GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג חלבון מטוהר מאוד באורך מלא ומעניין. זה מושג על ידי ייצור נגיף bao רקומביננטי, המשמש להדבקת תשעה תאי חרקים SF על מנת להשיג גרסה דו-תגית מבוטאת ומסיסה מאוד של החלבון המבוקש. לאחר מכן מתבצע טיהור זיקה דו-שלבי, המאופיין בטיהור של גלוטתיון, חלבון מתויג בסרוס, ואחריו כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית.

תוצאת הטיהור היא חלבון טהור ביותר המסומן בהיסטידין. לאחר מכן, דגימות חלבון מטוהרות עוברות דיאליזה על מנת להבטיח ריכוזי מלח נמוכים במאגר האחסון. מתקבלות תוצאות המראות את מסיסות הביטוי, הכמות והאיכות של החלבון על סמך כתם חלבון שלם של ג'ל דף SDS.

הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשהתקשינו לטהר חלבונים גדולים ולא יציבים כמו PAL B 2 ו-BOC 2. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טיהור זיקה שלב אחד, הוא שבפרוטוקול טיהור הזיקה הדו-שלבי שלנו, החלבון המתקבל הוא טהור מאוד ובדרך כלל נקי מתוצרי פירוק. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום הביולוגיה של החלבונים, כגון פונקציות ביוכימיות של חלבונים רקומביננטיים מטוהרים.

פרוטוקול זה מתחיל בייצור של נגיף bao רקומביננטי, ואחריו בחירת נגיף ה-BA היעיל ביותר כמתואר בפרוטוקול הטקסט להדבקה. הכן כלי תרבית ספינר המכיל בין 0.75 ל -1.0 כפול 10 לששת תאי SF תשעה ב -500 מיליליטר מדיה עם יחס של אחד ל -150 בין הנגיף למדיה. הנח את הספינר מתחת למכסה המנוע של תרבית תאים, הדביק את התאים על ידי הוספת הנפח הדרוש של תרחיף נגיף הבאולה לתוך תרחיף התאים דרך זרוע אחת של הספינר.

תנו לתאים הנגועים לגדול בתרחיף בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס וקצרו את התאים כאשר מגיעים לביטוי החלבון המקסימלי, שנקבע בעת בחירת הנגיף המקולרי היעיל ביותר. לאחר קצירת תאים, תשעה תאים מבטאים את החלבון המעניין בכ-20 מיליליטר של מאגר קשירת GST, בתוספת מעכבי פרוטאז באמבט מי קרח. הורידו את התמיסה 20 פעמים עם הומוגנייזר למטה ואז סוניקטו במשך שלושה מחזורים 32 לפני שרוקדים שוב 20 פעמים לאחר מכן, צנטריפוגה של התא ליזאט ב-18,000 סל"ד למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס והשאירו את הסופרנטנט דוגר על ליזאט התא המסיס עם מיליליטר אחד של חרוזי GST שטופים מראש למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס בסיבוב עדין.

יש לייעל את זמן הדגירה בהתאם ליציבות הפרו ויעילות הכריכה לאחר הכריכה. סיבוב מהיר ב-700 סל"ד והסר סופרנטנט המכיל חלבונים לא קשורים. שטפו את החלבונים הקשורים ל-GST עם מאגר כביסה GST.

חזור על תהליך זה פעמיים לאחר הכביסה האחרונה. הסר כמה שיותר סופרנטנט. לאחר מכן דגרו את החרוזים עם חמישה מילי-מולרי A TP ו-15 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד ב-10 מיליליטר של מאגר קשירת GST למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס כדי למנוע קשירה לא ספציפית של חלבוני הלם חום לאחר הדגירה.

שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם מאגר כביסה GST. לאחר צנטריפוגה של חרוזי ה-GST והסרת ה-supernatant, שטפו את חרוזי ה-GST עם מאגר P five. לאחר מכן, חלקו את חרוזי ה-GST, הפרות של 100 מיקרוליטר והוסיפו ארבע עד שמונה יחידות של אנזים מדויק מדולל ב-100 מיקרוליטר של מאגר P חמישה.

דגרו את חרוזי ה-GST עם אנזים למשך שלוש שעות עד לילה בארבע מעלות צלזיוס בסיבוב עדין. יש לייעל את זמן הדגירה בהתאם למשקל המולקולרי וכן ליציבות החלבון לאחר המחשוף. סובב במהירות ואסוף את הסופרנטנט.

הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר P חמש לחרוזים. לאחר מכן חזור, סובב ואוסף סופרנטנט פעמיים. משוך את כל השברים.

חלקו את ה-EIT לשלושה שברים של מיליליטר אחד ודגרו כל אחד עם 100 מיקרוליטר של חרוזים יבשים של שרף זיקה מתכת טלון שטופים מראש למשך שעה אחת בסיבוב, חלוקת הפליטה למספר שברים, מגבירה את יעילות הכריכה והכביסה. לאחר מכן שטפו את השרף במשך חמש דקות עם מאגר P 30 בארבע מעלות צלזיוס בסיבוב עדין. לאחר חזרה על הכביסה פעמיים, משוך את החרוזים בצינור יחיד כדי לחלץ את החלבון המטוהר.

הוסף מאגר P 500 לשרף הטאלון הקשור לחלבון. הוסף יחס חיץ לחרוזים של נפח אחד לאחד. נפח. דגרו את המתלה למשך חמש דקות בסיבוב.

חזור על שלב זה פעמיים. שמירה על כל חלק חמקמק בנפרד לאחסון החלבון המטוהר. דיאליזה של החלבון כנגד מאגר אחסון מתאים פעמיים למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס תחת תסיסה.

חשוב לבדוק אם יש משקעים של החלבון המטוהר במהלך הדיאליזה. הכינו כמויות קטנות של החלבון המטוהר והקפיאו על קרח יבש למשך 30 דקות. אחסן את המינונים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס והימנע ממחזורי הקפאה רבים של הפשרה.

נתח את תהליך הטיהור על ידי טעינת כ-20 עד 40 מיקרוליטר מכל שבר על ג'ל דף SDS. לאחר הפעלת כתם הג'ל עם כחול קומאסי או כתם חלבון להדמיה, הליזטים המסיסים והכוללים של התאים מתאי SF תשעה הנגועים בנגיף ה-valo הרקומביננטי REC 14 או נגועים מדומים כביקורת נותחו על ידי צביעה כחולה של קומאסי, מה שמאפשר אישור לביטוי של GST re 14 החלבון שלו במהלך תהליך הטיהור. דגימות רבות נותחו כדי לעקוב אחר יעילות ניתוח השיטה של דגימות אלה על ידי קומאסי בלו.

הצביעה מראה כי במהלך השלב הראשון של הטיהור, GST Rec 14 נקשר כהלכה לחרוזי GST עם משקל מולקולרי לכאורה של כ-50 קילודלטון עקב היתוך של rec 14 עם GST לאחר מחשוף מדויק עם G-S-T-G-S-T, rec 14 חופשי נודד סביב 37 קילודלטון. בעוד שניתן לדמיין את ה-GST השסוע על חרוזי ה-GST, למרות חלק מ-REC 14 ללא GST שעדיין נשאר קשור לחרוזי GST, הושגה העשרה ניכרת של REC 14 hiss. ניתן לשפר שלב זה על ידי הגדלת זמן הדגירה של החלבון עם ניתוח פרוטאז מדויק של שריקה REC 14 הקשורה לחרוזי טאלון בהשוואה לחלבונים שנרמזו לאחר שלב טיהור ה-GST מראה שחלק גדול מהשריקה של REC 14 קשור לחרוזי טאלון.

לאחר מספר כביסות, שריקה של REC 14 חמקה ונאספה, בוצעו שלוש אשליות. הניתוח חשף טוהר גבוה של rec 14 hiss והריכוז הגדול ביותר של rec 14 hiss בהשוואה האלוקיאנית הראשונה של שברים חמקמקים לחרוזי הטאלון לאחר ש-Ellucian ממחיש את יעילות האשליה. מכיוון שניתן לזהות שריקה קטנה של 14 כקשורה על חרוזים.

דגימות אלה עברו גם ניתוח דם מערבי עם נוגדנים נגד GST ואנטי היס על מנת לעקוב אחר REC 14. לאורך כל ההליך, הכתם נגד GST מראה שחלק מה-GS TRE 14 ו-GST לבדם היו נוכחים בחלבונים הנרמזים משלב טיהור ה-GST וכי מזהמים הוסרו על ידי שלב טיהור הזיקה של תג השריקה. כתם זה מגלה כי GST הוסר ביעילות מ-re 14 על ידי הטיפול המדויק ושלב טיהור ה-ttag של השריקה.

הכתם נגד שריקה נועד לזהות מחדש 14. כתם זה מאשר כי שריקה של GST Rec 14 ו-REC 14 לא נבקעו לחלוטין והוסרו מחרוזי ה-GST. יתר על כן, בריכוז גבוה נראה ש-REC 14 מצטבר.

לסיכום, התוצאות שהוצגו מדגימות את היעילות של טיהור שריקת GST לטיהור S palm B rec 14. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשחזר אנרגיה יפה מאוד. חלבון משולב לאחר שליטה.

טכניקה זו יכולה להיעשות תוך 12 שעות לאחר הניוון של חומצה מסיסה אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד במהירות ובקפדנות בארבע מעלות צלזיוס כדי למנוע פירוק חלבון בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מבחני משקעים בקוד או ספקטרומטריית מסה על מנת לענות על שאלות נוספות כגון זיהוי שותפים לחלבון או שינוי לאחר תרגום של החלבון המעניין.

למרות שאנו משתמשים בשיטה זו עבור DNA, ניתן לשנות חלבוני תיקון לאסטרטגיה כדי לחקור את תפקודם של חלבונים בתחומי מחקר אחרים.