זרימת עבודה של הדמיה וניתוח בתפוקה גבוהה להערכת פנוטיפים של תאי עור ומצבי התפשטות בדגימות רקמה

פרוטוקול זה משלב את שיטת ההדמיה האופטית המולטיפלקס, תיוג IBEX ו-Click-iT EDU כדי לזהות ולסווג סוגי תאים מתחלקים בתהליכים דינמיים ביותר, כגון תיקון עור. יתר על כן, אנו מספקים צינור עיבוד הדמיה חדשני בקוד פתוח לרכישת וניתוח תמונות בתפוקה גבוהה. מצפים את צלחת 24 הבארות ב -200 מיקרוליטר ג'לטין אלומיניום כרום ומדגרים את הצלחת למשך 15 דקות על שייקר נדנדה.

לאחר מכן הסר לחלוטין את הג'לטין וייבש את הבארות המצופות למשך 60 דקות בתנור של 40 מעלות. חותכים את הרקמה המוטבעת ב-OCT בעובי של 15 עד 30 מיקרומטר בקריוסטט ומעבירים אותה במהירות לבאר מצופה המכילה שני מיליליטר PBS. הסר בזהירות את ה-PBS באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד במטרה לשמור על קטע הרקמה במרכז הבאר.

כדי לעשות זאת ביעילות, שאפו לאט את ה-PBS משולי הבאר, והתאימו את מיקום הפיפטה לפי הצורך כדי למנוע את תזוזה של הרקמה. יבש את חלקי הטישו במשך שעה בתנור 37 מעלות צלזיוס. החזר לחות עם מיליליטר PBS אחד למשך חמש דקות.

חדירה לרקמה עם 500 מיקרוליטר של 0.5% טריטון למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את הטישו לזמן קצר פעמיים עם PBS ובצעו את תגובת Click-iT למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שמור על הדגימות מוגנות מפני אור.

שטפו את הטישו לזמן קצר פעמיים עם PBS. יש לחסום למשך שעה עם מאגר חוסם בטמפרטורת החדר. הוסף את הנוגדנים העיקריים למחזור הראשון.

ודגרו את הצלחת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. שטפו עם PBS שלוש פעמים. בצע את צביעת הנוגדנים המשנית.

עבור המחזור הראשון, יש למרוח את הנוגדנים המשניים עבור הנוגדנים הראשוניים הלא מצומדים יחד עם כתם נגד גרעיני. דגרו את הדגימות המוגנות מאור למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את הטישו שלוש פעמים עם PBS מיליליטר אחד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

השאירו כ -500 מיקרוליטר PBS בכל באר והביאו את הצלחת למיקרוסקופ. בתוכנת Meta Express, לחצו על סינון ולאחר מכן על הגדרת רכישה. לחץ על כפתור הוצא.

נקו את החלק התחתון של הצלחת עם 70% אתנול והכנסו את הצלחת למיקרוסקופ. לחץ על הלחצן Load Plate. בכרטיסייה מטרה ומצלמה, בחר את ההגדלה הרצויה.

כמצב רכישה, בחר במצב חריץ קונפוקלי של 51 מיקרומטר. בכרטיסייה לוחית, בחר את דגם הלוחית. עבור לכרטיסייה ביקור באתרי צלחות.

תחת אפשרויות אתר, לחץ על מספר קבוע של אתרים. הגדר את מספר העמודות והשורות כך שבערך כל הבאר מכוסה. לחץ על אתרי החפיפה 10%בחר רק את הבאר הראשונה לרכישה על ידי לחיצה ימנית על הבאר המתאימה במפת הצלחת.

עבור אל הכרטיסייה פוקוס אוטומטי של רכישה. למיקוד אוטומטי מבאר לבאר, בחר באפשרות הצלחת והתחתון היטב. עבור מיקוד אוטומטי של אתר, בחר באפשרות All Sites.

עבור אל אורכי גל הכרטיסייה ובחר את מספר הצבעים שיש לצלם במחזור הנוכחי. עבור לכרטיסיית אורך הגל הראשונה. בחר לייזר עם היסט Z עבור מיקום Z, ולחץ על הלחצן חשב היסט כדי להגדיר את גובה ההדמיה הנכון.

בחרו בתמונה שבה הדגימה נמצאת במיקוד הטוב ביותר. לחץ על כפתור המיקוד. מוצגת תמונה ממוקדת של הרקמה.

הגדר את עוצמת התאורה ל-50%הגדר את עוצמת היעד המקסימלית ל-2000 ולחץ על חשיפה אוטומטית. לסדרה Z, בחרו תמונת הקרנה מסדרה Z ותמונת הקרנה דו-ממדית, ולתיקון הצללה, בחרו הצללת FL בלבד. חזור על השלבים עבור אורכי גל אחרים, אך במקום לייזר עם קיזוז Z, בחר Z-offset מ-W1 ובחר אפס.

עבור לשלב סדרת Z והזן את גודל הצעד הרצוי. לחץ על לחצן ריכוז. גרור את חץ המיקום הנוכחי עד שמגיעים לתחתית הטישו ולחץ על כפתור הגדר B.

גרור את חץ המיקום לחלק העליון של הממחטה ולחץ על לחצן הגדר T. לחץ על F2, עצור, לחץ שוב על התחל בשידור חי. ודא שהשלב נמצא בבאר הראשונה על ידי לחיצה ימנית עליו.

מצא את גבול הרקמה וסמן את כל האתרים המכילים רקמה לרכישה על ידי לחיצה ימנית. עבור אל הכרטיסיה הפעלה והקלד את שם הלוחית. לחצו על Save Protocol.

הגדר את אזור הרכישה עבור כל הבארות האחרות. הפעל שליטה, יומן, התחל להקליט ואז מיד בקרה, יומן, הפסק הקלטה. שמור את היומן שנוצר ופתח אותו שוב באמצעות בקרה, יומן, ערוך יומן.

בחלונית השמאלית, עבור אל רכישת לוחית, טען פרוטוקול מקובץ ולחץ על רכישת לוחית כדי להוסיף את השלבים הללו ליומן. לחץ פעמיים על עריכת רכישת לוחית, טען פרוטוקול מקובץ ובחר את הפרוטוקול שנשמר עבור הבאר הראשונה. חזור על השלבים עבור כל באר שיש לרכוש, והקפד תמיד לטעון את הפרוטוקול המתאים.

לחץ על הפעל יומן כדי להתחיל את הרכישה. 30 דקות לפני סוף היומן, התחל להכין את מגיב ההלבנה. ממיסים 10 מיליגרם ליתיום בורוהידריד ב-10 מיליליטר של H2O מזוקק כפול ומעבירים דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר.

השאירו למשך 10 דקות. הפתרון אמור להתחיל ליצור בועות. כדי להבטיח הלבנה יעילה, השתמש במגיב ההלבנה תוך ארבע שעות לאחר ההכנה.

הוסף את תמיסת ההלבנה לדגימות ודגר למשך 15 דקות תוך שמירה על הדגימות חשופות לתאורת הסביבה. בועות קטנות צריכות להופיע על הרקמה. שטפו את הדגימות המולבנות שלוש פעמים עם PBS מיליליטר אחד למשך חמש דקות, כל אחת בטמפרטורת החדר.

הוסיפו את הנוגדנים העיקריים למחזור הבא ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. הדמיית IBEX מרובה בשילוב עם תיוג Click-iT EDU חושפת מבנים שונים וסוגי תאים מתרבים בעור הפצוע. תיוג EDU על דגימות שמורות בהקפאה נראה דומה בעת ביצוע תיוג אימונופלואורסצנטי נוגדנים עבור KI-67 על קטעי רקמה משובצים בפרפין, כמו גם תיוג תאים עם KI 67 באמצעות ציטומטריית זרימה.

שימוש בפרוטוקול זה מאפשר זיהוי מדויק של התפשטות תאים בתהליכים ביולוגיים מורכבים. יתרה מכך, צינור עיבוד ההדמיה בקוד פתוח אינו דורש ניסיון בתכנות ומייצר קבצים שניתן לעבד עם תוכנות לא מסחריות, כגון פיג'י ו-quPath. יתר על כן, פרוטוקול זה אינו דורש ציוד יקר ולכן ניתן לבצע אותו ברוב מסגרות המחקר.