ניתוח אוכלוסיית תאים בעור Carcinogenesis

הסרטן הוא תהליך כרוך אינטראקציות בין תאים סרטניים וmicroenvironment הסרטן. כדי לנתח את האירועים המולקולריים, צריך לבודד את אוכלוסיות תאים שונות בשלבים שונים במהלך התפתחות הסרטן. שימוש במודל עכבר לקרצינומה של תאי בסיס, אנו מתארים פרוטוקול עבור ניתוחי תא במהלך היווצרות הסרטן.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע ניתוחי אוכלוסיית תאים במודל העכבר של סרטן העור קרצינומות תאי בסיס. זה מושג על ידי השראת ביטוי גן מטרה בעכברים. בשלב השני, האפידרמיס מבודד מעור העכבר.

לאחר יצירת תרחיף תא בודד, תאי האפידרמיס מסומנים בסמני שירות תאים ספציפיים. בסופו של דבר, ניתן לנטר שינויים באוכלוסיית התאים במהלך התפתחות הגידול בעור על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי. התפתחות סרטן היא תהליך שמעורבים בו סוגי תאים רבים.

מטרת הליך זה היא לסייע לחוקרים לחקור כיצד תאים שונים תורמים להתפתחות סרטן העור. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות תאיות במהלך התפתחות סרטן העור, אך ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות כגון סרטן הלבלב. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לקבוע מתי יש לסיים את הניסוי ללא הערכה חזותית.

כדי להתחיל, עכברי ma keratin 14 Cree ER המכונים עכברי K 14 עם עכברי רוזה 26 המכילים את הגן המוחלק המוטנטי המתויג YFP SMU M שניים המכונה SMU. עכברים. לאחר מכן, טבלו דגימות זנב באורך 0.5 ס"מ שנקטפו מעכברים חיוביים כפולים בני שלושה עד שישה שבועות בתמיסת ליזיס זנב PCR ישירה עם מיליגרם אחד למיליליטר של פרוטאינאז K. לאחר מכן דגרו את הדגימות למשך הלילה ב-55 מעלות צלזיוס עם טלטול. למחרת, סובב את הרקמה במהירות שיא במיקרו צנטריפוגה כדי להסיר פסולת.

לאחר מכן כדי לגנוטיפ כל חיה, השתמש במיקרוליטר אחד של ה-SNAT מכל דגימה בתגובות PCR בודדות עם הפריימרים והתנאים כפי שהומלץ על ידי הספק. השתמש במחט האכלה מעוקלת בקוטר 20 כדי לתת טמוקסיפן לבעלי חיים. חיובי כפול ל-K 14 C er, ו-ROSA 26 על ידי גבאז' דרך הפה במשך חמישה ימים רצופים כדי לגרום לביטוי OO M שני בקרטינוציטים.

באופן כללי, הפנוטיפים חמורים יותר על האוזן והזנב של עכברי GFP מתויגים K 14 OO כדי לקצור את העור לניתוח תאים. ראשית, השתמש ברעד כדי להסיר את הפרווה מהחיה שהורדמה. לאחר מכן הסר את עור העכבר וטבל את הרקמה בתמיסת דיסב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים.

לאחר הטיפול בדיספא, השתמש בזוג מלקחיים כדי להפריד את האפידרמיס מהדרמיס. כעת השתמש במספריים כדי לטחון את האפידרמיס. לאחר מכן טבלו את הרקמה בתמיסת קולגנאז ארבע למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בשפופרת של 50 מיליליטר.

סובב בעדינות את הצינור כל 20 דקות כדי לנתק את התאים. השתמש במיקרוסקופ כדי לאשר דיסוציאציה של תאים כאשר ניתן לזהות תאים בודדים במדיום הקולגנאז. דגרו את הדגימה למשך 30 דקות נוספות כדי להגדיל את תפוקת התאים.

לאחר מכן מסננים את תערובת הרקמות דרך מסננת תאים של 70 מיקרון ושוטפים את התאים במשך 10 דקות ב-500 פעמים G וטמפרטורת החדר כדי לסמן את התאים מתחילים בהחייאה, משהים את הגלולה שזה עתה נשטפה ב-PBS בתוספת 10% FBS ב-2.5 כפול 10 מתוך ששת התאים למיליליטר. לאחר מכן הניחו את תמיסת התא על קרח למשך 30 דקות כדי לחסום כל קשירה לא ספציפית. לאחר מכן, העבירו את כמות התאים לצינורות מיקרו של 1.5 מיליליטר לסימון נוגדנים ספציפיים.

הוספת הנוגדנים לכל שפופרת בריכוז סופי של שני מיקרוגרם למיליליטר. מערבל בעדינות את הצינורות למשך מספר שניות כדי לערבב את הנוגדנים עם התאים ולאחר מכן הנח את הצינורות בחזרה על הקרח למשך 30 דקות נוספות. לאחר שטיפת הצינורות במיליליטר אחד של PBS, השעו מחדש את הכדורים ב-PBS ולאחר מכן הוסיפו DPI בריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר.

בעת ניתוח הנתונים, בחר תחילה תאים בודדים על סמך תרשים הפיזור קדימה לעומת פיזור הצד, למעט התאים המתים החיוביים של DABI. עכברים אינם מפתחים קרצינומה של תאי בסיס אלא כאשר איתות קיפוד מופעל כפי שניתן לראות בתמונות אלה. הביטוי המושרה על ידי טמוקסיפן של החלק המוחלק האונקוגני M שני YFP מביא לפנוטיפ עור הנראה אפילו ברמה האנטומית של הגידול בדגימות מוכתמות בעור h ו-e מבעלי חיים אלה.

ניתן להבחין בגידולי עור בעכברי K 14 SMU. ללא אינדוקציה של SMU M שני YFP, עור החיה לא הראה מורפולוגיה חריגה ב-h ו-e. צביעת עלילות הנקודות הללו מציגה ניתוח מייצג של תאים מיאלואידים בעכברים רגילים ונושאי גידול.

תאי ה-GR החיוביים ל-CD 11 B נגזרים מתאים מיאלואידים, שחלקם הם תאים מדכאים שמקורם במיאלואיד בעכברים רגילים ולא SMU M שני YFP. אוכלוסיית התאים החיוביים ל-CD 11 B בקושי ניתנת לזיהוי, אך עולה בתגובה לדלקת או להתפתחות גידול. בעכברי K 14 SMU.

הביטוי המושרה של smu M, שני YFP וקרטינוציטים בעור מביא לעלייה באוכלוסיית התאים החיוביים ל-CD 11 B, GR חיובי אחד. טכניקה זו תאפשר לחוקרים בתחום הביולוגיה של העור לבצע ניתוח מולקולרי של קרצינומה של תאי B בעכברים.