Name: GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: למד טיהור חלבונים בשני שלבי זיקה באמצעות תגי GST ו-His בתאי SF9. שיטה זו מייצרת חלבונים מטוהרים באורך מלא לחקר פונקציות ביוכימיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אן מארי דיון-Cote לדיונים שהובילו לפיתוחה של השיטה. JK וRB הם חוקרים דוקטורט FQNRT, מ-MG הוא חוקר Vanier CIHR, וג&#39;-YM הוא חוקר בכיר FRSQ. עבודה זו נתמכה על ידי כספים ממדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר לJY. מ &#39;

1. ייצור רקומביננטי baculovirus Baculoviruses מופקים באמצעות מערכת ביטוי baculovirus Bac-to-Bac של Invitrogen בעיקר על פי הפרוטוקול של היצרן עם שינויים קלים בלבד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וקטור pFastBac1 שונה (Gibco, חיים) נוצר המכיל GST ו תגים (איור 2). אתר MultiCloning (MCS) של וקטור PET-52b (+) (Novagen), המכיל 10xHis תג, היה מוכנס לתוך MCS של וקטור pFastBac1 ליצור pFastBac1 סטרפטוקוקוס-10xHis. רצף MCS PET-52b (+) היה PCR המוגבר בין אתרי הגבלת XbaI וBlpI, הוספת אתר BglII הגבלה ב5 &#39;בגפיים ובאתר הגבלת HindIII ב3&#39; בגפיים. מוצר ה-PCR שוכפל לאחר מכן בין BamHI ואתר הגבלת HindIII של pFastBac1, באמצעות ההתאמה של רצפי הגבלת BamHI וBglII. מאחר שהמטרה הייתה ליצור pFastBac1 המאפשר הביטוי שלחלבון רקומביננטי עם streptavidin ו10xHis תגים, אתר הגבלת BamHI של PET-52b (+) רצף MCS לא היה בשימוש. כמו כן, אתר הגבלת XbaI לא היה בשימוש, כדי למנוע את היתירות של אתרי הגבלה המתרחשים בין האתרים שכבר בMCS של pFastBac1 ואלה הוכנסו עם MCS של PET-52b (+). רצף קידוד GST עם אתר PreScission פרוטאז ההכרה (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) היה אז מוכנס לתוך pFastBac1 סטרפטוקוקוס-10xHis. רצף GST cDNA מpGEX-6P-2 (GE Healthcare) היה מוגבר PCR עם פריימרים המכילים אתרי הגבלת NcoI וKpnI ב5 &#39;ו 3&#39; גפיים, בהתאמה. אתר NcoI מאפשר תוספת של קודון התחלה אלא גם אלאנין לGST. מוצר ה-PCR היה אז משובט לתוך pFastBac1 סטרפטוקוקוס-10xHis בין אתרי הגבלת NcoI וKpnI, וכתוצאה מהמחיקה של Streptavidin התג. וקטור ההיתוך החדש ובכך הושג נקרא pFastBac1-GST-10xHis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Clone קידוד cDNA ליחסי הציבורotein עניין לתוך וקטור pFastBac-GST-10xHis בין GST (N-מסוף) והתג שלו (בטרמינל C-). להיות זהיר כדי להסיר את קודון עצירת cDNA כדי לאפשר האיחוי עם התג שלו בטרמינל C-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את ה coli DH10Bac עם pFastBac רקומביננטי (המתקבל בשלב 1.2) על מנת ליצור את bacmid. לאפשר מושבות לגדול בין לילה על 37 מעלות צלזיוס וכמה שעות ב30 ° C על צלחות סלקציה המכילות Bluo-gal וIPTG (10 מיקרוגרם / מיליליטר tetracyclin, 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, 7 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, 100 מיקרוגרם / מיליליטר Bluo- גל, 40 מיקרוגרם / מיליליטר IPTG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק וrestreak 2 מושבות הלבנות (משלב 1.3) על צלחות בחירה כדי לאשר את הפנוטיפ הלבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 2 מיליליטר של LB המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר tetracyclin, 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, 10 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin עם שתי מושבות הלבנות משלב 1.4 ולתת להם לגדול בין לילה תחת תסיסה (250 סל&quot;ד) ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטהר את ה-DNA bacmid, גלולה החיידקים מצעד 1.5,resuspend התאים 300 μl של פתרון שאני ולהוסיף 300 μl של הפתרון השני (ערכת Maxiprep מQiagen). דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, להוסיף 300 μl של 3 M KOAc pH 5.5 ודגירה של 10 דקות על קרח. צנטריפוגה הדגימות ב 4 ° C, מהירות מקסימלית עבור 10 דקות. הוספת 800 μl של isopropanol לsupernatants ודגירה של 10 דקות על קרח. צנטריפוגה הדגימות ל15 דקות ב 4 ° C ולשטוף את הכדור עם 500 μl של 70% אתנול. תן את הכדור יבש וresuspend אותו בתנאים סטריליים ב40 μl של טריס-EDTA pH 8.0. ה-DNA bacmid יש לאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור baculoviruses כפי שתואר בפרוטוקול של היצרן. ניתן לאחסן Baculoviruses ב 4 ° C המוגנים מפני אור. </li></ol> 2. ביטוי חלבון רקומביננטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לבחור את baculovirus יעיל ביותר לטיהור וכדי לפקח על מה שפעם הוא הגיע לשיא של ביטוי חלבון, לבצע assay מיני זיהוםים כדלקמן: להדביק 2 x 10 7 של Sf9 נגועים תאים בתרבית ב27 מעלות צלזיוס בתקשורת של גרייס (השלימה עם 10% FBS ו -1% P / S) עם 133 μl (1/150) של baculovirus. לאסוף aliquots של 1.5 מיליליטר ב 0, 24, 48, ו72 שעות לאחר פגיעה. גלולה התאים ולנתח את רמת הביטוי של החלבון של עניין על ידי מערבי סופג באמצעות נוגדנים נגד תג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש baculovirus יעיל ביותר משלב 2.1 להדביק טווה מכילה 1.0 x 10 6 תאי Sf9 לכל מיליליטר ב500 מיליליטר של תקשורת עם יחס של 1/150 בין הווירוס ואמצעי תקשורת. בואו התאים הנגועים לגדול בתרחיף ב27 מעלות צלזיוס ולאסוף את התאים כאשר ביטוי החלבון המרבי (כפי שנקבע בשלב 2.1 לעיל) הוא הגיע. ניתן לאחסן את תאי pelleted ב-80 ° C עד שימוש נוסף. </li></ol> 3. הכנת lysate תא מסיס את כל שלבי הדגירה הבאות מתבצעים על 4 מעלות צלזיוס בסיבוב קל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse Sתאי F9 לבטא חלבון עניין שלך ב~ 20 מיליליטר של חיץ מחייב GST (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% Triton-X-100, מעכבי פרוטאז 1 מ&quot;מ DTT בPBS1X לריכוז סופי של NaCl של 250 מ&quot;מ, ו קוקטייל (Roche). באמבט מי קרח, dounce הפתרון 20x עם homogenizer dounce, sonicate 3x 30 שניות כל אחד (פלט 70%), וDounce שוב 20x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי). דגירה הכולל lysate התא עם 1 מ&quot;מ MgCl 2 וBenzonase 7 nuclease (2.5 U / ml) ל30 דקות ב 4 ° C כדי להסיר DNA או RNA זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 18,000 סל&quot;ד במשך 30 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי). צנטריפוגה supernatant שוב ל30 דקות ב 18,000 סל&quot;ד ב 4 ° C כדי לקבל lysate מסיס ברור. להעביר את supernatant דרך פילטר 0.2 או 0.45 מיקרומטר כדי למנוע סתימה. </li></ol> 4. כריכה של חלבון על חרוזים GST <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה lysate התא מסיס עם 1 מיליליטר של חרוזים GST (prewashed שתי פעמים עם10 מיליליטר של GST מחייב חיץ) במשך שעה 1 ב 4 ° C בסיבוב עדין. </li></ol> הערה: זמן הדגירה צריך להיות מותאם בהתאם ליציבות של החלבון והיעילות מחייבת. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב מהיר ב700 סל&quot;ד ולהסיר supernatant המכיל חלבונים מאוגדים (זה יכול להיות כל הזמן לניתוח נוסף). שטוף את החלבונים הנכנס GST (איור 3B, מסלול 1) עם חיץ הכביסה GST (GST חיץ מחייב עם 350 סופי מ&quot;מ NaCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.2 2x. בשטיפה האחרונה, להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את החרוזים עם 5 מ&quot;מ ה-ATP ו15 מ&quot;מ MgCl 2 (ב 10 מיליליטר חיץ מחייב GST) במשך שעה 1 ב 4 ° C כדי למנוע ספציפי מחייב של חלבוני חום הלם 8. שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם חיץ הכביסה GST. </li></ol> 5. PreScission מחשוף של GST <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חרוזים GST, להסיר את supernatant ולשטוף את חרוזי GST עם buf P5fer (50 4 pH מ&quot;מ NaHPO 7.0, 500 mM NaCl, גליצרול 10%, 0.05% Triton-X-100, 5 imidazole מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה GST-החרוזים עם אנזים PreScission במאגר P5 מ3 שעות ללילה בשעה 4 ° C. (מחלקים את חרוזים GST בשברים של 100 μl ולהוסיף 4-8 יחידות (2-4 μl) של אנזים המדולל בשל חיץ P5 100 μl). </li></ol> הערה: זמן הדגירה של צעד PreScission צריך להיות מותאם לפי המשקל המולקולרי, כמו גם את היציבות של החלבון. אם השפלה הוא ציין, זמן דגירה זה יכול להיות ירידה למינימום של 2 שעות במקום למשך הלילה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מהיר ולאסוף את supernatant. חזור על פעולה זו פעמיים לאחר הוספה של P5 100 μl חיץ לחרוזים וברכה כל השברים (איור 3B, מסלול 2). </li></ol> הערה: חרוזים הנותרים יכולים לשמש לניתוח יעילות מחשוף (איור 3B </strong&gt;, מסלול 3). בדרך כלל, 70-80% מהחלבון הוא ביקע. 6. לTALON מתכת זיקה שרף מחייב חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את elution מלמעלה ל3 שברים של 1 מיליליטר ודגירה כל אחד עם 100 חרוזים μl שרף זיקת מתכת טאלון יבשים (prewashed שתי פעמים עם חיץ P5) במשך שעה 1 בסיבוב. </li></ol> הערה: חלוקת elution בכמה שברים מגבירה את יעילות מחייב / שוטף. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את דקות שרף 5 עם חיץ P30 (חיץ P5 עם ריכוז סופי של 30 imidazole מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 6.2 2x וברכת חרוזים בצינור יחיד. לפני השטיפה האחרונה, להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר. </li></ol> תגובה: זה מתאים למדגם TALON המאוגד (איור 3B, מסלול 4). 7. Elution של החלבון המטוהר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שרף TALON חלבון קשורה למשך 5 דקות ברוטציה עם P500 חיץ (חיץ P5 עם ריכוז סופי של 500 imidazole מ&quot;מ). השתמש יחס בין החיץ וחרוזים של 1:1 v / נ (לדוגמא, אם אתה לקח 200 μl של חרוזים יבשים, תצטרך להוסיף 200 μl של P500). חזור על פעולה זו פעמיים ולשמור על כל שבריר eluted בנפרד (בשם elution 1 (E1), elution 2 (E2) וelution 3 (E3); איור 3B, נתיבי 5-7). </li></ol> הערה: חרוזים הנותרים יכולים לשמש לניתוח יעילות elution (איור 3B, ליין 8). בדרך כלל, 60-80% מהחלבון eluted בסך הכל. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הכמות ואיכות של החלבון מטוהר על ידי טעינה כ 20-40 μl של כל חלק עם ריכוז BSA סטנדרטי על SDS-PAGE וכתם עם Coomassie כחול (איור 3 ב) או כתם חלבון SYPRO לשם ויזואליזציה. </li></ol> תגובה: החלבון של עניין יכול גם להתגלות throughout הליך הטיהור באמצעות אנטי GST ונוגדנים נגדו (איור 3 ג). 8. אחסון של החלבון המטוהר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze החלבון מטוהר נגד חיץ אחסון מתאים (למשל 20 מ&quot;מ טריס אצטט pH 8.0, 200 מ&quot;מ כץ, 10% גליצרול, 1 mM EDTA, 0.5 מ&quot;מ DTT) ב 4 ° C. חשוב לבדוק למשקעים של החלבונים המטוהרים במהלך הדיאליזה. בדרך כלל אנחנו dialyze 2x עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס תחת סיבוב תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך aliquots הקטנים של החלבונים המטוהרים (10-20 μl) ולהקפיא בקרח יבש ל30 דקות. אחסן את aliquots ב -80 מעלות צלזיוס ולמנוע הפשרה / הקפאת מחזורים רבים. </li></ol>

<ol><li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li>
<li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li>
<li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis%2C+using+three+different+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li>
<li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li>
<li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li>
<li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li>
<li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2%2B+in+the+hydrolysis+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li>
<li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li>
<li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li>
<li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+vector+system%3A+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li>
</ol>

GST-פרוטוקול הטיהור שהוצג כאן מתאים לטיהור של מגוון רחב של גדלים של חלבונים רקומביננטיים: אנחנו מטוהרים בהצלחה לי RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), וחלבון לא יציב משקל מולקולרי גבוה של infantum שושנת יריחו: Li-BRCA2 (125kDa) 6,9. יתר על כן, החלבונים מטוהרים עם פרוטוקול זה היו ביוכימית פעיל 6. ההצלחה של שיטה זו אך ורק תלויה בביטוי, המסיסות והיציבות של החלבון הרצוי. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:...

הטיהור של חלבונים רקומביננטי היא חיונית כדי לענות על שאלות בסיסיות בביוכימיה. דרכים מקובלות של טיהור חלבונים כמו כרומטוגרפיה חילוף יונים והרחקת גודל כרומטוגרפיה להסתמך על תכונות פיסיקליות של חלבון המטרה, כגון נקודה איזואלקטרית ותשלום או גודל, בהתאמה. מאפייני החלבון האחרונים משותפים למגוון של חלבונים, אשר מגדיל באופן משמעותי את הסיכוי לזיהום חלבונים באסטרטגיות טיהור חלבונים קונבנציונליות. בעיה זו עלולה לעקוף עם השימוש בעמודות טיהור מרובות, אשר זה זמן רב. במקביל, שיטות כרומטוגרפיה האחרונות דורשות התקנה ניסיונית יקרה. טיהור זיקת תג מגביר משמעותית יעד ספציפי, כמו ברוב המקרים התג יהיה ייחודי לחלבון של עניין. במחקרים שנערך לאחרונה, טיהור דגל או HA-זיקה כבר בשימוש נרחב. בניגוד לrec הקייםפרוטוקולי טיהור חלבוני ombinant הבמשמשים תגים בודדים, הקמנו את השילוב הייחודי של שני תגים. השיטה שלנו כרוכה ההיתוך של GST-תג בN-הסופית והתג שלו בC-הסופית של החלבון של עניין, ליחס אופטימלי בין הכמות וטוהר של החלבון הרצוי. GST הוא תג ארוך (29 KDA), שהוא יעיל ביותר לטיהור בחרוזי Sepharose גלוטתיון. יתר על כן, באמצעות GST מבטיח עלות אפקטיביות של שיטת 1 שלנו. האפשרות לבקע את GST עם אנזים PreScission (עם רצף הכרת LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, וכתוצאה מכך התוספת של רק שתי חומצות אמינו) יש יתרונות רבים, למשל, אסטרטגיה זו תמנע שינויים של פונקציות החלבון הפיזיולוגיות בשל הפרעה allosteric. התג שלו הקטן התמזגו הגפיים חלבון האחרים משמש בשלב טיהור שני כדי להגדיל את טוהר חלבון על ידי שטיפה את GST ביקע, כמו גם חלבונים ואחרים מושפלים<html> מזהמים. בנוסף, הפרוטוקול אינו מחייב צעד דיאליזה בעת מעבר מGST לעמודה שלו לטיהור צעד (שרף TALON). מזהמים נפוצים בתהליכי טיהור כאלה הם החלבונים Heat Shock (HSP). התוספת של שלב דגירה עם MgCl 2 ו-ATP מאפשרת הסרת המזהמים אלה (איור 1). חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) וביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) הן טכניקות נפוצות שתלויה במכשור יקר לייצר תשואה גבוהה של החלבון מטוהר של עניין. פרוטוקול הטיהור אצווה אנו מציגים כאן, לעומת זאת, הוא ידני ואינו דורש התקנת אינסטרומנטלי יקרה. ניתן להגיע לתשואה גבוהה של חלבון על ידי דרוג את הפרוטוקול. במקביל, עם פרוטוקול הטיהור אצווה, elution הנפח יכול להיות מותאם על מנת לשפר את ריכוז חלבון, שאינו נתון עם FPLC או HPLC. ntent &quot;&gt; כמו כן, עם GST-פרוטוקול הטיהור אצווה, חלבונים עם גודל טווח של ~ 10-300 kDa יכולים להיות מטוהרים. אחד היתרונות הגדולים ביותר הוא שניתן על ידי העובדה שאחד יכול לטהר כמה חלבונים באותו הזמן , למשל, שניהם wild-type ו המוטציה בחלבון שלה. ההצלחה של הפרוטוקול המובא אך ורק תלוי ברמת הביטוי והמסיסות של החלבון של עניין.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>E.Coli DH10Bac (מוכשר)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Solution I ו-II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Life)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 תאים נגועים</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>PreScission אנזים GE</td><td>Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>המדיום הנגוע של גרייס תוסף</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי המאופיין</td><td>ב-Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P/S (פניצילין-סטרפטומיצין)</td><td>Gibco (Life)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>שרף גלוטתיון Sepharose</td> GE <td>bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>רוש</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>שרף טאלון</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco (Life)15710064</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן GST פוליקלונלי</td><td>ייצור בבית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חד שבטי 6X-His-נוגדן</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>Dounce הומוגנייזר (הדוק)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td><td>פישר</td><td>דגם 150</td><td></td></tr><tr><td>שקית דיאליזה (50 מ"מ)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>2115217</tr></tbody></table>

gst-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

מבחני מפתח בהאינזימולוגיה לאפיון ביוכימי של חלבונים במבחנה מחייבים ריכוז גבוה של החלבונים המטוהרים של עניין. פרוטוקולי טיהור חלבון צריכים לשלב יעילות, פשטות ויעילות עלות 1. כאן, אנו מתארים את שיטת GST-כמערכת חדשה בקנה מידה קטן טיהור זיקה לחלבונים רקומביננטיים, המבוססת על תג N-מסוף גלוטתיון Sepharose (GST) 2,3 ותג 10xHis טרמינל C-4, אשר שניהם התמזגו לחלבון של עניין. המבנה השני משמש להפקת baculoviruses, לזיהום של תאים נגועים Sf9 לביטוי חלבון 5. GST הוא תג ארוך למדי (29 KDA) המשמש כדי להבטיח את יעילות טיהור. עם זאת, זה יכול להשפיע על תכונות פיסיולוגיות של החלבון. לפיכך, הוא ביקע לאחר מכן את החלבון באמצעות אנזים PreScission 6. על מנת להבטיח את טוהר מרבי וכדי להסיר את GST ביקע, אנחנוהוסיף צעד טיהור הזיקה שני המבוסס על התג שלו קטן יחסית. חשוב מכך, הטכניקה שלנו מבוססת על שני תגים שונים איגוף שני קצוות של החלבון, אשר הוא כלי יעיל כדי להסיר חלבונים מושפלים, ולכן מעשיר את החלבונים באורך מלא. השיטה שהוצגה כאן אינה דורשת התקנת אינסטרומנטלי יקרה, כגון FPLC. בנוסף, אנו משולבים MgCl 2 ושוטף ATP כדי להסיר זיהומים חלבון הלם חום וטיפול nuclease לבטל לזהם חומצות גרעין. לסיכום, השילוב של שני תגים שונים איגוף N-וה-C-מסוף ואת היכולת לבקע את אחד מהתגים, ערבויות ההתאוששות של חלבון נקי במיוחד ואורך מלא של עניין.

כדי להמחיש את היעילות של GST-פרוטוקול הטיהור, אנחנו מטוהרים Rec14, ס חלבון pombe של 32.9 kDa. Rec14 cDNA שובט בוקטור pFastBac1 שונה שלנו ומאפשר תוספות של GST-ו תגים בN-ו-C-Termini, בהתאמה (איור 1 א). baculovirus רקומביננטי הוכן לאחר מכן ונהג להדביק תאים נגועים SF9 לביטוי חלבון. Lysates התא מסיס הודגרו עם חרוזים GST והנכנס חלבונים היו eluted על ידי ביקוע GST עם פרוטאז PreScission. -Rec14 החלבון וכתוצאה מכך היה הזיקה מטוהרת על שרף TALON וכרוך-חלבונ...

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים שיטה יעילה וחסכונית מאוד בקנה מידה קטן טיהור חלבונים, המאפשרת טיהור של חלבונים רקומביננטיים על ידי באופן ייחודי המשלב GST-תג cleavable והתג שלו קטן.

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג חלבון עניין מלא ומזוהה ברמת טוהר גבוהה. מטרה זו מושגת על ידי הפקת נגיף bao רקומביננטי, המשמש להדבקת תאי חרקים מסוג SF nine כדי להשיג גרסה של חלבון העניין בעלת שני תגים, שהיא ממיסה ומבוטאת ברמה גבוהה. לאחר מכן נערך תהליך טיהור זיקה בשני שלבים, המאופיין בטיהור של חלבון מתוג glutathione seros, ולאחריו כרומטוגרפיית זיקה למתכות.תוצאת הטיהור היא חלבון עם תג היסטידין בדרגת טוהר גבוהה. לאחר מכן, דגימות החלבון המטוהר עוברות דיאליזה כדי להבטיח ריכוזי מלח נמוכים בבופר האחסון. התוצאות המתקבלות מראות את ממיסות הביטוי, את הכמות ואת האיכות של החלבון, בהתבסס על צביעה של כלל החלבונים בג'ל SDS-PAGE.הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר נתקלנו בקשיים בטיהור חלבונים גדולים ולא יציבים כגון PAL B two ו-BOC two. לכן, היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו טיהור זיקה (affinity purification) בשלב אחד, הוא שבפרוטוקול טיהור הזיקה הדו-שלבי שלנו, החלבון המתקבל הוא טהור מאוד ובדרך כלל נקי מתוצרי פירוק. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של החלבונים, כגון תפקודים ביוכימיים של חלבונים רקומביננטיים מטוהרים.פרוטוקול זה מתחיל בייצור של נגיף bao רקומביננטי, ולאחריו בחירה של נגיף ה-BA היעיל ביותר כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט להדבקה. הכינו כלי תרבית spinner המכיל בין 0.75 ל-1.0 כפול 10⁶ תאי SF9 ב-500 milliliters של מצע, ביחס של 1 ל-150 בין הנגיף למצע. הניחו את ה-spinner תחת מנדף תרביות תאים והדביקו את התאים על ידי הוספת הנפח הנדרש של תרחיף נגיף baula לתוך תרחיף התאים דרך אחת מזרועות ה-spinner.הנח לתאים המודבקים לגדול בתרחיף בטמפרטורה של 27 °C וקצור את התאים כאשר מתבלט הביטוי המקסימלי של החלבון, אשר נקבע בעת בחירת הווירוס הבקולווירי היעיל ביותר. לאחר קצירת התאים, בצע ליזיס לתאי SF9 המבטאים את החלבון המבוקש בערך ב-20 milliliters של באפר קישור GST, בתוספת מעכבי פרוטאז, בתוך אמבט קרח. העבר את התמיסה 20 פעמים דרך הומוגנייזר, ולאחר מכן בצע סוניקציה בשלושה מחזורים של 30 שניות לפני העברה חוזרת של 20 פעמים. לאחר מכן, סנטריפוג את ליזט התאים ב-18,000 RPM למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C ושמור את העלייה. הדגר את ליזט התאים המסיס עם 1 milliliter של חרוזי GST שנשטפו מראש למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C תחת סיבוב עדין.יש לאפטמיז את זמן האינקובציה בהתאם ליציבות החלבון ולנצילות הקישור לאחר הקישור. יש לבצע סבב צנטריפוגה קצר (Quick spin) במהירות של 700 RPM ולהסיר את supernatant המכיל חלבונים שאינם קשורים. יש לשטוף את החלבונים הקשורים ל-GST באמצעות תמיסת שטיפה של GST.חזור על תהליך זה פעמיים לאחר השטיפה האחרונה. הסר כמה שיותר מהנוזל העליון. לאחר מכן, הדגר את החרוזים עם 5 mM ATP ו-15 mM מגנזיום כלוריד ב-10 mL של באפר קישור GST למשך שעה אחת ב-4 °C כדי למנוע קישור לא ספציפי של חלבוני הלם חום לאחר ההדגרה.שטוף את החרוצים שלוש פעמים עם תמיסת שטיפה GST. לאחר סבב צנטריפוגה של חרוצי ה-GST והסרת הנוזל העליון (supernatant), שטוף את חרוצי ה-GST עם תמיסת P five. לאחר מכן, חלק את חרוצי ה-GST לאליקוטים של 100 µL והוסף ארבע עד שמונה יחידות של precision enzyme המדולל ב-100 µL של תמיסת P five.דגרו את חרוזי ה-GST עם האנזים למשך שלוש שעות ועד ללילה בטמפרטורה של 4 °C תחת סיבוב עדין. יש לבצע אופטימיזציה לזמן הדגירה בהתאם למשקל המולקולרי וכן ליציבות החלבון לאחר השחרור. בצעו ספינט קצר ואספו את העלייה.הוסף 100 µL של P five buffer לחרוצים. לאחר מכן חזור על הפעולה, על הצנטריפוגה ועל איסוף הסופרנאט פעמיים. משוך את כל הפראקציות.חלק את ה-EIT לשלוש מנות של מיליליטר אחד והדגר כל אחת מהן עם 100 microliters של חרוזי שרף למסירת מתכת talon שנשטפו מראש למשך שעה תחת סיבוב; חלוקת האלוציה למספר מנות מגבירה את יעילות הקישור והשטיפה. לאחר מכן, שטוף את השרף במשך חמש דקות עם באפר P 30 בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius תחת סיבוב עדין. לאחר חזרה על השטיפה פעמיים, רכז את החרוזים למבחנה אחת כדי לבצע אלוציה של החלבון המטוהר.הוסף באפר P 500 לשרף ה-talon שקשור אליו החלבון. הוסף באפר ביחס של נפח אחד למספר נפחים שווה של חרוצים. הדגר את התוך עבור חמש דקות תחת סיבוב.חזור על שלב זה פעמיים. שמור כל אחת מהfraktsions המופרדות בנפרד לצורך אחסון החלבון המטוהר. בצע דיאליזה לחלבון מול באפר אחסון מתאים פעמיים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C תחת ערבוב.חשוב לבדוק אם חלה שקיעה של החלבון המטוהר במהלך הדיאליזה. הכינו אליקוטות קטנות של החלבון המטוהר והקפיאו על קרח יבש למשך 30 דקות. אחסנו את האליקוטות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס והימנעו ממספר רב של מחזורי הפשרה והקפאה.נתחו את תהליך הטיהור על ידי טעינה של כ-20 עד 40 µL מכל פראקציה על ג'ל SDS-PAGE. לאחר הרצת הג'ל, צבעו אותו ב-Coomassie Blue או בצבע חלבון אחר לצורך ויזואליזציה. הליזאטים התמיסים והכלליים של תאי SF9 שהודבקו בנגיף recombinant baculovirus REC14, או תאים שלא הודבקו (mock) כביקורת, נותחו באמצעות צביעת Coomassie Blue, מה שאיפשר אישור של ביטוי חלבון GST-RE14-His במהלך תהליך הטיהור. דגימות רבות נותחו כדי לעקוב אחר יעילות השיטה באמצעות ניתוח הדגימות ב-Coomassie Blue.צביעה מראה כי במהלך השלב הראשון של הטיהור, GST Rec 14 נקשר כראוי לחרוזי GST עם משקל מולקולרי נראה של כ-50 kilodaltons בשל היתוך של rec 14 עם GST; לאחר ביסוע מדויק עם G-S-T-G-S-T, rec 14 hiss חופשי נדחס סביב 37 kilodaltons. בעוד שניתן להבחין ב-GST המבוסע על חרוזי ה-GST, למרות שחלק מה-REC 14 חופשי עדיין נשאר קשור לחרוזי ה-GST, הושגה העשרה ניכרת של REC 14 hiss. ניתן לשפר שלב זה על ידי הגדלת זמן הדגירה של החלבון עם הפרוטאז המדויק; ניתוח של REC 14 hiss הקשור לחרוזי Talon בהשוואה לחלבונים שהופרשו לאחר שלב טיהור ה-GST מראה שחלק גדול מ-REC 14 hiss קשור לחרוזי talon.לאחר מספר שטיפות, REC 14 hiss הופרש ונאסף, ובוצעו שלוש אלוציות. הניתוח חשף רמה גבוהה של טוהר של rec 14 hiss ואת הריכוז הגבוה ביותר של rec 14 hiss באלוציה הראשונה; השוואה של הפראקציות שהופרשו ל-talon beads לאחר האלוציה ממחישה את יעילות התהליך, שכן כמות מזערית של rec 14 hiss זוהתה כקשורה לחרוזים.דגימות אלו הועברו גם לאנליזת Western blot עם נוגדני anti GST ו-anti hiss כדי לעקוב אחר REC 14. לאורך הפרוצדורה, ה-blot של anti GST מראה כי חלק מה-GS TRE 14 ו-GST לבדו היו נוכחים בחלבונים המוזכרים משלב טיהור ה-GST, וכי מזהמים הוסרו באמצעות שלב טיהור ה-affinity של ה-hiss tag. blot זה חושף כי ה-GST הוסר ביעילות מ-re 14 על ידי הטיפול המדויק ושלב טיהור ה-hiss ttag.תכלית ה-anti hiss blot היא לזהות את re 14. blot זה מאשר כי GST Rec 14 hiss ו-REC 14 hiss לא עברו פירוק מלא ולא הוסרו לחלוטין מחרוזי ה-GST. יתרה מכך, נראה כי בריכוז גבוה REC 14 נוטה להצטבר (aggregate).לסיכום, התוצאות המוצגות מדגימות את יעילותם של טיהורי GST ו-His לטיהור של S palm B rec 14. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק חלבון רקומביננטי בדרגת טוהר גבוהה, ברגע שהשיטה תשלט.ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 12 שעות לאחר דגנרציה של ly acid מסיס, במידה שהיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבוד במהירות ובאופן קפדני בטמפרטורה של 4 °C כדי למנוע דגנרציה של חלבונים בעקבות הפעולה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות co-precipitation או ספקטרומטריה של מסות, כדי להשיב על שאלות נוספות, כגון זיהוי שותפים חלבוניים או מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות של החלבון הנחקר.למרות שביצענו שימוש בשיטה זו עבור חלבוני תיקון DNA, ניתן להתאים את האסטרטגיה כדי לחקור תפקוד של חלבונים בתחומי מחקר אחרים.

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

התמרה חלבון ומאפשרת העברה ישירה של חלבונים פעילים ביולוגית לתוך התאים. בניגוד לשיטות קונבנציונליות כגון transfection DNA נגיפי או התמרה זו פרדיגמה פולשנית מאפשרת מניפולציה הסלולר היעילה ביותר באופן titratable עקיפת רעילות הסלולר את הסיכון של שינוי בשעור על ידי הנדסה גנטית קבע.

הנדסה Cell-חדיר חלבון

כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיהור מאוד פעיל Hsp104, AAA hexameric + חלבון מן שמרים, אשר זוגות הידרוליזה ל-ATP disaggregation חלבון. תכנית זו מנצל לבנות His6-tagged לטיהור זיקה...

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

הרומן יעילים שני שלבים זיקה כרומטוגרפיה פרוטוקול פותחה מתואר בפירוט. השיטה מבוססת על תג טיהור קטן עם שתי זיקות מובנה ישים למגוון רחב של חלבונים יעד עם מאפיינים שונים.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

אנו מתארים שיטה לטיהור זיקה מתויגת-של חלבונים רקומביננטי באמצעות רובוטיקה נוזלית לטיפול. שיטה זו היא בדרך כלל ישימה לטיהור בקנה המידה הקטנה של חלבונים המתויגים המסיסים בפורמט תפוקה גבוהה.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

מקור: בקר, ב. ואחרים. בדיקת דיווח פשוטה מבוססת פלואורסצנציה לזיהוי רכיבים תאיים הנדרשים להעברת שרשרת רעל ריצין A (RTA) בשמרים. J. Vis. Exp. (2017).הסרטון הזה מדגים את טיהור חלבון רקומביננטי עם תגית פוליהיסטידין באמצעות כרומטוגרפיית אפיניטי מבוססת ניקל. הוא מפרט שלבים מרכזיים, כולל פירוק חיידקים באמצעות סוניקציה, הבהרה וסינון של הליזאט, וקשירה סלקטיבית והשחרור של החלבון המטרה באמצעות אימידזול.

 טכניקת כרומטוגרפיית זיקה לטיהור חלבון חיידקי רקומביננטי

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת הכרומטוגרפיה של זיקה לניקל לטיהור אנזימי פירופוספוקינאז המתויגים בהיסטידין מחיידקי Clostridium difficile.

טיהור חלבונים מבוסס כרומטוגרפיה של ניקל: טכניקה לטיהור חלבונים רקומביננטיים מתויגים פוליהיסטידין מליזט תאי חיידקים

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

הליך זה הציג את refolding של התחום מחייב ליגנד periplasmic dCACHE של קמפילובקטר jejuni chemoreceptor Tlp3 מן ההכללה וגופי הטיהור להניב כמויות מיליגרם של חלבון.

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

הטיהור של תעלות יונים היא לעתים קרובות מאתגרת, אבל ברגע מושגת, זה יכול העלול לאפשר במבחנה חקירות פונקציות ומבנים של הערוצים. כאן, אנו מתארים את נהלי stepwise הביטוי ואת טיהור bestrophin בתרבית של חלבונים, משפחה של Ca2 +-הפעלת ערוצי Cl– .

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס החלבון INAD, בפרוטוקול זה פותחה אסטרטגיית טיהור זיקה משופרת בתוספת אסטרטגיית תחרות כדי לטהר את ערוץ ה- TRP האנדוגני Drosophila .

טיהור של תעלות פוטנציאליות של קולטן חולף דרוזופילה אנדוגנית

מאמר זה מספק הליך לטיהור זיקה של חלבון רקומביננטי אנושי, דש אנדונוקלאז 1 (FEN1), אשר תויג בתג 6X-היסטידין. הפרוטוקול כולל שימוש בשני עמודי יונים מתכתיים משותקים נפרדים לטיהור החלבון המתויג.

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר 

למד טיהור חלבונים בשני שלבי זיקה באמצעות תגי GST ו-His בתאי SF9. שיטה זו מייצרת חלבונים מטוהרים באורך מלא לחקר פונקציות ביוכימיות.

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

גלה סרטונים נוספים