ניתוח אוכלוסיית תאים בעור Carcinogenesis
21 באוגוסט 2013
הסרטן הוא תהליך כרוך אינטראקציות בין תאים סרטניים וmicroenvironment הסרטן. כדי לנתח את האירועים המולקולריים, צריך לבודד את אוכלוסיות תאים שונות בשלבים שונים במהלך התפתחות הסרטן. שימוש במודל עכבר לקרצינומה של תאי בסיס, אנו מתארים פרוטוקול עבור ניתוחי תא במהלך היווצרות הסרטן.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע ניתוחי אוכלוסיית תאים במודל העכבר של סרטן העור קרצינומות תאי בסיס. זה מושג על ידי השראת ביטוי גן מטרה בעכברים. בשלב השני, האפידרמיס מבודד מעור העכבר.
לאחר יצירת תרחיף תא בודד, תאי האפידרמיס מסומנים בסמני שירות תאים ספציפיים. בסופו של דבר, ניתן לנטר שינויים באוכלוסיית התאים במהלך התפתחות הגידול בעור על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי. התפתחות סרטן היא תהליך שמעורבים בו סוגי תאים רבים.
מטרת הליך זה היא לסייע לחוקרים לחקור כיצד תאים שונים תורמים להתפתחות סרטן העור. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות תאיות במהלך התפתחות סרטן העור, אך ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות כגון סרטן הלבלב. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לקבוע מתי יש לסיים את הניסוי ללא הערכה חזותית.
כדי להתחיל, עכברי ma keratin 14 Cree ER המכונים עכברי K 14 עם עכברי רוזה 26 המכילים את הגן המוחלק המוטנטי המתויג YFP SMU M שניים המכונה SMU. עכברים. לאחר מכן, טבלו דגימות זנב באורך 0.5 ס"מ שנקטפו מעכברים חיוביים כפולים בני שלושה עד שישה שבועות בתמיסת ליזיס זנב PCR ישירה עם מיליגרם אחד למיליליטר של פרוטאינאז K. לאחר מכן דגרו את הדגימות למשך הלילה ב-55 מעלות צלזיוס עם טלטול. למחרת, סובב את הרקמה במהירות שיא במיקרו צנטריפוגה כדי להסיר פסולת.
לאחר מכן כדי לגנוטיפ כל חיה, השתמש במיקרוליטר אחד של ה-SNAT מכל דגימה בתגובות PCR בודדות עם הפריימרים והתנאים כפי שהומלץ על ידי הספק. השתמש במחט האכלה מעוקלת בקוטר 20 כדי לתת טמוקסיפן לבעלי חיים. חיובי כפול ל-K 14 C er, ו-ROSA 26 על ידי גבאז' דרך הפה במשך חמישה ימים רצופים כדי לגרום לביטוי OO M שני בקרטינוציטים.
באופן כללי, הפנוטיפים חמורים יותר על האוזן והזנב של עכברי GFP מתויגים K 14 OO כדי לקצור את העור לניתוח תאים. ראשית, השתמש ברעד כדי להסיר את הפרווה מהחיה שהורדמה. לאחר מכן הסר את עור העכבר וטבל את הרקמה בתמיסת דיסב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים.
לאחר הטיפול בדיספא, השתמש בזוג מלקחיים כדי להפריד את האפידרמיס מהדרמיס. כעת השתמש במספריים כדי לטחון את האפידרמיס. לאחר מכן טבלו את הרקמה בתמיסת קולגנאז ארבע למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בשפופרת של 50 מיליליטר.
סובב בעדינות את הצינור כל 20 דקות כדי לנתק את התאים. השתמש במיקרוסקופ כדי לאשר דיסוציאציה של תאים כאשר ניתן לזהות תאים בודדים במדיום הקולגנאז. דגרו את הדגימה למשך 30 דקות נוספות כדי להגדיל את תפוקת התאים.
לאחר מכן מסננים את תערובת הרקמות דרך מסננת תאים של 70 מיקרון ושוטפים את התאים במשך 10 דקות ב-500 פעמים G וטמפרטורת החדר כדי לסמן את התאים מתחילים בהחייאה, משהים את הגלולה שזה עתה נשטפה ב-PBS בתוספת 10% FBS ב-2.5 כפול 10 מתוך ששת התאים למיליליטר. לאחר מכן הניחו את תמיסת התא על קרח למשך 30 דקות כדי לחסום כל קשירה לא ספציפית. לאחר מכן, העבירו את כמות התאים לצינורות מיקרו של 1.5 מיליליטר לסימון נוגדנים ספציפיים.
הוספת הנוגדנים לכל שפופרת בריכוז סופי של שני מיקרוגרם למיליליטר. מערבל בעדינות את הצינורות למשך מספר שניות כדי לערבב את הנוגדנים עם התאים ולאחר מכן הנח את הצינורות בחזרה על הקרח למשך 30 דקות נוספות. לאחר שטיפת הצינורות במיליליטר אחד של PBS, השעו מחדש את הכדורים ב-PBS ולאחר מכן הוסיפו DPI בריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר.
בעת ניתוח הנתונים, בחר תחילה תאים בודדים על סמך תרשים הפיזור קדימה לעומת פיזור הצד, למעט התאים המתים החיוביים של DABI. עכברים אינם מפתחים קרצינומה של תאי בסיס אלא כאשר איתות קיפוד מופעל כפי שניתן לראות בתמונות אלה. הביטוי המושרה על ידי טמוקסיפן של החלק המוחלק האונקוגני M שני YFP מביא לפנוטיפ עור הנראה אפילו ברמה האנטומית של הגידול בדגימות מוכתמות בעור h ו-e מבעלי חיים אלה.
ניתן להבחין בגידולי עור בעכברי K 14 SMU. ללא אינדוקציה של SMU M שני YFP, עור החיה לא הראה מורפולוגיה חריגה ב-h ו-e. צביעת עלילות הנקודות הללו מציגה ניתוח מייצג של תאים מיאלואידים בעכברים רגילים ונושאי גידול.
תאי ה-GR החיוביים ל-CD 11 B נגזרים מתאים מיאלואידים, שחלקם הם תאים מדכאים שמקורם במיאלואיד בעכברים רגילים ולא SMU M שני YFP. אוכלוסיית התאים החיוביים ל-CD 11 B בקושי ניתנת לזיהוי, אך עולה בתגובה לדלקת או להתפתחות גידול. בעכברי K 14 SMU.
הביטוי המושרה של smu M, שני YFP וקרטינוציטים בעור מביא לעלייה באוכלוסיית התאים החיוביים ל-CD 11 B, GR חיובי אחד. טכניקה זו תאפשר לחוקרים בתחום הביולוגיה של העור לבצע ניתוח מולקולרי של קרצינומה של תאי B בעכברים.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לניתוח אוכלוסיות תאים במהלך התפתחות של קרצינומה של תאי הבסיס באמצעות מודל עכברים. השיטה מאפשרת לחוקרים לבחון את האינטראקציות בין תאי הסרטן לבין הסביבה המיקרוסקופית שלהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- חקר הסרטן
רקע
- תהליך הקרצינוגנזה כולל אינטראקציות מורכבות בין תאי סרטן לבין המיקרו-סביבה שלהם.
- הבנת אינטראקציות אלו מחייבת בידוד של אוכלוסיות תאים שונות בשלבים השונים של התפתחות הסרטן.
- מחקר זה מתמקד בקרצינומה של תאי הבסיס במודל עכברים.
- ניתוח אוכלוסיות תאים יכול לספק תובנות לגבי התפתחות גידולים ואינטראקציות תאיות.
מטרת המחקר
- לביצוע אנליזות של אוכלוסיות תאים במודל עכבר של סרטן העור.
- לבדיקת האופן שבו סוגי תאים שונים תורמים להתפתחות סרטן העור.
- לספק שיטה שניתן להחיל על סוגי סרטן אחרים, כגון סרטן הלבלב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השראה של ביטוי גן מטרה בעכברים.
- בידוד של האפידרמיס מעור עכבר.
- הפקת תרחיפי תאים בודדים וסימון באמצעות סממנים ספציפיים.
- ניתוח באמצעות ציטומטריה זרימה למעקב אחר שינויים באוכלוסיות התאים.
תוצאות עיקריות
- ניתן לנטר ביעילות שינויים באוכלוסיות התאים במהלך התפתחות הגומלה.
- ביטוי מושרה של smoothened אונקוגני מוביל לפנוטיפים ניראים של העור.
- עלייה באוכלוסיות של תאי מדכא מערכת חיסון ממקור מיאלואי (myeloid-derived suppressor cells) בעכברים עם גידולים.
- הערכה חזותית היא קריטית לקביעת מועד סיום הניסוי.
מסקנות
- טכניקה זו מסייעת בניתוח מולקולרי של קרצינומה של תאי הבסיס.
- היא משפרת את ההבנה של אינטראקציות תאיות בסרטן העור.
- ניתן להתאים את השיטה ליישומים אחרים במחקר סרטן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ניתוח שיטתי של התרומות התאיות להתפתחות גידולים in vivo, ובכך נותן מענה לאתגר מרכזי בתיקוף מטרות אונקולוגיות. באמצעות בידוד של אוכלוסיות תאים מוגדרות ממודל גנטי להנדסה של קרצינוגנזה של העור, הפרוטוקול תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים של היפותזות טיפוליות. גישה זו מספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור על דינמיקה של תאי סטרומה ותאי מערכת החיסון, ובכך מגבירה את הביטחון החזוי בהחלטות שלבים מוקדמים של גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות שינויים באוכלוסיות תאים ספציפיות במהלך התקדמות הגומלורית.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה סטנדרטית לבידוד האפידרמיס ויצירת תרחיפי תאים בודדים מעור עכברים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגית באמצעות ניטור פלוו-ציטומטרי של התרחבות תאי מדכאי מוצא מיאלואידי (MDSCs) בתגובה לאיתותי אונקוגנים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר תרחיפי תאים בודדים שעברו תיקוף ומתאימים לפאנלים של אימונופנוטיפינג (immunophenotyping) במסכי אימונו-אונקולוגיה.
- שחזור: כולל שלבי דיסוציאציה אנזימטית וסינון מוגדרים כדי להבטיח תפוקת תאים וחיוניות עקביים.
- יכולת הרחבה: תוכנן לעיבוד של מספר ביופסיות עור כדי לאפשר ניתוח מבוסס קוהורט במחקרים פרה-קליניים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה קרצינומה של תאי הבסיס המונעת על ידי הפעלת מסלול ה-hedgehog, מערכת רלוונטית מבחינה מכניסטית לתיקוף מטרות.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין שינויים בפנוטיפ התאי לבין התפתחות הגומור, ובכך תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון.
- הלימה לבייומארקרים: מאפשר מעקב אחר אוכלוסיות CD11b+GR1+ כבייומארקרים תרגומיים פוטנציאליים של פעילות תאי מדכאי חיסון ממקור מילואי (myeloid-derived suppressor cell).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, ובכך היא מאפשרת הערכה איטרטיבית של מנגנונים תאיים בתהליכי קרצינוגנזה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי בידוד המדורים האפידרמליים והסטרומליים כדי להבהיר תגובות תאיות ספציפיות למסלול.
- סריקה: מספק פלטיים כמותיים ומולטי-פרמטריים של ציטומטריית זרימה להשוואת הרכב תאי בין תנאי ניסוי שונים.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של תדרי אוכלוסיות תאים, ובכך מקל על תעדוף מטרות מבוסס נתונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מודלים של קרצינוגנזה בעור של עכברים לבין ביולוגיה של סרטן בבני אדם באמצעות דפוסי אינטראקציה תאיים שמורים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לניתוח דינמיקה של אוכלוסיות תאים במגוון מודלים של עכברים מהונדסים גנטית לסרטן.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באינטראקציות בין הגידול לסטרומה באמצעות בידוד תאי ואפיון פנוטיפי מוגדרים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של שלבי עיבוד הרקמה לשיפור השחזוריות בין מעבדות ובסדרות ניסוייות שונות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי אספקת ראיות מוקדמות להשפעות ביולוגיות על המטרה בתוך רקמות מורכבות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות בהתאם לסיכון, בהתבסס על השפעתן על אוכלוסיות של תאים מדכאי חיסון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של עכברים, השראה באמצעות tamoxifen ודיסוציאציה אנזימטית של רקמות.
- תלוי בגישה לציוד ציטומטריה זרימתית (flow cytometry) ובפאנלים מאושרים של נוגדנים לסממני שטח תא.
- מחייב סטנדרטיזציה של איסוף הביופסיה וזמני העיבוד כדי לצמצם שונות בתשואת התאים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום טכניקת בידוד האפידרמיס לסוגי רקמות אחרים או למודלים של מחלות.
- מוגבל על ידי הזמן הנדרש ליצירת מספר מספיק של עכברים תקינים גנטית, דבר העשוי להאריך את לוחות הזמנים של הניסוי.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Generating K14-creER+ R26-SmoM2YFP+ Mice and Inducing SmoM2 Expression in Skin Keratinocytes
2:35
Skin Specimen Preparation and Epidermis Isolation
3:11
Single Cell Generation
3:54
Cell Labeling and Flow Cytometric Analysis
5:08
Results: Induction of SmoM2 Expression and Skin Keratinocytes
6:31
Conclusion
![מודל מסרטן העור המושרה כימי באמצעות דימתילבנץ [a] פחם ו-12-O-טטרדאנואיל פורבול-13-אצטט (DMBA-הסברתי)](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F60445.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A21.159Z&w=384&q=75)
