GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג חלבון עניין מלא ומזוהה ברמת טוהר גבוהה. מטרה זו מושגת על ידי הפקת נגיף bao רקומביננטי, המשמש להדבקת תאי חרקים מסוג SF nine כדי להשיג גרסה של חלבון העניין בעלת שני תגים, שהיא ממיסה ומבוטאת ברמה גבוהה. לאחר מכן נערך תהליך טיהור זיקה בשני שלבים, המאופיין בטיהור של חלבון מתוג glutathione seros, ולאחריו כרומטוגרפיית זיקה למתכות.

תוצאת הטיהור היא חלבון עם תג היסטידין בדרגת טוהר גבוהה. לאחר מכן, דגימות החלבון המטוהר עוברות דיאליזה כדי להבטיח ריכוזי מלח נמוכים בבופר האחסון. התוצאות המתקבלות מראות את ממיסות הביטוי, את הכמות ואת האיכות של החלבון, בהתבסס על צביעה של כלל החלבונים בג'ל SDS-PAGE.

הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר נתקלנו בקשיים בטיהור חלבונים גדולים ולא יציבים כגון PAL B two ו-BOC two. לכן, היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו טיהור זיקה (affinity purification) בשלב אחד, הוא שבפרוטוקול טיהור הזיקה הדו-שלבי שלנו, החלבון המתקבל הוא טהור מאוד ובדרך כלל נקי מתוצרי פירוק. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של החלבונים, כגון תפקודים ביוכימיים של חלבונים רקומביננטיים מטוהרים.

פרוטוקול זה מתחיל בייצור של נגיף bao רקומביננטי, ולאחריו בחירה של נגיף ה-BA היעיל ביותר כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט להדבקה. הכינו כלי תרבית spinner המכיל בין 0.75 ל-1.0 כפול 10⁶ תאי SF9 ב-500 milliliters של מצע, ביחס של 1 ל-150 בין הנגיף למצע. הניחו את ה-spinner תחת מנדף תרביות תאים והדביקו את התאים על ידי הוספת הנפח הנדרש של תרחיף נגיף baula לתוך תרחיף התאים דרך אחת מזרועות ה-spinner.

הנח לתאים המודבקים לגדול בתרחיף בטמפרטורה של 27 °C וקצור את התאים כאשר מתבלט הביטוי המקסימלי של החלבון, אשר נקבע בעת בחירת הווירוס הבקולווירי היעיל ביותר. לאחר קצירת התאים, בצע ליזיס לתאי SF9 המבטאים את החלבון המבוקש בערך ב-20 milliliters של באפר קישור GST, בתוספת מעכבי פרוטאז, בתוך אמבט קרח. העבר את התמיסה 20 פעמים דרך הומוגנייזר, ולאחר מכן בצע סוניקציה בשלושה מחזורים של 30 שניות לפני העברה חוזרת של 20 פעמים. לאחר מכן, סנטריפוג את ליזט התאים ב-18,000 RPM למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C ושמור את העלייה. הדגר את ליזט התאים המסיס עם 1 milliliter של חרוזי GST שנשטפו מראש למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C תחת סיבוב עדין.

יש לאפטמיז את זמן האינקובציה בהתאם ליציבות החלבון ולנצילות הקישור לאחר הקישור. יש לבצע סבב צנטריפוגה קצר (Quick spin) במהירות של 700 RPM ולהסיר את supernatant המכיל חלבונים שאינם קשורים. יש לשטוף את החלבונים הקשורים ל-GST באמצעות תמיסת שטיפה של GST.

חזור על תהליך זה פעמיים לאחר השטיפה האחרונה. הסר כמה שיותר מהנוזל העליון. לאחר מכן, הדגר את החרוזים עם 5 mM ATP ו-15 mM מגנזיום כלוריד ב-10 mL של באפר קישור GST למשך שעה אחת ב-4 °C כדי למנוע קישור לא ספציפי של חלבוני הלם חום לאחר ההדגרה.

שטוף את החרוצים שלוש פעמים עם תמיסת שטיפה GST. לאחר סבב צנטריפוגה של חרוצי ה-GST והסרת הנוזל העליון (supernatant), שטוף את חרוצי ה-GST עם תמיסת P five. לאחר מכן, חלק את חרוצי ה-GST לאליקוטים של 100 µL והוסף ארבע עד שמונה יחידות של precision enzyme המדולל ב-100 µL של תמיסת P five.

דגרו את חרוזי ה-GST עם האנזים למשך שלוש שעות ועד ללילה בטמפרטורה של 4 °C תחת סיבוב עדין. יש לבצע אופטימיזציה לזמן הדגירה בהתאם למשקל המולקולרי וכן ליציבות החלבון לאחר השחרור. בצעו ספינט קצר ואספו את העלייה.

הוסף 100 µL של P five buffer לחרוצים. לאחר מכן חזור על הפעולה, על הצנטריפוגה ועל איסוף הסופרנאט פעמיים. משוך את כל הפראקציות.

חלק את ה-EIT לשלוש מנות של מיליליטר אחד והדגר כל אחת מהן עם 100 microliters של חרוזי שרף למסירת מתכת talon שנשטפו מראש למשך שעה תחת סיבוב; חלוקת האלוציה למספר מנות מגבירה את יעילות הקישור והשטיפה. לאחר מכן, שטוף את השרף במשך חמש דקות עם באפר P 30 בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius תחת סיבוב עדין. לאחר חזרה על השטיפה פעמיים, רכז את החרוזים למבחנה אחת כדי לבצע אלוציה של החלבון המטוהר.

הוסף באפר P 500 לשרף ה-talon שקשור אליו החלבון. הוסף באפר ביחס של נפח אחד למספר נפחים שווה של חרוצים. הדגר את התוך עבור חמש דקות תחת סיבוב.

חזור על שלב זה פעמיים. שמור כל אחת מהfraktsions המופרדות בנפרד לצורך אחסון החלבון המטוהר. בצע דיאליזה לחלבון מול באפר אחסון מתאים פעמיים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C תחת ערבוב.

חשוב לבדוק אם חלה שקיעה של החלבון המטוהר במהלך הדיאליזה. הכינו אליקוטות קטנות של החלבון המטוהר והקפיאו על קרח יבש למשך 30 דקות. אחסנו את האליקוטות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס והימנעו ממספר רב של מחזורי הפשרה והקפאה.

נתחו את תהליך הטיהור על ידי טעינה של כ-20 עד 40 µL מכל פראקציה על ג'ל SDS-PAGE. לאחר הרצת הג'ל, צבעו אותו ב-Coomassie Blue או בצבע חלבון אחר לצורך ויזואליזציה. הליזאטים התמיסים והכלליים של תאי SF9 שהודבקו בנגיף recombinant baculovirus REC14, או תאים שלא הודבקו (mock) כביקורת, נותחו באמצעות צביעת Coomassie Blue, מה שאיפשר אישור של ביטוי חלבון GST-RE14-His במהלך תהליך הטיהור. דגימות רבות נותחו כדי לעקוב אחר יעילות השיטה באמצעות ניתוח הדגימות ב-Coomassie Blue.

צביעה מראה כי במהלך השלב הראשון של הטיהור, GST Rec 14 נקשר כראוי לחרוזי GST עם משקל מולקולרי נראה של כ-50 kilodaltons בשל היתוך של rec 14 עם GST; לאחר ביסוע מדויק עם G-S-T-G-S-T, rec 14 hiss חופשי נדחס סביב 37 kilodaltons. בעוד שניתן להבחין ב-GST המבוסע על חרוזי ה-GST, למרות שחלק מה-REC 14 חופשי עדיין נשאר קשור לחרוזי ה-GST, הושגה העשרה ניכרת של REC 14 hiss. ניתן לשפר שלב זה על ידי הגדלת זמן הדגירה של החלבון עם הפרוטאז המדויק; ניתוח של REC 14 hiss הקשור לחרוזי Talon בהשוואה לחלבונים שהופרשו לאחר שלב טיהור ה-GST מראה שחלק גדול מ-REC 14 hiss קשור לחרוזי talon.

לאחר מספר שטיפות, REC 14 hiss הופרש ונאסף, ובוצעו שלוש אלוציות. הניתוח חשף רמה גבוהה של טוהר של rec 14 hiss ואת הריכוז הגבוה ביותר של rec 14 hiss באלוציה הראשונה; השוואה של הפראקציות שהופרשו ל-talon beads לאחר האלוציה ממחישה את יעילות התהליך, שכן כמות מזערית של rec 14 hiss זוהתה כקשורה לחרוזים.

דגימות אלו הועברו גם לאנליזת Western blot עם נוגדני anti GST ו-anti hiss כדי לעקוב אחר REC 14. לאורך הפרוצדורה, ה-blot של anti GST מראה כי חלק מה-GS TRE 14 ו-GST לבדו היו נוכחים בחלבונים המוזכרים משלב טיהור ה-GST, וכי מזהמים הוסרו באמצעות שלב טיהור ה-affinity של ה-hiss tag. blot זה חושף כי ה-GST הוסר ביעילות מ-re 14 על ידי הטיפול המדויק ושלב טיהור ה-hiss ttag.

תכלית ה-anti hiss blot היא לזהות את re 14. blot זה מאשר כי GST Rec 14 hiss ו-REC 14 hiss לא עברו פירוק מלא ולא הוסרו לחלוטין מחרוזי ה-GST. יתרה מכך, נראה כי בריכוז גבוה REC 14 נוטה להצטבר (aggregate).

לסיכום, התוצאות המוצגות מדגימות את יעילותם של טיהורי GST ו-His לטיהור של S palm B rec 14. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק חלבון רקומביננטי בדרגת טוהר גבוהה, ברגע שהשיטה תשלט.

ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 12 שעות לאחר דגנרציה של ly acid מסיס, במידה שהיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבוד במהירות ובאופן קפדני בטמפרטורה של 4 °C כדי למנוע דגנרציה של חלבונים בעקבות הפעולה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות co-precipitation או ספקטרומטריה של מסות, כדי להשיב על שאלות נוספות, כגון זיהוי שותפים חלבוניים או מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות של החלבון הנחקר.

למרות שביצענו שימוש בשיטה זו עבור חלבוני תיקון DNA, ניתן להתאים את האסטרטגיה כדי לחקור תפקוד של חלבונים בתחומי מחקר אחרים.