתוחי מספריים</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונים מדעי</td><td>Cat# 72962</td><td></td></tr><tr><td>CA מספריים מיקרו דגם 1C300</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>Cat# 78180-1C3</td><td></td></tr><tr><td>קלי מלקחיים המוסטטיים (ישרים)</td> <td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>Cat# 72930</td><td></td></tr><tr><td>שמיכת מעיל מים + כרית חימום</td><td>Gaymar</td><td></td><td>T / Pump PN 11184-000 שמיכה-66N111CC</td></tr><tr><td>Repti-Therm מתחת למחמם מיכל</td><td>ZooMed</td><td></td><td>RH-4</td></tr><tr><td>טקסס אדום סולפוניל כלוריד</td><td>Invitrogen / בדיקות</td> <td>מולקולריותCat# T-353</td><td></td></tr><tr><td>סרום עכברוש אלבומין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>חתול# A-6272</td><td></td></tr><tr><td>אל-מים באיכות גבוהה DMF</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>חתול# 270547</td><td></td></tr><tr><td>סרט חיטוי קו סטראט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>חתול# 11-889-1</td><td></td></tr><tr><td>כלים תחתונים לכיסוי צלחת ווילקו (50 מ"מ/40 מ"מ כיסוי)</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>Cat# 70665-07</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות חדירות גלומרולרי של מקרומולקולות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ 2-פוטון בחולדות wistar מינכן

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

מחלות כליה הקשורות אובדן שתן של מולקולות חיוניות גדולות, כגון אלבומין, כבר מזמן חשבתי להיגרם על ידי שינויים בחדירות המחסום מורכבים מpodocytes, תאי אנדותל כלי דם, וקרום במרתף עובד בהרמוניה. נתונים מהמעבדה שלנו באמצעות מיקרוסקופ 2 הפוטונים intravital חשפו מחסום חדיר יותר גלומרולרי סינון (GFB) מאשר סברו עד כה בתנאים פיסיולוגיים, עם ליפה של אלבומין המסונן המתרחש בקבוצת משנה מוקדמת של תאים הנקרא תאי אבובית הפרוקסימלית (PTC) 1,2, 3. טכניקות קודמות שימש ללמוד סינון הכלייתי והקמה אופיינית למחסום הסינון המעורב micropuncture של לומן של המגזרים צינורי המוקדמים אלה עם דגימה של התוכן וניתוח 4 נוזל. מחקרים אלה קבעו ריכוז אלבומין בנוזל luminal להיות כמעט לא קיים; מקביל באופן הדוקלמה שבדרך כלל הוא זוהה בשתן. עם זאת, אפיון של הפולימרים dextran עם גדלים שהוגדרו על ידי טכניקה זו חשף אלה של גודל דומה לאלבומין בסרום היו רמות גבוהות יותר בלומן ושתן צינורי; מציע חדירות מוגברת 5. מסמך זה הוא תיאור מפורט של הטכניקה המשמשת כדי להמחיש באופן ישיר ולכמת חדירות אלבומין ניאון גלומרולרי in vivo. שיטה זו מאפשרת זיהוי של אלבומין מסונן על פני מחסום הסינון לתוך החלל של באומן (הקאמרית הראשוני של סינון שתן), וגם מאפשרת כימות של ספיגה חוזרת אלבומין על ידי צינוריות והדמיה של transcytosis 6 הבא אלבומין הפרוקסימלי. העדרו של ניאון אלבומין יחד מאוחרת מגזרים צינורי בדרך לשלפוחית ​​השתן מדגיש את היעילות של המסלול אחזור במגזרים אבובית הפרוקסימלי קודם לכן. יתר על כן, כאשר טכניקה זו יושמה כדי לקבוע חדירותשל dextrans בעל גודל דומה לערכי חדירות כמעט זהים אלבומין דווח 2. תצפיות אלו תומכות ישירות בצורך להרחיב את הפוקוס של מחלות כליות proteinuric רבות לשינויים שנכללו בטיוב תא אבובית הפרוקסימלי.

איור 3 מראה דוגמה של תמונה שנלקחה מglomerulus פני השטח של עכברוש Frömter Wistar מינכן ואת הצעדים שננקטו כדי לקבוע את החדירות של ניאון אלבומין. ערך GSC לאלבומין של 0.0111 נגזר לglomerulus נפילת אדם זה בטווח ראה בזן זה של חולדות מינכן Wistar כאשר במצב הפד 3. היציבות ראתה בתמונות אלה היא בשל תכנון וביצוע של הוראות המתוארות באיורים 1 ו -2 זהירים. כאמור, את המיקום של החתך בשימוש בexteriorizing הכליות הוא הצעד החשוב ביותר בהפקת יציבה ללא תמונ...

טכניקת ניצול הרזולוציה הגבוהה intavital מיקרוסקופיה 2 פוטונים ישירות לדמיין ולכמת סינון gloemrular במשטח glomeruli. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של מאפייני חדירות של מולקולות במצבים נורמלים ובחולים.

כימות חדירות גלומרולרי של מקרומולקולות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ 2-פוטון בחולדות Wistar מינכן

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין בהצלחה את יחידת הסינון של הנפרון ולכמת סינון של מקרומולקולות פלואורסצנטיות על פני מחסום הסינון לחלל השתן in vivo. זה מושג על ידי הכנת שלב המיקרוסקופ עבור החיה החיה. לאחר מכן, הכליה נחשפת והחולדה מונחת על הבמה.לאחר מכן מזוהים וממופים גלומרולים בודדים ומתקבלות תמונות תלת מימד ברקע. לבסוף, מוזרק אלבומין פלואורסצנטי. נפחים תלת מימדיים של גלומרולים בודדים נרכשים, והחדירות מכומתת.בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את מקדם הסינון של מקרומולקולות על פני הגלומרולים בכליה באמצעות מיקרוסקופ פוטונים תוך בקבוקוני. היתרון העיקרי של מיקרוסקופ שני פוטונים הוא בכך שהוא מאפשר כימות בו זמנית של סינון גלומרולרי וגם ספיגה חוזרת של צינוריות פרוקסימליות וטרנסציטוזיס בבעל החיים. יחד עם זאת, ההשלכות של הטכניקה חורגות ממכניסטיות לאבחון וטיפול כחשיבות של הבנת תפקיד הסינון הגלומרולרי והצינורי הפרוקסימלי.ספיגה חוזרת של אלבומין היא קריטית בקביעת מיקוד הטיפול. לאחר הרדמת החולדה, הכנס קו גישה ורידי דרך וריד הצוואר או הירך וגלח את הצד השמאלי ממש מתחת לכלוב הצלעות ממש מעל הירך השמאלית. זהו ניתוח שאינו הישרדותי.הנח את החולדה שטוחה על צדה הימני כך שהצד השמאלי המגולח פונה כלפי מעלה. ודא שהוא שטוח על הספסל כשהיציבה שלו מוארכת ולא כפופה עם כפות קדמיות נוגעות זו בזו וכפות אחוריות נוגעות זו בזו בעדינות רבה. משש כדי למשש את הכליה כדי לקבוע היכן היא שוכבת באופן טבעי בתוך הרטרופריטונאום, והשתמש בשארפי כדי לצייר קו ישר במקביל לגוף עם זוג מלקחיים לשיניים.הרם את העור והשתמש בזוג המוסטטים כדי לצבוט את העור לאורך הקו המצויר כדי לרסק את הרקמה ולמנוע דימום באמצעות מספריים כירורגיים. חותכים לאורך החתך. השתמש באותו הליך לחיתוך שכבת השריר החיצונית, שהיא דקה לפי הצורך.השתמש בהמוסטטים כדי למנוע דימום לחתך בשכבת השריר הפנימית, מה שיחשוף את הצפק. ממשש מחדש את הכליה כדי להעריך את הגודל. צבט קו חתך קטן יותר מהכליה כדי להבטיח שהחתך נמצא ממש מעל הכליה.עדיף להפוך את החתך הזה לקטן מדי ולהגדיל אותו במידת הצורך. אתר את הכליה והשתמש במלקחיים כדי לאחוז בשומן שמסביב הפועל לכיוון הקוטב התחתון של הכליה בצורה של יד על יד. לאחר שמגיעים לקוטב התחתון של הכליה, משוך בעדינות את הכליה דרך החתך תוך כדי לחיצה עדינה מאוד מתחת לכליה כדי להוציא אותה החוצה.אם החתך קטן מדי, מועכים את שכבת השריר וחותכים כדי להרחיב אותה. חזור על ההליך כדי להוציא את הכליה לאחר הוצאת כליית החולדה והנחת החולדה על במת המיקרוסקופ להדמיה. אם המיקרוסקופ שלך מצויד בבמה ממונעת המסוגלת לסמן מיקומים, באמצעות מוט פלואורסצאין דו-מעבר, מסנן דומין ומטרה בעלת עוצמה נמוכה, מצא ומרכז גלומרולים בודדים, שיופיעו כמבנים עגולים ריקים המוקפים בצינורות פרוקסימליים.בעל אוטופלואורסצנציה כתומה צהובה אינהרנטית מסמן כל מיקום, העבר את הצריח ליעד טבילה במים בעוצמה גבוהה יותר, וצלם מערכי נתונים תלת מימדיים של כל גלומרולי. לוודא שהלולאות הנימים וחלל באומן נראים בבירור. שימוש בפלטת צבעים פסאודו יעזור לדמיין את המבנים הללו.לאחר מכן, תוך התמקדות בכלי דם שטחי להחדיר לאט אלבומין פלואורסצנטי, ולוודא שניתן זמן לאפשר פיזור מערכתי למולקולות בעלות מקדם ציפוי גלומרולרי נמוך או GSC, חיוני למקסם את ערכי העוצמה בפלזמה, אך לא להגיע לרמות שירוויחו את גלאי הצילום במיקרוסקופ. זה מגביר את יכולת הזיהוי של מולקולות מסוננות לאחר המתנה של כ-10 דקות כדי לאפשר לכל שברי משקל מולקולרי קטנים פוטנציאליים להתנקות, רכוש נפחים תלת מימדיים במרווחים של מיקרון אחד שישמשו לחישוב אלבומין באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מטמורפוזית. טען את מערכי הנתונים התלת-ממדיים יחד עם תמונות הרקע עבור כל גלומרולי בנפח המכיל את האלבומין הפלואורסצנטי.אתר לולאה נימית שטחית עם מספיק מקום ריק בין השוליים המוגדרים שלה לקצה קפסולת באומן. באמצעי האחסון ברקע. אתר את אותו מישור מוקד, שאמור להכיל את כל הרמזים החזותיים של התמונה המכילה אלבומיןבחר אזור בתוך הלולאה הנימים המעניינת ושים לב לקריאת העוצמה הממוצעת. לאחר מכן, בחר אזור בתוך מרחב באומן ושים לב לקריאת העוצמה הממוצעת. אלה ישמשו כערכי רקע לכמות.בחר את האזור הדומה בתוך מרחב באומן באלבום המכיל תמונה. עשה זאת עבור לפחות שני אזורים אחרים כדי לקבל ערך עבור העוצמה הממוצעת בתוך המרחב של באומן. בחר את הלולאה הנימים עם עוצמת הפלזמה הבהירה ביותר וצייר סביבה אזור.לאחר מכן, באמצעות פונקציית הסף, הדגש את הערכים הבהירים בתוך הפלזמה המחזורית, הימנע מהפסים הכהים שמסתובבים בתאי הדם האדומים. שימו לב לערכי העוצמה הממוצעים של חלל הפלזמה שנבחר. חשוב לבחור באופן מועדף את האזורים הבהירים של הפלזמה מכיוון שגורמים בתוך הדם רק ישמשו לגרום להערכת חסר של רמות הקרינה בפלזמה.הזן את הערכים בגיליון אלקטרוני של Excel כדי לחשב את ה-GSC כאשר GSC שווה להפרש של שטח הקשת הגולמי. עוצמה פחות רקע עוצמת מרחב באומן חלקי ההבדל של עוצמת הלולאה הנימים הגולמית פחות עוצמת הלולאה הנימים של הרקע. ספיגת אלבומין פלואורסצנטי מסונן מתרחשת בעיקר בקטע המוקדם של צינורות פרוקסימליים.ה-S, לוח זה מציג חתך רוחב של גלומרולוס וקטע S אחד שנלקח מחולדת פרומפטר של מינכן וויסטאר, כ-20 דקות לאחר עירוי של בולוס RSA אדום טקססי. פתיחת החלל של באומן והקליטה הנלהבת של האלבום באדום מוצגת בקטע S one. פאנל זה מציג הקרנה תלת מימדית רדודה של 20 מיקרון של אותו מערך נתונים, ומוצג כאן הקרנה בהספק נמוך יותר שצולמה כ-60 דקות לאחר העירוי.תמונות אלו מדגימות כי מיקרוסקופיה תוך-חיונית יכולה לאפשר הדמיה של גורל החומר המוזרק לאחר סינון המאשר במידה מסוימת, מקדם הסינון שנצפה המוצג כאן הוא תמונות שצולמו מפני השטח גלומרולוס. פאנל זה הוא תמונת רקע ותמונה זו צולמה כ-12 דקות לאחר עירוי של אלבומין סרום עכברוש טקסס אדום. שני לוחות אלה מצוירים בצבע פסאודו.שלושה אזורי עניין קטנים שצוירו בחלל של באומן משמשים לחישוב העוצמה הממוצעת של אלבומין פלואורסצנטי שנע על פני מחסום הסינון. ערכי עוצמה ממוצעים עבור האזורים הבודדים דווחו באזור המודגש בתיבת הדו-שיח סטטיסטיקה של אזור ההצגה. ערך ה-GSC עבור אלבומין של 0.0111 הנגזר עבור גלומרולוס בודד זה נופל בסצנת הטווח בזן זה של חולדות כוכב מינכן כאשר הוא במצב מוזן.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ניתוח כמותי ואיכותי על מבני כליה אחרים כדי לענות על שאלות נוספות כגון הסחר הסופי של המקרומולקולה לאחר סינון לחלל השתן לאחר התפתחותה. טכניקה זו אפשרה לחוקרים בפיזיולוגיה של הכליות לחקור תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים דינמיים, לא רק פעם אחת אלא לאורך. עם הזמן, זה היה.

quantifying-glomerular-permeability-fluorescent-macromolecules-using

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מציג שאיפת נוזלים מגלומרולי עכבר באמצעות טכניקת מיקרו-ניקוב בתיווך שני פוטונים. הטכניקה מספקת גישה לגלומרולי של העכבר החי ובכך מסייעת לקבל תובנות על הפיזיולוגיה של הכליה.

שאיפת נוזל מגלומרולי עכבר: שיטה לשאיפת נוזל גלומרולרי מעכבר באמצעות מיקרופונקטורה בתיווך שני פוטונים

מדידה של קצב סינון גלומרולרי (GFR) היא תקן הזהב להערכת תפקוד כליות. כאן אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה המאפשרת קביעת GFR בעכברים מודעים באמצעות זריקה אחת בולוס, קביעת isothiocyanate ההעמסה (FITC)-אינולין בפלזמה וחישוב GFR ידי מודל דעיכה מעריכית שני שלבים.

שיטת תפוקה גבוהה למדידה של קצב סינון הגלומרולרי בעכברים בהכרה

הכנת ריאות perfused הדם המבודדת עושה את זה אפשרי לדמיין רשתות microvessel על פני הריאות. כאן אנו מתארים גישה לכמת חדירות של microvessels אחת ריאות מבודדות באמצעות דימות פלואורסצנטי זמן אמת.

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

הגששים במטרה לייצג כלי חדשני עבור ניתוח המנגנונים המולקולריים, כגון חלבון ביטוי בסוגים שונים של המחלה (למשל, דלקת, זיהום, ו- tumorigenesis). במחקר זה, אנו מתארים הערכה כמותית טומוגרפי תלת מימדי של הסתננות מקרופאג מעיים במודל מאתר של קוליטיס באמצעות טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות F4/80-ספציפיות.

בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה זיהוי, כימות הקשורות מקרופאג דלקת מעיים מאתר

כאן נציג של assay חדירות כלי דם במוח העכבר באמצעות הזרקה בקרום הבטן של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף הרלוונטיים מודלים חייתיים של תפקוד לקוי של מחסום הדם - מוח. חמי-המוח משמש עבור הערכת חדירות באופן כמותי, והשני עבור מעקב חזותי/immunostaining. התהליך לוקח ב' 5-6-10 עכברים.

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר של מחלת glomerular. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular

אנו מציגים את השימוש פוטון 2 מיקרוסקופ כדי למקם את micropipette במרחב השתן של באומן בעכברים, שילוב טכניקות היסוד 2 של פיזיולוגיה של הכליה. השימוש מיקרוסקופ פוטון 2 גוברת על מגבלות קריטי של מיקרוסקופ רגיל ללימודי micropuncture פיזיולוגיה של הכליה.

Micropuncture של השטח של באומן בעכברים בהנחייתם של מיקרוסקופיית פוטון 2

כאן נתאר פרוטוקול כדי למדוד את קצב הסינון glomerular (GFR), בהכרה, לנוע בחופשיות עכברים באמצעות צג GFR דרך העור.

Transdermal מדידה של קצב הסינון Glomerular בעכברים

בעכברים המשתמשים במעקב. רגיש ולא רדיואקטיבי שיטה זו מאפשרת ניתוחי שתן חוזרים ונשנים עם כמויות שתן קטנות.

מדידה רגישה מאוד של חדירות הפקאוליות בעכברים עם פלואורואסעין איזוטיקריאט-פוליסוכרוז 70

כאן אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופיה של 2 פוטונים בחולדות Wistar Fromter במינכן עם גלומרולי פני השטח כדי לכמת את ההשפעות של חסימת שופכה ממושכת על הדינמיקה והתפקוד של גלומרולרי.

שימוש במיקרוסקופיה של 2-פוטונים כדי לכמת את ההשפעות של חסימת שופכה חד-צדדית כרונית על תהליכים גלומרולריים

מחקר זה מציג מערך קל לשימוש, שלם ופשוט של שיטות לתייג ולנתח גלומרולי מכליות עכבר שעברו ניקוי מעוקב. נתונים כגון מספר גלומרולוס ונפח ניתן להשיג בקלות ובאמינות באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור (LSFM), או מיקרוסקופ קונפוקלי נפוץ ותוכנה כגון Imaris.

שיטה יעילה ומהירה לתיוג וניתוח גלומרולי עכבר

למד כיצד לכמת חדירות גלומרולרית של מקרומולקולות פלורסנט בחולדות Wistar מינכן באמצעות מיקרוסקופ 2-פוטון. שיטה זו מאפשרת מחקר ישיר של תפקוד הכליה בזמן אמת.

כימות חדירות גלומרולרי של מקרומולקולות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ 2-פוטון בחולדות Wistar מינכן

גלה סרטונים נוספים